Todas as amostras de estreptococos β-hemolíticos dos grupo C e G foram analisadas pela técnica de PFGE para o estudo da diversidade genética. A extração, fragmentação e separação dos fragmentos de DNA cromossômico gerados foi baseada na metodologia descrita por d’Oliveira (2002) com algumas modificações.
As amostras foram cultivadas em placas contendo meio de ágar sangue e incubadas por 24h a 35ºC. Após este período, um inóculo equivalente à escala 5 de
Mc Farland preparado em 200µL de tampão PIV (NaCl 1,0M, Tris-HCl 10mM, pH 7,6) foi misturado a um volume igual de agarose de baixa temperatura de fusão (Nu Sieve GTG Low Melting Agarose, FMC BioProducts, Rockland, EUA) a 2%, e distribuído em moldes para a obtenção de blocos, os quais foram resfriados a 4ºC.
Para a lise celular, os blocos já solidificados foram tratados com solução contendo 1mg de lisozima e 5 U de mutanolisina (Sigma) por mL e incubados durante 18 a 24h a 37ºC sob agitação suave. Esta solução foi então substituída por 2,0mL de solução ES (EDTA 0,5M, 1% N-lauril-sarcosina) contendo 0,1mg/mL de proteinase K (Roche, Indianapolis, IN) e incubada por 18 a 24h a 50ºC.
Antes do tratamento com enzima de restrição, cada bloco foi lavado com 2,0mL de tampão TE 1X (Tris-HCl 10mM pH 7,6, EDTA 0,1mM) 10 vezes a 37ºC sob agitação. Cada bloco foi então tratado com 250µL da solução tampão-específica para a enzima de restrição (Roche) para o equilíbrio da reação durante 1h a temperatura específica para a enzima (25µL de tampão A 10X concentrado + 225µL de H2O milliQ estéril). A seguir, o tampão foi removido e foi adicionado novo tampão contendo 30U da enzima de restrição SmaI ou SfiI. Os blocos foram incubados por 18 a 24h a 25ºC (SmaI) ou 50ºC (SfiI) (Sigma).
O tampão e a enzima foram removidos, e os blocos de agarose foram fundidos a 72ºC e aplicados em reservatórios do gel de corrida preparado com agarose a 1,3% (Pulsed Field Certified Agarose - BioRad) em tampão TBE 0,5X (Tris 0,05M, EDTA 1,25mM e ácido bórico 0,05M).
Os fragmentos foram separados por eletroforese em campo pulsado empregando-se o equipamento CHEF DR II (Bio Rad, Hercules, EUA).
Os parâmetros utilizados foram: tempo de pulso crescente de 3,0 a 45,0s, por 25h a 6V/cm na temperatura de 11ºC.
Os fragmentos de DNA no gel foram corados com brometo de etídio (0,5µg/mL) e as imagens do gel captadas pelo programa “Quantity one” (BioRad). Foi utilizado marcador padrão para a observação do tamanho dos fragmentos obtidos (Lambda Ladder PFGE Marker – BioLabs inc., New England).
Os perfis eletroforéticos obtidos foram analisados pelo sistema computadorizado de análise de imagens Gel Compar II versão 3,5 (Applied Matches, Kortrijk, Bélgica). O coeficiente de Dice foi utilizado para os cálculos da matriz de similaridade dos perfis encontrados e o método de UPGMA (Unweigthted Pair Group Method Using Aritimetic Averages) foi utilizado para gerar os dendrogramas com tolerância de 1,0%.
RESULTADOS
1. Identificação das amostras bacterianas
As amostras utilizadas nesse trabalho foram coletadas entre os anos de 1994 e 2002 e pertencem à coleção de culturas bacterianas do Laboratório de Patogênese e Resistência em Cocos Gram Positivos do IMPPG, UFRJ. As amostras foram caracterizadas como estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G baseando-se nos métodos convencionais de identificação. Dentre as 109 amostras analisadas, 25 pertencem ao grupo C e 84 ao grupo G.
