UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
HENRIQUE CARACHO RIBEIRO
AVALIAÇÃO DO PERFIL LIPÍDICO EM AMOSTRAS DE
SORO SANGUÍNEO DE PORTADORES DO TRANSTORNO
BIPOLAR USANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
CAMPINAS 2017
AVALIAÇÃO DO PERFIL LIPÍDICO EM AMOSTRAS DE SORO SANGUÍNEO DE PORTADORES DO TRANSTORNO BIPOLAR USANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Analítica
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Sussulini
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO HENRIQUE CARACHO RIBEIRO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ALESSANDRA SUSSULINI.
CAMPINAS 2017
Profa. Dra. Alessandra Sussulini (Orientadora)
Dr. Marcos Yukio Yoshinaga (IQ-USP)
Prof. Dr. Fabio Augusto (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno HENRIQUE CARACHO RIBEIRO, aprovada pela Comissão Julgadora em 25 de julho de 2017.
“O sucesso não é o final, o fracasso não é fatal: é a coragem para continuar que conta.”
Agradeço primeiramente à minha família, minha mãe, Maria Helena, e meu pai, José, pela confiança depositada em mim ao longo de todos estes anos na qual estive em Campinas. Pelas conversas regadas à café ou a cerveja, e até pelas discussões, que sempre me adicionaram algo, seja no assunto que for.
Ao meu irmão, Gabriel, pelo companheirismo, pelas tardes jogando conversa fora, seja tomando uma cerveja no quarto ou conversando em algum lugar e por estar disponível para qualquer coisa que eu precisasse, independente do que.
À minha irmã, Erika, pelas infinitas conversas sobre a academia, projetos, e diversas coisas mais; e principalmente, por ser um exemplo de profissional, na qual me espelho desde sempre.
Aos meus amigos da turma de 2009 da Química: ao Rafael Scucuglia por estar sempre junto nessa caminhada desde 2009; à Marina pela ajuda em qualquer coisa que estivesse ao alcance, em especial na pós-graduação, pelas diversas conversas dos mais variados assuntos, nos mais variados lugares; à Julia pela ajuda e pela hospitalidade nas diversas vezes e diversas situações.
À todos os meus amigos do IQ, veteranos ou não: Guilherme, Ivo, Murilo, Jaqueline; pelas diversas horas de conversas, risadas, relatórios, seja tomando um café na cantina, ou uma cerveja em algum lugar.
Ao meu grande amigo Rafael de Santi, pelo imenso companheirismo que tivemos desde 2009, pelos conselhos, conversas, noites mal dormidas devido à graduação, e por ser praticamente um segundo irmão para mim, estando sempre presente em praticamente todos os melhores momentos que passei aqui em Campinas, e também por alguns (vários) momentos ruins, estando sempre disposto a ajudar, não importa no que fosse a situação.
A todos da República do Patrão pelo companheirismo, discussões, festas, churrascos, por estarem sempre juntos independente da situação, e por serem praticamente uma segunda família para mim.
À todos os colegas do laboratório: Matheus, Carlos, Fernando, Cléo, Pablo e Raphael; e em especial à Aline, Elisa e Donizete, por sempre estarem dispostos a ajudar; pelos infinitos cafés no laboratório, sempre com direito às mais variadas conversas.
À professora Alexandra Sawaya pela participação na banca de qualificação e pela contribuição dada à este trabalho.
À banca examinadora pela disponibilidade em comparecer e assim contriubuir para melhorarmos ainda mais o trabalho apresentado.
Ao Prof. Dr. Marcos Eberlin e ao Prof. Dr. Marco Zezzi por disponibilizarem o laboratório para as nossas análises e à Profa. Dra. Elisa Brietzke por disponibilizar as amostras utilizadas neste trabalho.
À Capes pela bolsa de mestrado concedida, e à FAEPEX e FAPESP pelo auxílio financeiro.
E claro, à minha orientadora, Profa. Dra. Alessandra Sussulini, por ter acreditado em mim desde o começo e assim depositado uma confiança imensa em mim, abrindo as portas para que eu pudesse trabalhar com a área da Química que eu mais me identifiquei durante a graduação, que foi a espectromeria de massas; pelas infinitas conversas, que normalmente começavam com alguma coisa a ver com o projeto, e terminavam nos mais variados assuntos: Área acadêmica, ética, projetos futuros, e as vezes chegando até em bandas e shows de rock; e principalmente por ter uma paciência imensa para aguentar o meu nervosismo e minha impaciência, e na maioria das vezes colocar meus pés no chão nos momentos necessários.
O transtorno bipolar é uma doença psiquiátrica com predominância relativamente alta na população mundial adulta (cerca de 4%, independente de raça ou gênero) e é caracterizada pela presença de episódios de depressão alternados com episódios de mania, hipomania e estados mistos. Até os dias atuais, o diagnóstico e o tratamento do transtorno bipolar continuam sendo um desafio para a comunidade médica, pois suas bases moleculares ainda não foram completamente elucidadas. Na literatura, é apontado que o metabolismo de lipídios sofre alterações em decorrência desta doença. Assim sendo, o principal objetivo desta Dissertação consiste na análise lipidômica de amostras de soro sanguíneo de pacientes com transtorno bipolar, em comparação com indivíduos saudáveis, utilizando UHPLC-ESI-QTOF MS. Trinta e cinco indivíduos de ambos os gêneros participaram da pesquisa e, entre eles, 14 eram pacientes diagnosticados com transtorno bipolar tipo I (grupo bipolar) e 21 eram indivíduos saudáveis (grupo controle). Os dados obtidos foram refinados utilizando análise estatística univariada e multivariada, juntamente com plataformas bioinformáticas (XCMS, SIMCA e MetaboAnalyst), onde 121 lipídios foram significantes para a diferenciação entre o grupo controle e o grupo bipolar no modo de ionização por electrospray negativo e 86 no modo positivo. Após o tratamento estatístico dos dados, o perfil lipídico dos grupos foi comparado e caracterizado putativamente utilizando os bancos de dados disponíveis para lipídios e/ou metabólitos (LIPID MAPS, HMDB e METLIN). Observou-se que os glicerofosfolipídios foram os lipídios mais alterados nos pacientes bipolares, especialmente os fosfatidilinositóis, o que corrobora com resultados obtidos por outros grupos de pesquisa, reforçando, portanto, a importância do estudo das abnormalidades no metabolismo de lipídios de pacientes com transtorno bipolar.
Bipolar disorder is a psychiatric disorder with a relatively high predominance in adult world population (about 4%, independently of race and gender), and it is characterized by the presence of episodes of depression alternating with episodes of mania, hypomania and mixed states. Despite being a well-known disorder, its diagnosis remains a challenge for the clinical practice, as its molecular bases are not completely elucidated yet. In the literature, it is proposed that the lipid metabolism is altered due to this disorder. Therefore, the main objective of this study consists in performing lipidomic analyses of blood serum samples from bipolar disorder patients, in comparison with healthy subjects, using UHPLC-ESI-QTOF MS. Thirty-five individuals from both genders were recruited for this research and, among them, 14 were diagnosed and treated as type I bipolar disorder patients (BD group) and 21 were healthy subjects (HC group). The obtained data were refined using univariate and multivariate statistical analyses, together with bioinformatic platforms (XCMS, SIMCA and MetaboAnalyst), where 121 lipids were significant for the differentiation between the BD group and the HC group using electrospray ionization negative mode and 86 differential lipids were pointed out in the positive mode. After the statistical data analysis, the lipid profiles from both groups were compared and putatively identified using online lipid and/or metabolite databases (LIPID MAPS, HMDB and METLIN). Glycerophospholipids were the most altered lipids in the BD group, especially phosphatidylinositols, which corroborates with the results obtained by other research groups, reinforcing the importance of studying lipid metabolism abnormalities in bipolar disorder patients.