Nos testes de VP foram encontradas 14 amostras com resultado positivo, sendo identificadas portanto, como pertencentes ao grupo dos estreptococos “anginosus”. Entre as amostras pertencentes ao grupo C foram encontradas 10 positivas para o teste de VP, enquanto no grupo G foram encontradas 4. O restante das amostras apresentou resultado negativo para este teste, sendo identificadas como pertencentes à subespécieS. dysgalactiae equisimilis.
O sistema API 20 Strep foi utilizado para todas as amostras com o objetivo não só de diferenciar as espécies pertencentes ao grupo estreptococos “anginosus” como de confirmar a identificação da subespécie S. dysgalactiae equisimilis. Foram identificadas 12 (≅11,0%) amostras da espécieS. constellatus, sendo 8 pertencentes ao grupo C e 4 ao grupo G, uma destas negativa para o VP quando realizado pelo método convencional. Foi identificada 1 amostra (≅1,0%) da espécie S. anginosus
(grupo G) e 1 (≅1,0%) da espécie S. intermedius (grupo C). Um total de 8 amostras (≅ 7,0%) apresentaram resultados incompatíveis com a identificaçãoproposta pelo
Sistema API 20 Strep. As 87 amostras restantes (≅80,0%) foram identificadas como
S. dysgalactiae equisimilis(Figura 1).
2. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos:
A susceptibilidade das amostras de estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G à eritromicina, azitromicina, claritromicina, espiramicina, clindamicina e penicilina, foi testada pela determinação da CMI realizada pelo teste de diluição em agar. Foi encontrada uma taxa de resistência à eritromicina, claritromicina e azitromicina de 11,9% (13 amostras) no período estudado. Todas as amostras resistentes aos macrolídeos encontradas neste trabalho pertencem à subespécie S. dysgalactiae equisimilis. Dessa forma, a taxa de resistência aos macrolídeos na subespécie S. dysgalactiae equisimilis foi de 13,7%. É importante ressaltar que as 13 amostras referidas são resistentes aos três macrolídeos (eritromicina, claritromicina e azitromicina). Nenhuma amostra apresentou-se resistente a apenas um ou dois dos macrolídeos descritos a cima. A tabela 1 mostra o número de amostras isoladas por ano e o número de amostras resistentes em cada período, bem como a taxa de resistência considerando o total de amostras estudadas. É possível observar que a resistência é oscilatória durante o período estudado, como apresentado na figura 2, que mostra a variação das taxas de resistência durante o período estudado de acordo com os grupos sorológicos. É interessante observar que no início do período estudado, todas as amostras resistentes aos macrolídeos pertencem ao grupo G e que posteriormente, todas as amostras com perfil de resistência pertencem ao grupo C.
Com relação ao outro macrolídeo estudado, a espiramicina, foram encontradas 5 amostras resistentes e 4 com resistência intermediária, sendo todas estas resistentes aos outros macrolídeos testados. Para a clindamicina, foram encontradas 3 amostras resistentes, também resistentes aos macrolídeos. Todas as amostras apresentaram-se sensíveis à penicilina. Na tabela 2 pode-se observar os valores de CMI obtidos para os quatro macrolídeos testados e para a clindamicina entre as amostras resistentes.
3. Caracterização dos fenótipos de resistência
As amostras resistentes aos macrolídeos foram submetidas à caracterização do mecanismo fenotípico de resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B pelo teste do duplo-disco. Foi observada a presença dos 3 mecanismos fenotípicos descritos no gênero estreptococos entre as amostras estudadas. O teste da indução em caldo confirmou os resultados obtidos. A figura 3 mostra a distribuição dos fenótipos de resistência entre as 13 amostras estudadas. A tabela 2 mostra a correlação entre os valores de CMI encontrados e o perfil fenotípico da resistência. Como pode ser observado, foram encontrados valores altos de CMI para as amostras com perfil cMLSB para todos os antimicrobianos macrolídeos e para a clindamicina. As amostras com fenótipo M não apresentaram resistência à espiramicina e à clindamicina. Foi observada uma variação no perfil de susceptibilidade à espiramicina nas amostras iMLSB.