i Lista de Figuras
Figura 1. A “cascata ômica” e a descrição de um sistema biológico [9]. ... 17 Figura 2. As diferentes classes de lipídios e suas estruturas exemplificadas (adaptado da referência [16]). ... 20 Figura 3. Representação esquemática de um espectrômetro de massas (adaptado da referência [28]). ... 23 Figura 4. Esquema instrumental básico de um equipamento QTOF [41]. ... 25 Figura 5. Diagrama exemplificando a diferença entre os diferentes tipos de transtorno bipolar (I e II) e o transtorno depressivo. Em 1, tem-se o diagnóstico precoce, que pode prever que o paciente terá algum dos dois transtornos. Em 2, tem-se a fase diagnóstica diferencial, onde o transtorno bipolar e a depressão se diferenciam. Em 3, tem-se a resposta prevista do tratamento, onde os pacientes que respondem ou não ao tratamento são identificados, sendo assim rediagnosticados caso o tratamento seja eficaz (adaptado da referência [49]). ... 27 Figura 6. Fluxograma das diferentes metodologias de extração avaliadas. ... 32 Figura 7. Comparação por heatmaps (MetaboAnalyst) da abundância de cada íon de um pool de soro extraído utilizando as metodologias Bligh & Dyer (▬), Folch (▬) e MTBE (▬) em modo ESI negativo utilizando a coluna Titan C18 (10 cm x 21 mm; 1,9 μm). ... 37 Figura 8. Cromatogramas de pico base de íons totais obtidos no modo ESI negativo para os métodos de extração: MTBE (a), Folch (b) e Bligh & Dyer (c). ... 38 Figura 9. Comparação por heatmaps (MetaboAnalyst) da abundância de cada íon de um pool de soro extraído utilizando as metodologias Bligh & Dyer (▬), Folch (▬) e MTBE (▬) em modo ESI positivo utilizando a coluna Titan C18 (10 cm x 21 mm; 1,9 μm). ... 39 Figura 10. Cromatogramas de íons totais obtidos no modo positivo para os métodos de extração: MTBE (a), Folch (b) e Bligh & Dyer (c). ... 40 Figura 11. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (em azul), controle (em vermelho) e QC (em verde), para o modo ESI negativo. ... 41 Figura 12. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (em amarelo), controle (em verde) e QC (em branco), para o modo ESI positivo. ... 42 Figura 13. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (círculos escuros) e controle (círculos claros), para as análises em modo ESI negativo. ... 43 Figura 14. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (círculos verdes) e controle (círculos escuros), para as análises em modo ESI positivo. ... 43 Figura 15. Score plot da análise por PLS-DA para as amostras controle (em azul) e bipolar (em verde), obtidas em modo ESI negativo. ... 44 Figura 16. Score plot da análise PLS-DA para as amostras controle (círculos verdes) e bipolar (círculos escuros), obtidas em modo ESI positivo. ... 44 Figura 17. Gráfico da validação do modelo PLS-DA pelo teste de permutação (20 permutações) de R2 (●) e Q2 (■) para as análises obtidas em modo ESI negativo. ... 45 Figura 18. Gráfico da validação do modelo PLS-DA pelo teste de permutação (20 permutações) de R2 (●) e Q2 (■) para as análises obtidas em modo ESI positivo... 46 Figura 19. Score plot da análise por OPLS-DA para as amostras controle (círculos verdes) e bipolar (círculos escuros), obtidas em modo ESI positivo. ... 47 Figura 20. Gráfico de loadings do modelo PLS-DA utilizado para encontrar os
features diferenciais entre os grupos bipolar e controle, para o modo ESI negativo. ... 49
Figura 21. Gráfico S-plot do modelo OPLS-DA utilizado para encontrar os features diferenciais entre os grupos bipolar e controle, para o modo ESI positivo. ... 49 Figura 22. Classes de lipídios do grupo controle obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI negativo. ... 50
LIPID MAPS no modo ESI positivo. ... 51 Figura 25. Classes de lipídios do grupo bipolar obtidas usando o banco de dados do LIPID MAPS no modo ESI positivo. ... 51 Figura 26. Pathway do metabolismo de glicerofosfolipídios [92]. ... 82 Figura 27. Curvas ROC para os lipídios de m/z 951,6 (a), 1175,8 (b), 762,4 (c), 473,2 (d), 789,5 (e) e 915,6 (f). ... 84
Figura 27 (cont.). Curvas ROC para os lipídios de m/z 856,6 (g), 871,6 (h), 753,4 (i) e 807,6 (j)...85 Figura 28. Curvas ROC para os lipídios de m/z 621,3 (a) e 813,7 (b)... 85 Figura 28 (cont). Curvas ROC para os lipídios de m/z 971,6 (c), 970,6 (d), 987,7 (e), 224,1 (f), 459,3 (g), 806,6 (h), 890,5 (i) e 1216,8 (j)...86
controles saudáveis; TB: Pacientes com transtorno bipolar; a Teste t de Student, b Pearson Chi-Quadrado, c Teste de Levene) ... 31 Tabela 2. CV-ANOVA para o modelo PLS-DA utilizando duas componentes para as análises realizadas em modo ESI negativo ... 30 Tabela 3. CV-ANOVA para o modelo PLS-DA utilizando duas componentes para as análises realizadas em modo ESI positivo ... 31 Tabela 4. Identificação dos molecular features aumentados nas amostras controle no modo ESI negativo ... 54 Tabela 5. Identificação dos molecular features aumentados nas amostras de pacientes bipolares no modo ESI negativo ... 59 Tabela 6. Identificação dos molecular features aumentados nas amostras controle no modo ESI positivo ... 50 Tabela 7. Identificação dos molecular features aumentados nas amostras de pacientes bipolares no modo ESI positivo ... 57 Tabela 8. Identificação putativa para os 5 features mais alterados em cada grupo e seus valores de AUC ... 83
APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ionização química à
pressão atmosférica)
APPI Atmospheric pressure photoionization (Fotoionização à pressão
atmosférica)
AUC Area under curve (Área sob a curva)
CDP-DG Cytidine Diphosphate Diacylglycerol (Citidinadifosfatodiacilglicerol)
CE Cholesterolesters
Cer Ceramide
CS Controles saudáveis CV Coeficiente de variação
CV-ANOVA Analysis of variance of cross-validated predictive residuals DESI Desorption electrospray ionization (Ionização de dessorção por
eletrospray)
DG Diacylglycerol
DSM-V Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition
(Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, Quinta Edição)
ESI Electrospray ionization (Ionização por eletrospray)
FA Fatty acyls
FT-ICR MS Fourier transform ion cyclotron ressonance (Espectrometria de massas de ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier)
GAF Global assessment of functioning (Avaliação global de
funcionamento) HDoHE Docosanoidacids
HDRS-17 Hamilton Depression Rating Scale (Escala Classificatória de
Depressão de Hamilton)
HETE Hydroxy/hydroperoxyeicosatetraenoic acids HexCer Hexosylceramide
HILIC Hydrophilic interaction liquid chromatography (Cromatografia líquida
de interação hidrofílica)
HMDB Human Metabolome Database (Banco de Dados de Metaboloma
Humano)
HPLC High performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de
alta eficiência)
ILCNC International Lipids Classification and Nomenclature Committee
(Comitê Internacional de Classificação e Nomenclatura de Lipídios) iPaOH Isopropanol LacCer Lactosylceramide LPA Lysoglycerophosphates LPE,LysoPE Lysophosphatidylethanolamines LPG Lysophosphatidylglycerols LPI Lysophosphatidylinositols LPIP Lysoglycerophosphoinositolmonophosphates m/z Relação massa/carga
MG Monoacylglycerol
MGDG Monogalactosyldiacylglycerol
MIPC Mannosyl-inositol-phosphorylceramide
MS Mass spectrometry (Espectrometria de massas)
MS/MS Tandem mass spectrometry (Espectrometria de massas sequencial)
MTBE Methyl-tert-buthyl ether
PA Monoacylglycerophosphates
PC Phosphatidylcholine
PC1 Principal component 1 (Componente principal 1)
PC2 Principal component 2 (Componente principal 2)
PC3 Principal component 3 (Componente principal 3)
PCA Principal component analysis (Análise de componentes principais)
PE-Cer Ceramidephosphoethanolamines PE-NMe2 Diacylglycerophosphoethanolamines PG Phosphatidylglycerol PGP Glycerophosphoglycerophosphates PI Phosphatidylinositols PIP Glycerophosphoinositolmonophosphates
PLS-DA Projection to latent structures discriminant analysis (Análise
discriminante por projeção a estruturas latentes)
PS Phosphatidylserine
QC Quality control sample (Amostra de controle de qualidade)
QIT Quadrupole-ion trap (Quadrupolo-armadilha de íons) QTOF Quadrupole-time of flight (Quadrupolo- tempo de vôo)
NMR Nuclear magnetic ressonance (Ressonância magnética nuclear)
ROC Receiver operator characteristics (Caracterização de operação de
receptor)
S/N Signal/Noise (Razão sinal/ruído)
SCID Structured Clinical Interview for DSM-5 (Entrevista Clinica
Estruturada para DSM-5)
SD Desvio padrão
SM Sphingomyelin
TB Pacientes com transtorno bipolar
TG Triacylglycerol
THF Tetrahidrofurano
TIC Total ion chromatogram (Cromatograma de íons totais)
UHPLC Ultra high performance liquid chromatography (Cromatografia
líquida de ultra alta eficiência)
VIP Variable importance in projection (Importância da váriavel na
projeção)
WE Wax esters
YMRS Young Mania Rating Scale (Escala Classificatória de Mania de
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1. Lipidômica... 17
1.2. Espectrometria de massas, cromatografia líquida e suas aplicações em lipidômica ... 23 1.3. Transtorno bipolar ... 26 2. OBJETIVOS ... 29 2.1. Objetivos gerais ... 29 2.2. Objetivos específicos ... 29 3. PARTE EXPERIMENTAL ... 30 3.1. Pacientes e amostragem ... 30
3.2. Extração de lipídios e cromatografia liquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas ... 32
3.2.1. Otimização do método de extração de lipídios ... 32
3.2.2. Extração Bligh & Dyer ... 32
3.2.3. Condições de corrida - UHPLC ... 33
3.2.4. Condições de operação do triplo quadrupolo – Metodologias de extração ...33
3.2.5. Condições de operação do QTOF – Análises dos QCs e amostras ... 33
3.2.6. Análise dos QCs e amostras ... 34
3.3. Análise estatística ... 34
3.3.1. Pré-tratamento ... 34
3.3.2. PCA, PLS-DA e OPLS-DA ... 35
3.4. Identificação das classes de lipídios ... 35
3.5. Identificação dos lipídios usando bancos de dados ... 36
3.6. Testes ROC ... 36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 37
4.1. Otimização do método de extração e análise cromatográfica ... 37
4.2. Análise Estatística ... 41
4.2.1. Análise e avaliação dos QCs ... 41
4.2.2. Análise multivariada das amostras dos indivíduos controle vs pacientes bipolares... 42
4.3. Análise dos lipídios diferenciais ... 48
6. REFERÊNCIAS ... 89 Anexos ... 99
1.
INTRODUÇÃO1.1. Lipidômica
Com o passar dos anos, na era pós-genômica, procurou-se cada vez mais tentar correlacionar o genótipo com o fenótipo de células e organismos [1]. A partir desta motivação, desenvolveram-se estratégias analíticas visando se aproximar do fenótipo, como é o caso da transcriptômica [2] e da proteômica [3]. No último nível das “ciências ômicas”, ou seja, aquele mais próximo ao fenótipo, encontra-se a metabolômica [4], que foi inicialmente descrita como sendo a análise global dos metabólitos de um sistema biológico [5], incluindo o estudo da estrutura e função dos mesmos, bem como a sua identificação e quantificação [6–8]. Esta “cascata ômica” é ilustrada na Figura 1. Atualmente, surgiram novas terminologias para definir os estudos metabolômicos, sendo que o perfil metabólico pode ser considerado como a análise de um pequeno grupo de metabólitos pré-determinados, tendo como objetivo a investigação de caminhos metabólicos específicos, onde neste trabalho os caminhos metabólicos estudados serão os relacionados à classe dos lipídios [9].
[9]
Dentre o estudo das diversas classes de moléculas que podem ser produzidas como metabólitos, destacam-se os lipídios, sendo que a identificação e/ou quantificação de um conjunto de lipídios produzidos em um sistema biológico é definida como lipidômica [10]. Atualmente, essa definição entrou em desuso, e o termo lipidômica agora é usado para descrever e identificar alterações nos níveis de lipídios em células e fluidos corporais e, assim, revelar distúrbios ambientais, processos ligados a alguma patologia ou respostas a tratamentos médicos [9]. A lipidômica pode ser considerada a principal área da metabolômica, especialmente pelo fato de que os lipídios constituem o maior subconjunto de moléculas encontradas no metaboloma, sendo que existem dezenas de milhares de moléculas de lipídios diferentes [8].
Por se tratar de uma subárea da metabolômica, os estudos lipidômicos podem ser realizados de duas maneiras distintas: targeted e untargeted, onde cada abordagem possui suas vantagens e desvantagens.
Em uma abordagem untargeted, não é necessária uma hipótese específica em relação a um lipídio ou a uma classe de lipídios [11], assim, procura-se obter a maior quantidade de informação para a maior quantidade de lipídios possível dentro de um sistema biológico [12]. Nesta abordagem, a informação obtida é tratada na forma de “features” em uma matriz de dados contendo a informação espectral por cada amostra [11, 12]. Em espectrometria de massas, estes dados são expressos na matriz de dados de uma forma única para cada feature, em coordenadas na forma de relação massa/carga (m/z), tempo de retenção (especialmente ao se utilizar técnicas de separação, como cromatografia líquida, cromatografia gasosa ou eletroforese capilar acopladas ao espectrômetro de massas) e amplitude do sinal, que são alinhadas dentre todas as amostras [11–13]. Consequentemente, a quantidade de informação gerada por meio desta abordagem é muito grande, sendo necessário o uso de ferramentas bioinformáticas e quimiométricas para reduzir os extensos conjuntos de dados obtidos, para que a interpretação dos dados seja facilitada [11, 14].
No caso da abordagem targeted, é necessária uma hipótese que norteie a análise de uma determinada classe de lipídios ou de um lipídio específico [11], onde
o foco é a medição quantitativa ou semi-quantitativa de tais classes ou lipídios, sendo necessário diferenciar o analito de interesse de outros compostos que podem interferir na análise, que pode ser feito por meio do deslocamento químico (análises via ressonância magnética nuclear), m/z (análises via espectrometria de massas) e também o tempo de retenção ou migração (no caso de técnicas de separação, como cromatografia e eletroforese capilar), onde a combinação do tempo de retenção/migração é normalmente utilizada em conjunto com a m/z ou com o deslocamento químico para caracterizar o composto de interesse [14, 15]. Sendo assim, a lipidômica também pode ser considerada uma estratégia targeted, já que utiliza estudos anteriores para analisar uma classe específica de metabólitos (lipídios, no caso) [9]. Ao contrário da genômica e proteômica, que lidam com combinações muito mais simples (4 ácidos nucléicos e 20 aminoácidos), a lipidômica possui estruturas muito mais complexas, devido às diversas transformações que ocorrem durante a biossíntese dos lipídios [16]. Assim, necessitam-se tecnologias que permitam a caracterização destas moléculas, onde podemos citar o uso da ressonância magnética nuclear (NMR) e a espectrometria de massas (MS), sendo que a espectrometria de massas se destaca pelo fácil acoplamento com técnicas de separação, como cromatografia (líquida e gasosa) e a eletroforese capilar, além do fato das técnicas que utilizam espectrometria de massas serem mais sensíveis e seletivas e apresentarem alto desempenho e cobertura ampla de detecção de compostos [17].