As amostras com perfil iMLSB foram submetidas ao crescimento em concentração subinibitória dos outros macrolídeos para a avaliação da capacidade
de indução da resistência à clindamicina por esses outros antimicrobianos. Foi observado que todos os macrolídeos testados funcionam como indutores da resistência à clindamicina para algumas amostras como mostra a tabela 3, entretanto, a eritromicina foi o único macrolídeo que se mostrou indutor eficiente da resistência em todas as amostras.
4. Detecção dos genes de resistência MLSB
Todas as amostras bacterianas foram submetidas à técnica de PCR para a pesquisa dos genesermB, ermTRe mefA, associados à resistência aos macrolídeos em estreptococos. As amostras que apresentaram o fenótipo de resistência M possuem o gene mefA. As amostras com fenótipo de resistência MLSB indutiva apresentam o gene ermTR, enquanto naquelas amostras que apresentaram o fenótipo de resistência MLSB constitutiva foi encontrado o gene ermB. Nenhuma amostra apresentou mais de um dos genes pesquisados. As amostras sensíveis aos macrolídeos não apresentaram nenhum dos 3 genes pesquisados.
5. Seqüenciamento dos genes mefeerm
Com o objetivo de comparar os genes relacionados à resistência aos macrolídeos em estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G com aqueles encontrados nas demais espécies de estreptococos foi realizado o seqüenciamento dos produtos obtidos a partir da técnica de PCR.
Após o seqüenciamento dos genesermTR das amostras 07 e 83, foi observado que as seqüências obtidas nas duas amostras são idênticas.
Para as amostras usadas no seqüenciamento do gene ermB também foram encontradas duas seqüências idênticas.
O gene mefA seqüenciado a partir da amostra 95 apresenta grande similaridade (99,9%) com o gene mefA encontrado em amostras de S. pyogenes e de S. pneumoniae (GenBank números AY657002, AF227521 e AF227520), com apenas uma mutação na base de número 625, substituindo uma citosina por uma adenina.
Com relação à amostra número 06, a maior similaridade encontrada com a seqüência obtida para o gene mefA foi de 92,3% em uma amostra de estreptococos do grupo G (GenBank número AY355410.1). Pela comparação entre a seqüência obtida e a seqüência depositada no GenBank, foi possível observar a presença de várias mutações pontuais. A seqüência do gene encontrado na amostra estudada é apresentada na figura 4, bem como a sua tradução, e ambas são comparadas com a seqüência encontrada no GenBankpara a observação das mutações.
6. Análise dos perfis de fragmentação do DNA Genômico
A técnica de PFGE foi realizada com todas as amostras, utilizando a enzima de restrição SmaI, para a observação da diversidade clonal. Entretanto, uma amostra com resistência aos macrolídeos (número 95) não teve seu material genético digerido por essa enzima, prejudicando a análise da clonalidade entre as amostras resistentes. Por esse motivo, as amostras que apresentam resistência aos macrolídeos também foram submetidas à técnica de PFGE utilizando a enzima de
restrição SfiI. As figuras 5 e 6 mostram o perfil de fragmentação encontrado utilizando-se as duas enzimas de restrição, com seus dendrogramas. Foi observado que as amostras que apresentam o fenótipo M de resistência tem origem policlonal, ao contrário do que foi observado entre as amostras que apresentam o fenótipo MLSB. As amostras com resistência indutiva são representadas por apenas em 2 clones diferentes. As duas amostras com resistência constitutiva são geneticamente idênticas. O mesmo perfil de clonalidade foi observado quando foi utilizada a enzima de restrição SfiI, diferindo apenas na relação de similaridade apresentada entre os diferentes clones. Foi observado que a amostra número 06 não teve seu DNA cortado pela enzimaSfiI.