Com base nas definições feitas pelo Comitê Internacional de Classificação e Nomenclatura de Lipídios (ILCNC, em inglês), pode-se classificar os lipídios em 8 diferentes classes: Acil graxos, Glicerolipídios, Glicerofosfolipídios, Esfingolipídios, Lipídios Esteróides, Lipídios Prenóis, Sacarolipídios e Policetídios [18], como é exemplificado na Figura 2.
Os estudos lipidômicos podem ser realizados utilizando duas abordagens diferentes: a primeira se utiliza da hifenação da espectrometria de massas com técnicas cromatográficas e emprega técnicas de extração para a separação das classes de lipídios, com a otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas para certas classes de lipídios; enquanto que na segunda abordagem, omite-se a separação cromatográfica, infundindo todos os íons de uma vez no espectrômetro de massas e analisando todas as classes juntas (chamado também de “lipidômica
shotgun”), usando diferentes aditivos em diferentes modos de ionização (positivo e
negativo), para tentar favorecer a ionização de algumas classes específicas de lipídios [8].
Apesar de suas diversas aplicações, as estratégias lipidômicas também possuem seus percalços. Sendo um tipo de estratégia metabolômica, os cuidados com a estocagem da amostra devem ser seguidos à risca, caso contrário, pode haver a degradação dos lipídios, resultando em uma análise que não condiz com o teor real destes na amostra, sendo que o nível de alguns lipídios, como
Figura 2. As diferentes classes de lipídios e suas estruturas exemplificadas (adaptado da referência [16]).
lisofosfatidilcolinas e ácido lisofosfatídico, podem aumentar em detrimento da redução de outros glicerofosfolipídios, devido à sua degradação [19, 20]. As amostras também não podem sofrer ciclos contínuos de congelamento e descongelamento, onde foi verificado na literatura que o número máximo de ciclos que podem ser feitos sem que haja degradação na amostra é de 3 ciclos [20]. É preciso também um cuidado extra no preparo de amostras, que deve ser realizado rapidamente, para evitar que haja degradação (especialmente devido às metodologias de extração serem realizadas em temperatura ambiente), e assim evitar que os metabólitos encontrados na análise não sejam artefatos produzidos devido ao preparo de amostras [19].
Quando citamos os principais desafios da descoberta de biomarcadores via lipidômica untargeted, o principal deles continua sendo ainda a identificação dos compostos via MS/MS, onde o caminho para ir do feature classificado como diferencial até a sua identificação final, com uma relevância biológica, ainda é majoritariamente feito manualmente. Apesar de existirem softwares que realizam o processamento dos dados utilizando bancos de dados de espectros in silico e experimentais de uma forma automatizada, estes ainda estão em desenvolvimento, quando comparamos com as formas de identificação utilizadas em outras estratégias ômicas, como a proteômica, a genômica e a transciptômica [19].
Apesar de todas as limitações intrísecas, as estratégias lipidômicas vem sendo utilizadas na descoberta de biomarcadores em doenças psiquiátricas. Em 2015, Sethi e colaboradores [21] reuniram as principais descobertas feitas até o momento de abordagens lipidômicas a despeito de 3 doenças psiquiátricas: transtorno bipolar, esquizofrenia e depressão. Tratando-se dos trabalhos relacionados ao transtorno bipolar descritos nesta revisão, observa-se que os resultados circundam ao redor dos glicerofosfolipídios (em especial as fosfatidilcolinas) e ácidos graxos, enquanto nos trabalhos relacionados à esquizofrenia os resultados obtidos citam alterações nos glicerofosfolipídios, triacilgliceróis e ácidos graxos. Nos trabalhos relacionados à depressão analisados nesta revisão, observou-se uma tendência de resultados relacionados a alterações majoritariamente nos ácidos graxos, com menções aos glicerofosfolipídios e também ao colesterol.
Realizando uma nova busca bibliográfica na literatura a partir de 2015, encontramos novos trabalhos relacionados ao transtorno bipolar, à esquizofrenia e ao transtorno depressivo.
No que diz respeito aos trabalhos recentes de lipidômica envolvendo trantstorno bipolar, Knowles e colaboradores [22] correlacionaram alterações nos níveis de fosfatidilinositóis como uma possível classe de biomarcadores para a doença. Tratando-se de esquizofrenia, Wood e colaboradores [23], detectaram uma queda entre 23 e 45% nos níveis de fosfatidilcolinas e etanolaminas nos pacientes com esquizofrenia e um decréscimo de cerca de 30% nos níveis de ácido docosahexanóico (DHA) nos pacientes esquizofrênicos. Em um outro trabalho, Tessier e colaboradores [24] detectaram alterações nos níveis de esfingomielinas e de fosfatidilcolinas/fosfatidiletanolaminas em pacientes esquizofrênicos. Nos trabalhos recentes de lipidômica aplicados à depressão, Hennebelle et al [25] sugere que há flutuações nos níveis de oxilipinas e de metabólitos ômega-3 e ômega-6 de oxilipinas de cadeia longa nos pacientes com depressão. Liu e colaboradores [26] descreveram em seu trabalho um aumento nos níveis de lisoglicerofosfolipídios, glicerofosfolipídios, glicerolipídios e esfingomielina nos pacientes com depressão. Em um diferente trabalho do grupo de Knowles [27], é citada a etiologia entre pacientes com depressão e espécies de ésteres de fosfatidilcolinas contendo ácido araquidônico, mostrando a relevância desta via metabólica na correlação entre a doença e um possível biomarcador.
1.2. Espectrometria de massas, cromatografia líquida e suas aplicações em lipidômica
Um espectrômetro de massas possui quatro partes principais, composto por um sistema de injeção de amostra, que pode ser feita diretamente no sistema (infusão direta), ou por meio do acoplamento com técnicas de separação, como cromatografia e eletroforese capilar; uma fonte de ionização, seguido por um analisador de massas e um detector. Uma representação esquemática de um espectrômetro de massas é mostrada na Figura 3 [28].
Dentro do sistema do espectrômetro de massas, sem sombra de dúvidas, a etapa mais importante acontece na fonte de ionização, que é responsável por converter os analitos de interesse em íons em fase gasosa [29]. Dentre as diversas fontes de ionização utilizadas, pode-se citar a ionização por eletrospray (ESI) [30], a APCI [31], a APPI [32], a MALDI [33] e a DESI [34] como as técnicas mais utilizadas para estudos lipidômicos, sendo as duas últimas muito utilizadas para fins de imageamento. Tanto na lipidômica, assim como em outras áreas da metabolômica, o número e as classes de compostos possíveis de serem detectados são vastos. Assim, recomenda-se que as análises sejam efetuadas em modo de ionização positivo e negativo, para que se tenha uma abrangência maior em relação à identificação de biomoléculas. Em se tratando de análises com a intenção de identificação, a ionização por eletrospray é a mais utilizada, por ser uma técnica de ionização suave (que não produz extensa fragmentação, gerando na sua maioria íons intactos) [30].
Figura 3. Representação esquemática de um espectrômetro de massas (adaptado da referência [28]).
Nesta Dissertação, foi empregada a ESI. Este tipo de ionização consiste na passagem dos analitos através de um capilar pequeno (com diâmetro interno menor que 250 µm), onde é aplicada uma diferença de potencial relativa a um contra-eletrodo (entre 500 e 4500 V). A solução contendo o solvente e os analitos é transformada em um aerossol com gotículas altamente carregadas (positivamente ou negativamente, dependendo da polaridade escolhida pelo operador), onde estas são direcionadas para o analisador de massas com a ajuda de um gás que flui coaxialmente com o capilar de injeção de amostra (chamado de sheath gas). As gotículas com a mistura solvente-analito passam por uma etapa de secagem do solvente, sofrendo uma fissão coulômbica em seguida, que libera os íons carregados para o analisador do espectrômetro de massas [20, 26].
Após a fonte de ionização, está localizado o analisador de massas, que é responsável por separar os íons das amostras produzidos na primeira etapa. Entre os diversos tipos de analisadores de massas, pode-se citar como sendo os mais utilizados para análises lipidômicas os analisadores de alta resolução, como o FT-ICR MS [36] e o Orbitrap [37], que são úteis por fornecerem resultados com alta exatidão de massa, e os analisadores híbridos, como o QTOF [38] e o QIT [28]. Todos estes diferentes analisadores podem realizar experimentos de espectrometria de massas em sequência (MS/MS), que são extremamente úteis para fins de identificação, sendo possível a seleção de íons precursores e sua posterior fragmentação, para que se obtenha o perfil de fragmentação dos analitos, auxiliando ainda mais na identificação dos compostos.
Neste trabalho, utilizou-se um analisador híbrido, o QTOF, para a realização das análises, que é composto de um quadrupolo juntamente com uma célula de colisão do tipo hexapolo ou octapolo, seguido por um segundo analisador de massas por tempo de vôo, que fornece alta resolução juntamente com informação estrutural [39], favorecendo, assim, análises que necessitam de alta resolução, como experimentos na área de lipidômica. A separação de íons por tempo de vôo parte do princípio de que íons que sofrem uma aceleração causada por um campo elétrico e possuem a mesma energia cinética terão velocidade inversamente proporcional à raiz quadrada de suas m/z, sendo o esquema instrumental de um espectrômetro QTOF mostrado na Figura 4. Grande parte dos experimentos realizados em lipidômica utilizam esse tipo de equipamento, por
combinar a alta resolução com a possibilidade de realizar experimentos de MS/MS [40], juntando em um mesmo instrumento duas características procuradas para este tipo de análise.
[41]
Observa-se também que grande parte dos experimentos em lipidômica utiliza técnicas de separação antes da inserção da amostra no espectrômetro de massas, especialmente técnicas de cromatografia líquida, como HPLC e UHPLC, que permitem a separação dos variados compostos de uma amostra, assim reduzindo efeitos prejudiciais à análise como a detecção de isóbaros e a supressão iônica causada por moléculas competindo pela ionização.
Em se tratando de lipidômica, três abordagens cromatográficas são utilizadas: fase reversa, fase normal e HILIC. A cromatografia em fase reversa baseia-se no uso da lipofilicidade dos lipídios como mecanismo de separação, utilizando-se de suas cadeias carbônicas e de suas duplas ligações. Assim, os lipídios que possuírem cadeias maiores serão eluídos posteriormente aos lipídios com cadeias menores, assim como lipídios com cadeias carbônicas saturadas eluem após os lipídios poli-insaturados. A cromatografia em fase reversa é conhecida por ser a mais utilizada nos estudos lipidômicos [40] e utiliza normalmente colunas do tipo C8 e C18 e fases móveis compostas por misturas de H2O/ACN, H2O/IPaOH, H2O/ACN/MeOH ou H2O/MeOH/THF, juntamente com um aditivo que também
favorece a análise por MS, como acetato ou formiato de amônio (modo negativo) ou ácido fórmico ou acético (modo positivo).
A cromatografia em fase normal e a HILIC, por sua vez, se baseiam na separação pela hidrofilicidade dos compostos, assim, as moléculas são separadas pelas propriedades das suas partes polares. A cromatografia em fase normal aparece como um complemento às análises em fase reversa, visto que o tempo de análise em fase normal para os métodos utilizados em lipidômica é maior devido ao uso de colunas maiores, onde os sorventes apresentam tamanho de partícula maior. A separação em fase normal é indicada para a análise de fosfolipídios, especialmente se a classe desejada na análise for os glicerofosfatos, ou ácidos fosfatídicos (PA), que apresentam picos com formatos inadequados na cromatografia em fase reversa [40]. A HILIC se apresenta também como uma técnica complementar à cromatografia em fase reversa e, diferentemente da cromatografia em fase normal, que utiliza solventes não polares como constituintes da fase móvel, a HILIC se baseia no uso de água como o principal solvente para a análise. Em comparação com a cromatografia em fase normal, a HILIC apresenta melhor reprodutibilidade e melhora na hifenação com técnicas de espectrometria de massas, devido aos solventes utilizados na HILIC, que apresentam maior compatibilidade com os analitos do que os utilizados na cromatografia em fase normal [31, 33].
1.3. Transtorno bipolar
O transtorno bipolar, anteriormente conhecido por „doença maníaco-depressiva‟ [43] é considerado um dos mais graves tipos de transtorno mental, envolvendo aspectos neuroquímicos, psicológicos, cognitivos, funcionais e socioafetivos [44], sendo caracterizado pela recorrência de distúrbios de humor que podem incluir depressão, mania, hipomania e estados mistos [43], variando em intensidade, frequência e duração [45].
O transtorno bipolar pode ser categorizado em tipo I (onde há um ou mais episódios de mania com ou sem episódios depressivos), tipo II (onde há um ou mais episódios de hipomania e pelo menos um episódio depressivo maior) [34, 37] e ciclotímico (episódios hipomaníacos de curta duração e episódios depressivos maiores, episódios hipomaníacos com sintomas insuficientes e episódios
depressivos maiores, episódios hipomaníacos sem um episódio maior depressivo e ciclotimia de curta duração) [34, 37].
O transtorno bipolar é caracterizado por uma desregulação de humor e associado à impulsividade e comportamento de risco (como abuso de álcool, indiscrição sexual e consumismo excessivo). Assim, devido a estes problemas citados, indivíduos com transtorno bipolar apresentam mortalidade elevada por suicídio, causas naturais (problemas cardiovasculares), homicídio e acidentes. Muitos pacientes que apresentam transtorno bipolar procuram tratamento para depressão [47] ou são diagnosticados erroneamente como depressivos unipolares devido à possível manifestação tardia de quadros maníacos ou hipomaníacos [48], levando a um diagnóstico falso, que pode induzir episódios maníacos ou então desestabilizar a doença [47]. A Figura 5 exemplifica essa diferença entre o transtorno afetivo bipolar e o transtorno depressivo maior.
[49]
Nesse âmbito, sabe-se pouco dos mecanismos moleculares que são alterados em pacientes acometidos por doenças psiquiátricas [21], onde métodos
Figura 5. Diagrama exemplificando a diferença entre os diferentes tipos de transtorno bipolar (I e II) e o transtorno depressivo. Em 1, tem-se o diagnóstico precoce, que pode prever que o paciente terá algum dos dois transtornos. Em 2, tem-se a fase diagnóstica diferencial, onde o transtorno bipolar e a depressão se diferenciam. Em 3, tem-se a resposta prevista do tratamento, onde os pacientes que respondem ou não ao tratamento são identificados, sendo assim rediagnosticados caso o tratamento seja eficaz (adaptado da referência [49]).
novos e mais precisos são necessários, sendo que a busca por potenciais biomarcadores que possam não somente auxiliar na medicina diagnóstica, mas também determinar quais são as mudanças na bioquímica desses pacientes consistem em uma área de pesquisa de extrema importância [50]. Na busca por biomarcadores, abordagens metabolômicas são promissoras para diversas doenças psiquiátricas, incluindo o transtorno bipolar [43–45]. Dentro da metabolômica, a lipidômica é a área mais dominante pelo fato dos lipídios constituírem o maior conjunto de moléculas detectadas e presentes no metaboloma [7, 8, 18]. Além disso, o fato dessa classe de biomoléculas ter sido considerada diferencial em trabalhos anteriores com pacientes com transtorno bipolar utilizando NMR [48], faz com que a abordagem lipidômica seja promissora para a prospecção de biomarcadores atualmente.
2.