A figura 7 mostra o dendrograma obtido a partir da análise das amostras positivas para o teste de VP (grupo “anginosus”), enquanto a figura 8 mostra os resultados obtidos para as amostras não identificadas pelo API. Em ambos os géis, foram encontrados vários clones distintos. A figura 9 mostra a relação clonal entre todas as amostras estudadas. A maioria das amostras não apresenta relação clonal.
Tabela 1 – Resistência aos macrolídeos entre as amostras de estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G isoladas entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro.
Período Número total de
amostras isoladas Número de amostrasresistentes aos macrolídeosª (%) Grupo C Grupo G 1994 3 8 4 (3,7) 1995 3 11 1 (0,9) 1996 1 12 2 (1,8) 1997 6 18 1 (0,9) 1998 1 7 0 1999 4 11 4 (3,7) 2000 1 2 0 2001 3 11 1 (0,9) 2002 3 4 0 Total 25 84 13 (11,9)
Tabela 2 – Correlação entre os valores de CMI (µg/mL) encontrados para os macrolídeos e o perfil fenotípico da resistência aos macrolídeos de amostras deS. dysgalactiaeisoladas entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro.
Número da amostra
Grupo Eri Azi Clari Espi Clin Fenótipo de
resistência 06 G 8 16 2 0,5* 0,12* M 02 G >64 >64 >64 > 64 2 cMLSB 07 G 4 32 2 32 0,5** iMLSB 09 G 4 32 2 16 2 iMLSB 16 G >64 >64 >64 >64 32 cMLSB 27 G 8 16 4 0,5* 0,12* M 37 G 8 16 2 0,5* 0,03* M 50 C 2 16 2 2 0,06* iMLSB 81 C 2 16 2 1** 0,12* iMLSB 82 C 2 16 2 1** 0,06* iMLSB 83 C 2 16 2 1** 0,12* iMLSB 80 C 2 16 2 1** 0,12* iMLSB 95 C 8 8 8 0,5* 0,06* M
* Valores correspondentes à sensibilidade ** Valor correspondente à resistência intermediária Os demais valores encontrados correspondem à resistência
Eri: eritromicina, Azi: azitromicina, Clari: claritromicina, Espi: espiramicina, Clin: clindamicina IMLSB: fenótipo de resistência indutiva; cMLSB: fenótipo de resistência constitutiva, M: fenótipo M
Tabela 3 – CMI para clindamicina (µg/mL) para as amostras deS. dysgalactiaecom resistência iMLSB
após a indução da resistência à clindamicina com quatro macrolídeos diferentes.
Número da amostra
CMI sem
indução indução comCMI após eritromicina CMI após indução com claritromicina CMI após indução com azitromicina CMI após indução com espiramicina 07 0,5** >128 >32 >32 >32 09 2 >128 >32 >32 >32 50 0,06* >128 >32 >32 0,06* 81 0,12* >128 0,12* >32 0,12* 82 0,06* >128 0,06* 0,12* 0,06* 83 0,12* 64 0,12* >32 0,12* 80 0,12* >128 0,12* >32 0,12*
* Valores correspondentes à sensibilidade ** Valor correspondente à resistência intermediária Os demais valores encontrados correspondem à resistência
Figura 1 – Distribuição das espécies de estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G isoladas entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro de acordo com a identificação pelo sistema API 20 Strep.
Figura 2 – Incidência da resistência aos macrolídeos eritromicina, claritromicina e azitromicina entre as amostras de S. dysgalactiae isoladas entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro.
1% 11% 80% 7% 1% S. anginosus S. intermedius S. constellatus S. dysgalactiae equisimilis Não identificadas 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 (%) 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 1994-2002 Ano Grupo C Grupo G
Figura 3 – Distribuição dos diferentes fenótipos de resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas entre as 13 amostras de S. dysgalactiae
resistentes isoladas entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro. iMLSB 54% cMLSB 15% M 31%
Query 1 ATGGAAAAATACAACAATTGGAAACTTAAGTTTTATACAATATGGGCAGGGCAAGCAGTA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 ATGGAAAAATACAACAATTGGAAACTTAAGTTTTATACAATATGGGCAGGGCAAGCAGTA 60 Query 61 TCATTAATCACTAGTGCCATCCTGCAAATGGCGATTATTTTTTACCTTACAGAGAAAACA 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 61 TCATTAATCACTAGTGCCATCCTGCAAATGGCGATTATTTTTTACCTTACAGAAAAAACT 120 Query 121 GGATCTGCGATGGTCTTGTCTATGGCTTCACTAGTAGGTTTTTTACCCTATGCGGTCTTT 180 ||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 GGATCTGCGATGGTCTTGTCTTTGGCTTCACTAGTAGGTTTTTTACCCTATGCGGTCTTT 180 Query 181 GGACCTGCGATTGGTGTGCTAGTGGATCGTCATGATAGGAAGAAGATAATGATTGGTGCT 240 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 GGACCTGCAATTGGTGTGCTAGTGGATCGTCATGATAGGAAGAAGATAATGATTGGTGCT 240 Query 241 GATTTAATTATCGCAGCAGCTGGTGCAGTGCTTACTATTGTTGCATTGTATATGGAGCTA 300 ||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||||| | |||||||||||| Sbjct 241 GATTTAATTATCGCAGCAGCTAGTTCAGTGCTTACTATTGTTGCACTCTATATGGAGCTA 300 Query 301 CCTGTCTGGATAGCTATGATAGTATTGTTTATCCGTAGCATTGGAACAGCTTTTCATACC 360 ||||||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 301 CCTGTCTGGATGGTTATGATAGTATTGTTTATCCGTAGCATTGGAACAGCTTTTCATAAC 360 Query 361 CCAGCACTCAATGCGGTTACGCCACTTTTAGTACCAGAAGAACAGCTGACGAAATGTGCA 420 |||||||||||| ||||||| |||||||||||||||||||| ||||| |||||||| ||| Sbjct 361 CCAGCACTCAATTCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAGCAGCTAACGAAATGCGCA 420 Query 421 GGCTATAGTCAGTCTTTGCAGTCTATAAGCTATATTGTTAGTCCGGCAGTTGCAGCACTC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 421 GGCTATAGTCAGTCTTTGCAGTCTATAAGCTATATTGTTAGTCCGGCACTTGCAGCACTC 480 Query 481 TTATACTCCGTTTGGGATCTAAATGCTATTATTGCCATCGATGTATTGGGTGCTGTGATT 540 |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| Sbjct 481 TTATACTCCGTTTGGGATTTAAATGCTATTATTGCCATCGACGTATTGGGTGCTGTGATT 540 Query 541 GCATCTATTACGGTAGCAATTGTACGTATTCCTAAGCTGGGTGATCGCGTGCAAAGTTTG 600 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||| |||||||||||| Sbjct 541 GCATCTATTACGGTAGCAATTGTACGTATACCTAAGCTGGGTAATCCAGTGCAAAGTTTG 600 Query 601 GACCCAAATTTCATAAGAGAAATGAAAGAAGGAATTGTCGTTATGAGACAAAACAAAGGA 660 || ||||||||||||||||| |||| |||||||||||| ||| ||||||||||||||||| Sbjct 601 GAACCAAATTTCATAAGAGAGATGAGAGAAGGAATTGTGGTTCTGAGACAAAACAAAGGA 660 Query 661 