OBJETIVOS2.1. Objetivos gerais
Esta Dissertação tem como objetivo principal a análise do perfil lipídico presente em amostras de soro sanguíneo de pacientes com transtorno bipolar em relação a indivíduos saudáveis, visando sugerir potenciais biomarcadores para tal doença e, assim, contribuir para o aprimoramento do seu diagnóstico, que ainda é realizado apenas a partir de observações clínicas, bem como para a elucidação de suas bases moleculares.
2.2. Objetivos específicos
Otimização de um método de extração de lipídios para a análise lipidômica untargeted do soro de pacientes com transtorno bipolar e indivíduos saudáveis.
Obtenção dos dados lipidômicos por cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução.
Avaliação da diferença dos perfis lipídicos entre os pacientes com transtorno bipolar em comparação com indivíduos sadios empregando ferramentas estatísticas univariadas e quimiométricas.
3.
PARTE EXPERIMENTAL3.1. Pacientes e amostragem
As amostras de soro sanguíneo foram provenientes de indivíduos saudáveis (grupo controle) e de pacientes com transtorno bipolar, obtidas em colaboração com a Profa. Dra. Elisa Brietzke (Departamento de Psiquiatria, UNIFESP). O projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp (protocolo 053814/2015), onde todos os pacientes assinaram um termo de consentimento antes da coleta das amostras. O parecer referente à aprovação do projeto no comitê de ética se localiza no Anexo 1. Utilizaram-se 35 amostras, onde 21 delas eram de pessoas saudáveis (grupo controle) e 14 delas eram de pacientes com transtorno bipolar do tipo I, de acordo com o questionário DSM-V [46], sendo que estes pacientes se encontravam em estado eutímico, que é definido como a fase onde o paciente apresenta a remissão dos sintomas, ou seja, a fase onde o paciente não apresenta sintomas de mania e de depressão [45] e também onde o paciente apresenta pontuação abaixo de 8 na Escala Classificatória de Mania de Young (YMRS) [54] e na Escala Classificatória de Depressão de Hamilton (HDRS-17) [55]. Os participantes não possuíam nenhuma outra doença concomitante, como AIDS, hepatite, doenças endócrinas ou metabólicas, uso de substâncias (exceto nicotina), gravidez e período pós-parto. Os voluntários do grupo controle foram selecionados dentre a comunidade e, para serem elegíveis para participar, os indivíduos deveriam ter idade entre 18 e 65 anos e histórico negativo de qualquer condição psiquiátrica (atual ou anterior), além de nunca ter feito uso de medicamentos psiquiátricos. Além disso, somente voluntários sem histórico familiar de transtornos mentais maiores (transtornos no espectro da esquizofrenia, transtornos de humor e suicídio) foram incluídos, além dos critérios de exclusão utilizados para os pacientes do grupo bipolar. Para a confirmação do diagnóstico fez-se o teste SCID [56]. onde os testes YMRS e HDRS-17 foram usados para estimar a severidade dos sintomas maníacos e depressivos, respectivamente. A funcionalidade dos pacientes foi estimada pela GAF [57]. Todas as amostras foram coletadas na mesma hora do dia (entre 8 e 10 horas) e todos os indivíduos estavam em jejum. O sangue dos pacientes foi coletado em um tubo Vacutainer, deixado em
temperatura ambiente por 30 minutos e depois colocado em gelo para que se efetuasse a coagulação do sangue. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 3500g por 15 minutos a 4°C. O soro sanguíneo obtido foi então transferido para microtubos e guardado a -80°C para posterior análise.
Os dados clínicos e demográficos dos pacientes são mostrados na Tabela 1. Não se observou nenhuma diferença significativa entre os grupos se tratando de idade, sexo e escolaridade, sugerindo que os grupos são demograficamente comparáveis. Além disso, as pontuações nos testes YMRS e HDRS-17 indicam severidade baixa nos sintomas de variações de humor dentre os pacientes bipolares.
Tabela 1.Dados clínicos e demográficos das amostras (SD: desvio padrão; CS: controles saudáveis; TB: Pacientes com transtorno bipolar; a Teste t de Student, b
Pearson Chi-Quadrado, c Teste de Levene)
Variável TB (n = 14) CS (n = 21) Test-value p-value Idade (anos); média (SD) 46 (9) 34 (13) 2,693a 0,012a
Gênero F/M; n (%) 10/4 (71/29) 14/7 (67/33) 3,836b 0,147b Escolaridade; n (%) ≤10 anos Mais de 10 anos 5 (36) 9 (64) 8 (38) 13 (62) 2,213c 0,149c
Índice de massa corpórea; kg m-2 ;média (SD) 25,4 (4,6) 25,2 (3,6) 0,122a 0,903a YMRS; média (SD) 0,71 (1,68) GAF; média (SD) 80,7 (10,2) HDRS-17 ; média (SD) 4,08 (3,68) Uso de medicação; n (%) Ácido valpróico Biperideno Carbamazepina Clonazepam Clorpromazina Fluoxetina Lítio Quetiapina 1 (7,1) 1 (7,1) 6 (43) 1 (7,1) 1 (7,1) 1 (7,1) 1 (7,1)
3.2. Extração de lipídios e cromatografia liquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
3.2.1. Otimização do método de extração de lipídios
Antes de efetuar a extração dos lipídios das amostras com um determinado método, observou-se a eficiência de três diferentes tipos de extração de lipídios (Bligh & Dyer [58], Folch [59] e MTBE [60]), onde as metodologias são descritas na Figura 6.
3.2.2. Extração Bligh & Dyer
Os lipídios foram extraídos utilizando uma metodologia semelhante a de Bligh & Dyer [58], onde foram misturados 30 µL de soro sanguíneo, 180 µL de MeOH (J.T. Baker, Center Valley, EUA) e 360 µL de CHCl3 (J.T. Baker, Center Valley, EUA) em um microtubo. Após agitação, 120 µL de água Milli-Q, com
resistividade de 18,2 MΩ.
cm, foram adicionados à mistura, que foi em seguida novamente agitada e centrifugada a 8000g por 10 minutos a 10°C. Após a centrifugação, a fase orgânica foi separada e em seguida seca em concentrador centrífugo a vácuo. Após a secagem, a amostra foi ressuspendida em 240 µL da fase móvel A e 160 µL da fase móvel B (descritas no item 3.2.3).
3.2.3. Condições de corrida - UHPLC
As amostras foram analisadas em um cromatógrafo a líquido UHPLC Agilent 1290, com uma corrida de 20 minutos sob uma vazão de 0,3 mL min-1. O volume de injeção foi de 10 µL e a separação foi feita utilizando uma coluna Titan™ C18 (10 cm x 2,1mm, 1,9 µm). A fase móvel utilizada foi composta por uma mistura de ACN: H2O (40:60) com 10 mmol L-1 de acetato de amônio (fase móvel A) e por uma mistura de ACN:IPaOH (10:90) com 10 mmol L-1 de acetato de amônio (fase móvel B). Utilizou-se um gradiente de concentração para a corrida cromatográfica, que consistiu em 40% B por 2 minutos, 50% B por 10 minutos, 70% B por 2 minutos, 100% B por 4 minutos e 40% B por 2 minutos.
3.2.4. Condições de operação do triplo quadrupolo – Metodologias de extração
Nos testes de avaliação das diferentes metodologias de extração, utilizou-se um equipamento UPLC TQDAcquity (Waters), no modo fast switching polarity (ESI positivo e negativo), onde a voltagem do capilar foi ajustada em 3,5 kV, a voltagem do cone em 30 V, a voltagem do extrator em 1 V, a temperatura da fonte em 150 °C e a temperatura de dessolvatação em 500 °C. A vazão do cone gas foi de 10 L h-1, a do gás de dessolvatação foi de 500 L h-1 e a do gás de colisão foi de 0,14 mL min-1.