TTGTTTGCCTTATTACTCTTAGGAACACTATATACTTTTGTTTATATGCCAATTAATGCA 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||| Sbjct 661 TTGTTTGCCTTATTACTCTTAGGAACACTATATACTTTTGTTTATATGCCTATCAATGCA 720 Query 721 CTATATCCTTTAATCAGCATGGAATATTTTAATGGAACACCGATGCATATTTCTATTACC 780 || | |||||| || ||||||||| | |||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 721 CTGTTTCCTTTGATAAGCATGGAACACTTTAATGGAACACCTGTGCATATTTCTATTACG 780 Query 781 GAAATTGCTTTTGCCTCTGGCATGCTGGCAGGCGGCTTGATATTAGGAAGATTGGGAAGT 840 |||||| | ||||| | ||| ||||| ||||| ||||| | ||||||||||| || || Sbjct 781 GAAATTTCCTTTGCATTTGGAATGCTAGCAGGAGGCTTATTGTTAGGAAGATTAGGGAGC 840 Query 841 TACGAAAAGCGTGTACCTTTAATAACAGGTTCATTTTTTATGATGGGAGCTAGTTTAGCC 900 | ||||||||||||| ||||||| ||||||||||||| |||||||| ||||||||| Sbjct 841 TTCGAAAAGCGTGTATTACTAATAACTAGTTCATTTTTTATAATGGGAGCCAGTTTAGCC 900 Query 901 ATTGCAGGATTACTTCCTCCAAGTGGATTTTTCATATTTGTAGTCTGCTGTGCAATAATG 960 || | ||| |||||||||||| ||||||| | ||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 901 GTTTCGGGAATACTTCCTCCAAATGGATTTGTAATATTTGTAGTTTGCTGTGCAATAATG 960 Query 961 GGGCTTTCAGTTCCATTTTACAGCGGTGTACAAACAGCACTTTTTCAGCAAAAAATCAAG 1020 |||||||| || |||||||| |||||||| |||||||| ||||||||| | ||||| ||| Sbjct 961 GGGCTTTCGGTGCCATTTTATAGCGGTGTGCAAACAGCTCTTTTTCAGGAGAAAATTAAG 1020 Query 1021 CCTGAATATTTAGGGCGTGTATTTTCCTTCACCGGTAGTATCATGTCACTTGCAATGCCA 1080 |||||||||||||| ||||||||||| || ||||| ||||||||||||||||| |||||| Sbjct 1021 CCTGAATATTTAGGACGTGTATTTTCTTTGACCGGAAGTATCATGTCACTTGCTATGCCA 1080 Query 1081 CTAGGGTTAATCCTTTCCGGGTTCTTTGCTGATAGAATCGGTGTAAATCATTGGTTTTTA 1140 | |||||||| ||||| || ||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 1081 ATTGGGTTAATTCTTTCTGGATTCTTTGCTGAAAGAATCGGTGTAAATGATTGGTTTTTA 1140
Query 1141 CTATCAGGTATTTTAATTATTTGCATTGCAATAGTTTGCCCGATGATGACTGAGGTTAGA 1200 ||||||||| ||||||||||| ||||||| |||| |||||| ||||| |||||||||||| Sbjct 1141 CTATCAGGTGTTTTAATTATTGGCATTGCCATAGCTTGCCCCATGATAACTGAGGTTAGA 1200 Query 1201 AAATTAGATTTAAAATAA 1218 |||||||||||||||||| Sbjct 1201 AAATTAGATTTAAAATAA 1218 A amostra06 MEKYNNWKLKFYTIWAGQAVSLITSAILQMAIIFYLTEKTGSAMVLSMASLVGFLPYAVF 60 amostraAY355410 MEKYNNWKLKFYTIWAGQAVSLITSAILQMAIIFYLTEKTGSAMVLSLASLVGFLPYAVF 60 ***********************************************:************ amostra06 GPAIGVLVDRHDRKKIMIGADLIIAAAGAVLTIVALYMELPVWIAMIVLFIRSIGTAFHT 120 amostraAY355410 GPAIGVLVDRHDRKKIMIGADLIIAAASSVLTIVALYMELPVWMVMIVLFIRSIGTAFHN 120 ***************************.:**************:.**************. amostra06 PALNAVTPLLVPEEQLTKCAGYSQSLQSISYIVSPAVAALLYSVWDLNAIIAIDVLGAVI 180 amostraAY355410 PALNSVTPLLVPEEQLTKCAGYSQSLQSISYIVSPALAALLYSVWDLNAIIAIDVLGAVI 180 ****:*******************************:*********************** amostra06 ASITVAIVRIPKLGDRVQSLDPNFIREMKEGIVVMRQNKGLFALLLLGTLYTFVYMPINA 240 amostraAY355410 ASITVAIVRIPKLGNPVQSLEPNFIREMREGIVVLRQNKGLFALLLLGTLYTFVYMPINA 240 **************: ****:*******:*****:************************* amostra06 LYPLISMEYFNGTPMHISITEIAFASGMLAGGLILGRLGSYEKRVPLITGSFFMMGASLA 300 amostraAY355410 LFPLISMEHFNGTPVHISITEISFAFGMLAGGLLLGRLGSFEKRVLLITSSFFIMGASLA 300 *:******:*****:*******:** *******:******:**** ***.***:****** amostra06 IAGLLPPSGFFIFVVCCAIMGLSVPFYSGVQTALFQQKIKPEYLGRVFSFTGSIMSLAMP 360 amostraAY355410 VSGILPPNGFVIFVVCCAIMGLSVPFYSGVQTALFQEKIKPEYLGRVFSLTGSIMSLAMP 360 ::*:***.**.*************************:************:********** amostra06 LGLILSGFFADRIGVNHWFLLSGILIICIAIVCPMMTEVRKLDLK 405 amostraAY355410 IGLILSGFFAERIGVNDWFLLSGVLIIGIAIACPMITEVRKLDLK 405 :*********:*****.******:*** ***.***:********* B
Figura 4 – A: Alinhamento da seqüência obtida após o seqüenciamento do produto de PCR para a detecção do gene mef da amostra número 06 (Query), e seqüência encontrada no GenBank número AY355410 (Sbjct). B: Alinhamento da tradução das seqüências no programa Clustal W.
A
B
Figura 5 – Perfil de Fragmentação do DNA genômico obtido pela técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição SmaI para as amostras de S. dysgalactiae que apresentam resistência aos macrolídeos. A: fotografia do gel. B: Dendrograma obtido após análise de imagens pelo programa Gel Compar II.
1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 07 sm a iM L SB 09 sm a iM L SB 37 sm a M 50 sm a iM L SB 80 sm a iM L SB 81 sm a iM L SB 83 sm a iM L SB 82 sm a iM L SB 02 sm a cM LSB 16 sm a cM LSB 06 sm a M 27 sm a M 95 sm a M 02 06 50 80 81 83 16 07 09 95 82 27 37
A
B
Figura 6 – Perfil de Fragmentação do DNA genômico obtido pela técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição SfiI para as amostras de S. dysgalactiae que apresentam resistência aos macrolídeos. A: fotografia do gel. B: Dendrograma obtido após análise de imagens pelo programa Gel Compar II.
1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 02 sfi c M LS B 16 sfi c M LS B 95 sfi M 07 sfi iM LS B 09 sfi iM LS B 50 sfi iM LS B 80 sfi iM LS B 81 sfi iM LS B 82 sfi iM LS B 83 sfi iM LS B 27 sfi M 37 sfi M 06 sfi M 02 16 50 80 81 82 83 07 09 95 06 27 37
Figura 7 – Dendrograma obtido após análise do perfil de fragmentação do DNA genômico obtido pela técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição SmaI para as amostras de estreptococos “anginosus”.
1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 49 VP + gru po C 58 VP + gru po G 39 VP + gru po C 62 VP + gru po C 18 VP + gru po C 19 VP + gru po C 46 VP + gru po C 107 V P + g rupo C 88 VP + gru po G 03 VP + gru po C 44 VP + gru po C 15 VP + gru po G 78 VP + gru po G
Figura 8 – Dendrograma obtido após análise do perfil de fragmentação do DNA genômico obtido pela técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição SmaI para as amostras não identificadas pelo API.