3.2.5. Condições de operação do QTOF – Análises dos QCs e amostras A análise via espectrometria de massas foi feita em um equipamento QTOF Agilent 6550 nos modos ESI positivo e negativo. A voltagem do VCap foi
estabelecida em 4 kV, a temperatura do gás em 290 °C, a vazão do gás de secagem em 11 L min-1 e a pressão do nebulizador em 45 psi. O fragmentador foi ajustado em 175 V e a voltagem do cone skimmer em 320 V. Utilizou-se como calibrantes para o sistema os íons de m/z 121,0508 e m/z 922,0097 para o modo positivo e os íons de
m/z 112,9856 e de m/z 966,0007 para o modo negativo. Utilizou-se como faixa de
massas uma m/z de 50-1700, com a aquisição de 1 espectro s-1 e uma aquisição de 2 espectros s-1 para MS/MS, com largura de isolamento de m/z 1,3 e energia de colisão de 35 eV. A seleção do íon precursor no modo MS/MS foi ajustada para 4 precursores por ciclo, onde estes foram escolhidos pelo modo de abundância.
3.2.6. Análise dos QCs e amostras
Para que fosse possível uma análise em batelada de todas as amostras evitando assim possíveis fontes de variação instrumental, um terceiro grupo de amostras foi analisado, chamado de controle de qualidade (QC), que nada mais é do que um pool de 5 µL de cada uma das amostras. Com este pool, efetuou-se o mesmo procedimento de preparo de amostras descrito anteriormente na seção 3.2.1. Os QCs foram injetados cinco vezes no começo das bateladas, uma vez a cada 5 injeções de amostras e uma vez no fim da batelada. As amostras foram randomizadas, a fim de evitar qualquer tipo de viés estatístico que pudessem influenciar nos resultados obtidos [61].
3.3. Análise estatística
3.3.1. Pré-tratamento
Os cromatogramas de íons totais (TIC) contendo os tempos de retenção,
m/z e intensidades obtidos via UHPLC-MS foram convertidos para o formato mzdata
utilizando o programa MassHunter Qualitative Analysis (Agilent). Em seguida, os dados foram submetidos a um pré-tratamento com a plataforma XCMS (Versão 1.24.1) [62], utilizando o programa R (versão 2.15) para que fosse efetuado o alinhamento não linear no domínio do tempo, integração, extração das intensidades
dos picos presentes, assim como analisar estatisticamente os dados, revelar resultados diferenciais e filtrar picos. Os valores utilizados no XCMS foram os padrões do programa, com exceção da largura das fatias concomitantes das m/z (mzwid = 0,25) e a banda de agrupamento feita após a correção dos tempos de retenção (bw = 10 s). A normalização via mediana foi feita usando um script no próprio programa R [63].
3.3.2. PCA, PLS-DA e OPLS-DA
Após o pré-tratamento, a matriz de dados exportada da plataforma XCMS, contendo os tempos de retenção, m/z e intensidades de cada variável foi ajustada via transformação logarítmica (log10 da altura do pico) e transportada para o programa SIMCA 14 utilizando o escalamento UV para os dados obtidos em modo negativo e Pareto para os dados obtidos em modo positivo, onde os dados foram submetidos à análise exploratória por meio do uso de métodos não supervisionados de análise de componentes principais (PCA) e também um método supervisionado para as análises em modo negativo, análise discriminante por projeção a estruturas latentes (DA),e dois métodos não supervisionados para o modo positivo, PLS-DA e OPLS-PLS-DA (análise discriminante por projeção ortogonal à estruturas latentes), utilizados para determinar os lipídios diferenciais por meio de seus VIP scores e, assim, elucidar possíveis biomarcadores.
3.4. Identificação das classes de lipídios
Após a identificação dos lipídios diferenciais na análise estatística, suas
m/z foram analisadas por meio do banco de dados do LIPID MAPS
(www.lipidmaps.org). A diferença de m/z (teórica e experimental) máxima considerada para esta análise foi de ± 0,05 Da. Os features foram classificados usando o Sistema de Classificação de Lipídios LIPID MAPS, em 8 diferentes categorias (Acil graxos, Glicerolipídios, Glicerofosfolipídios, Esfingolipídios, Lipídios Esteróides, Lipídios Prenóis, Sacarolipídios e Policetídeos) [18], assim, avaliou-se qual classe de lipídios tinha o maior número de matches para cada feature.
3.5. Identificação dos lipídios usando bancos de dados
Após a identificação das classes diferenciais de lipídios entre os grupos controle e bipolar fez-se uma nova busca em três diferentes bancos de dados (LIPID MAPS [18], HMDB [64] e METLIN [65]), para se obter a identificação putativa dos
features selecionados pelo VIP score. Foram selecionados os resultados com o
menor erro de massas, ou seja, a menor diferença entre a m/z teórica e a m/z experimental inserida no banco de dados, onde o erro experimental máximo aceito foi de 10 ppm.
3.6. Testes ROC
Foram feitos também testes ROC com os 15 lipídios mais importantes estatisticamente para garantir que estes possam ser considerados potenciais biomarcadores, onde a área embaixo da curva (AUC) pode ser interpretada como a probabilidade de um teste diagnóstico e/ou um modelo classificatório ranquear uma instância positiva escolhida ao acaso com um valor maior do que uma instância negativa escolhida ao acaso. Caso todas as amostras positivas sejam ranqueadas perante as negativas, pode-se dizer que a classificação foi perfeita, logo, a AUC será igual a 1(melhor valor possível nesse teste). Caso as instâncias sejam classificadas randomicamente tanto como positivas ou negativas, o modelo classificatório não tem nenhuma utilidade prática, logo a AUC será 0,5 (pior valor possível neste teste) [66].
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO4.1. Otimização do método de extração e análise cromatográfica
Com os resultados obtidos por UHPLC-ESI-QqQ MS, avaliou-se a abundância de cada íon em cada diferente extração, utilizando um pool de amostras para tal. Estes dados foram utilizados para montar um gráfico de heatmaps na plataforma MetaboAnalyst [67]. Na Figura 7 é apresentado o heatmap relativo ao modo ESI negativo.
Figura 7. Comparação por heatmaps (MetaboAnalyst) da abundância de cada íon de um pool de soro extraído utilizando as metodologias Bligh & Dyer (▬), Folch (▬) e MTBE (▬) em modo ESI negativo utilizando a coluna Titan C18 (10 cm x 21 mm; 1,9 μm).
Analisando a Figura 7, observa-se que a extração Bligh & Dyer foi a que forneceu a maior abundância dos íons dentre as três diferentes metodologias de extração em praticamente todos os íons do pool de soro utilizado para o modo negativo. Analisando a literatura, observou-se que dentre os métodos de extração de lipídios, a extração utilizando CHCl3, que é a base das extrações Bligh & Dyer e Folch, é a que apresenta a maior eficiência de extração em relação aos diferentes tipos de lipídios [68]. Os cromatogramas de íons totais obtidos utilizando os parâmetros descritos na seção 3.2.3 referentes aos 3 métodos para o modo ESI negativo estão ilustrados nas Figura 8.
(a)
(b)
(c)
Figura 8. Cromatogramas de pico base de íons totais obtidos no modo ESI negativo para os métodos de extração: MTBE (a), Folch (b) e Bligh & Dyer (c).
Já para o modo ESI positivo, observou-se uma tendência diferente nos
heatmaps, onde o método MTBE obteve uma eficácia muito maior do que os outros
dois métodos de extração, como pode ser observado na Figura 9.
Figura 9. Comparação por heatmaps (MetaboAnalyst) da abundância de cada íon de um pool de soro extraído utilizando as metodologias Bligh & Dyer (▬), Folch (▬) e MTBE (▬) em modo ESI positivo utilizando a coluna Titan C18 (10 cm x 21 mm; 1,9 μm).
Para fins de comparação, obtiveram-se também os cromatogramas de íons totais no modo ESI positivo das três metodologias de extração, utilizando as mesmas condições cromatográficas do modo negativo. Os cromatogramas estão ilustrados na Figura 10.
(a)
(b)
(c)
Como no modo ESI (-) é possível identificar uma maior variedade de classes de lipídios no método Bligh & Dyer [58], especialmente lipídios de membrana, como PC, PE, PA, PI, PS e alguns esfingolipídios [69], optou-se por utilizar essa metodologia de extração nos trabalhos subsequentes. Entretanto, como pode-se observar na Figura 9, a metodologia MTBE [60] apresenta melhores resultados no modo ESI (+), onde esta metodologia apresenta um melhor resultado para uma análise geral de lipídios, independente da classe [70], assim, sugere-se que para análises no modo positivo esta metodologia seja utilizada para análises
untargeted, especialmente no modo positivo. Entretanto, como neste estudo havia
uma restrição no volume de amostra, optou-se por trabalhar com um dos métodos de extração para os dois modos de ionização, no caso, o método Bligh & Dyer.
Figura 10. Cromatogramas de íons totais obtidos no modo positivo para os métodos de extração: MTBE (a), Folch (b) e Bligh & Dyer (c).
4.2. Análise Estatística
4.2.1. Análise e avaliação dos QCs
Antes de analisar os dados estatisticamente e, assim, identificar diferenças entre os grupos estudados, bem como possíveis biomarcadores para o transtorno bipolar, a reprodutibilidade dos dados obtidos foi avaliada pelo coeficiente de variação (% CV) de todos os features nas amostras QC e pelo agrupamento destes no score plot da PCA [63, 64], onde obteve-se 15% de variância para 94% dos features. A Figura 11 mostra o score plot da PCA incluindo as amostras QC para as análises em modo ESI negativo, onde a variância explicada é 0,654 (0,356 em PC1, 0,182 em PC2 e 0,116 em PC3). As amostras QC não se localizaram no centro do score plot devido ao número de amostras diferente em cada grupo (21 controles e 14 bipolares). Assim, com os resultados obtidos, foi possível afirmar o alto grau de confiança nos dados, para que as próximas etapas de análise de dados fossem efetuadas [65, 66].
Figura 11. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (em azul), controle (em vermelho) e QC (em verde), para o modo ESI negativo.
No modo ESI positivo, o escalamento Pareto apresentou um melhor agrupamento para os QCs, sendo assim, utilizou-se esse tipo de escalamento para as análises feitas nesse modo. A reprodutibilidade desses dados também foi verificada pela % CV dos features nas amostras QCs, onde obteve-se também 15% de variância para 94% dos features no score plot da PCA. A PCA apresentou variância explicada de 0,697 (0,534 em PC1, de 0,095 em PC2 e 0,0686 em PC3), sendo o score plot apresentado na Figura 12.
4.2.2. Análise multivariada das amostras dos indivíduos controle vs pacientes bipolares
Após a análise dos dados com os QCs, os mesmos foram processados via XCMS e SIMCA sem a presença dos QCs, onde foi possível obter a matriz de dados das amostras e, em seguida, aplicar métodos supervisionados e não supervisionados para a análise das mesmas. As Figuras 13 e 14 mostram as análises das amostras via PCA, em modo negativo e positivo, respectivamente, enquanto que as Figuras 15 e 16 mostram as análises das amostras via PLS-DA, obtidas no modo ESI negativo e positivo, respectivamente.
Figura 12. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (em amarelo), controle (em verde) e QC (em branco), para o modo ESI positivo.
Figura 13. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (círculos escuros) e controle (círculos claros), para as análises em modo ESI negativo.
Figura 14. Score plot da análise por PCA para as amostras de pacientes bipolares (círculos verdes) e controle (círculos escuros), para as análises em modo ESI positivo.
Figura 16. Score plot da análise PLS-DA para as amostras controle (círculos verdes) e bipolar (círculos escuros), obtidas em modo ESI positivo.
Figura 15. Score plot da análise por PLS-DA para as amostras controle (em azul) e bipolar (em verde), obtidas em modo ESI negativo.
A validação do modelo PLS-DA foi feita com 20 permutações para 3 componentes [67, 68], com valores de R2 igual a 0,586 e Q2 igual a -0,31, mostrando que o modelo é válido. Na validação cruzada, observou-se que o modelo PLS-DA é estatisticamente significativo, descrevendo 52,7% da variação em X (R2x=0,527) e 97,6% da variação em Y (R2y=0,976), predizendo 91% (Q2y=0,910), com F=56,8591 e p-value de 2,16128 10-14, onde R2 e Q2 são valores que remetem à performance do modelo de regressão. Para o modo positivo o modelo PLS-DA também foi validado, com 20 permutações para 2 componentes, com R2=0,492 e Q2=-0,215, validando o modelo. Na validação cruzada confirmou-se que o modelo é estatisticamente significativo também para o modo positivo, descrevendo 32,1% da variação em X (R2x=0,321) e 89,5% da variação em Y (R2y=0,895), predizendo 66,9% (Q2y=0,669). R2 mostra o ajuste do modelo e a variação explicada, elucidando a qualidade do ajuste, enquanto Q2 fornece informações quanto à previsibilidade do modelo e a sua qualidade, ou seja, quanto mais próximo de 1 for o valor de Q2, melhor será a sua predição do modelo estatístico utilizado [69, 70]. O gráfico contendo a validação do modelo PLS-DA é mostrado na Figura 17 para o modo negativo e na Figura 18 para o modo positivo.
Figura 17. Gráfico da validação do modelo PLS-DA pelo teste de permutação (20 permutações) de R2 (●) e Q2 (■) para as análises obtidas em modo ESI negativo.
Utiliza-se também para se validar o modelo estatístico a CV-ANOVA, que faz uso de um teste F de significância para avaliar modelos PLS-DA e OPLS-DA, onde se testa os modelos para determinar se os resíduos preditivos da validação cruzada são significativamente menores do que a variação próxima da média global, onde o p-value indica o nível de probabilidade na qual um modelo com tal valor de F é o resultado no acaso [79]. A Tabela 2 mostra que o valor de p-value é de 2,16.10-14 para as análises em modo negativo, enquanto a Tabela 3 mostra que esse valor é de 7,99893.10-8 para as análises em modo positivo, mostrando que o modelo é válido para os resultados obtidos em ambos os modos de ionização.
Tabela 2. CV-ANOVA para o modelo PLS-DA utilizando duas componentes para as análises realizadas em modo ESI negativo
Soma dos Quadrados dos resíduos
Graus de
Liberdade Variância F p-value
Desvio padrão
Valor total 34 34 1 1
Regressão 31,42 6 5,23 56,85 2,16.10-14 2,28
Residual 2,57 28 0,09 0,3
Figura 18. Gráfico da validação do modelo PLS-DA pelo teste de permutação (20 permutações) de R2 (●) e Q2 (■) para as análises obtidas em modo ESI positivo.
Tabela 3. CV-ANOVA para o modelo PLS-DA utilizando duas componentes para as análises realizadas em modo ESI positivo
Soma dos Quadrados dos resíduos
Graus de
Liberdade Variância F p-value
Desvio padrão
Valor total 34 34 1 1
Regressão 24,29 4 6,07 18,77 7,99.10-08 2,46
Residual 9,71 30 0,32 0,57
Utilizou-se também para as análises em modo positivo o modelo OPLS-DA para auxiliar na identificação dos features diferenciais, que serão abordados na seção 4.3. O modelo OPLDA não só faz a análise dos features diferenciais via S-plot, mas também auxilia na visualização da separação dos features entre os grupos, deixando a separação mais visível. O score plot do modelo OPLS-DA para o modo ESI positivo é mostrado na Figura 19.
Em metabolômica, normalmente utiliza-se a PLS-DA e a OPLS-DA para se determinar features discriminantes, especialmente devido à correlação entre as matrizes X e Y, onde a matriz X contém as variáveis (toda a informação) e a matriz Y
Figura 19. Score plot da análise por OPLS-DA para as amostras controle (círculos verdes) e bipolar (círculos escuros), obtidas em modo ESI positivo.