1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 6 1 G 6 5 G 4 0 G 4 2 G 4 7 G 1 03 G 0 8 G
DISCUSSÃO
Os estreptococos beta-hemolíticos constituem um grupo de grande significância clínica pela freqüência com que causam doenças em seres humanos. Antes da introdução dos agentes antimicrobianos, infecções estreptocócicas sistêmicas, incluindo escarlatina e bacteremia, freqüentemente eram fatais, assim como suas complicações não supurativas como a febre reumática e a glomerulonefrite. Após a introdução da antibioticoterapia, as doenças graves e seqüelas causadas principalmente pelo S. pyogenes, declinaram no mundo desenvolvido.
Desde a década de 1980, tem sido observada uma modificação no padrão das doenças causadas por esses microrganismos bem como na susceptibilidade aos antimicrobianos. Entre os estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G é cada vez mais freqüente o relato de diversas doenças invasivas graves em seres humanos. Em um trabalho realizado entre 1987 e 1994 em um hospital na Finlândia foi observado que 2,9% dos casos de bacteremia eram causados por estreptococos. Dentro deste grupo, 26% dos casos eram causados por estreptococos do grupo G e 4% por estreptococos do grupo C. Entre esses pacientes, freqüentemente era observada alguma condição de maior susceptibilidade a infecções. Não houve mortalidade por bacteremia causada por estreptococos do grupo C, entretanto, a taxa de mortalidade para o grupo G foi de 9% (Schugket al.,1997).
A nomenclatura dos estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G encontrada na literatura é confusa. As amostras de origem humana são freqüentemente denominadas de acordo com os grupos sorológicos de Lancefield e por isso, a freqüência da subespécie S. dysgalactiae equisimilis como causa de
infecções é subestimada. Entretanto, a grupagem sorológica pode funcionar como uma ferramenta auxiliar no diagnóstico. Para estudos a cerca do microrganismo, a identificação da espécie torna-se necessária. Em 1999, Brandt e colaboradores relataram a presença de 3 amostras de estreptococos beta-hemolíticos do grupo A pertencentes à subespécie S. dysgalactiae equisimilis. As amostras foram identificadas como pertencentes a essa espécie inicialmente utilizando-se provas bioquímicas e os resultados foram confirmados pela análise das seqüências dos genes de rRNA 16S, mostrando mais uma vez que a identificação das espécies de estreptococos não deve ser baseada apenas na grupagem sorológica.
O teste de VP auxilia a identificação inicial da subespécie S. dysgalactiae equisimilis, caso o seu resultado seja negativo. As amostras positivas para esse teste pertencem ao grupo “anginosus” e outras metodologias devem ser utilizadas para a sua identificação. No nosso trabalho, foi observada uma prevalência de S. dysgalactiae equisimilis sobre o grupo “anginosus”. Dentre as amostras do grupo G, 95,2% pertenciam a essa espécie. Por outro lado, no grupo C, a proporção entre amostras positivas e negativas para o teste de VP foi equilibrada, sendo 40% destas amostras alocada no grupo dos estreptococos “anginosus”.
O grupo do estreptococos “anginosus” é composto por 3 espécies: S. anginosus, S. intermedius e S. constellatus. Em laboratórios clínicos, a identificação de cocos Gram positivos catalase negativos é baseada em testes fenotípicos. Esses testes foram miniaturizados ou automatizados, melhorando a sua acurácia. Entre os testes comercialmente disponíveis, o API 20 Strep é o mais utilizado, geralmente fornecendo resultados confiáveis. Whiley e colaboradores (1990) demonstraram que são necessárias 7 provas bioquímicas para a diferenciação entre as 3 espécies. Por esse motivo, a forma mais frequentemente utilizada para essa identificação é o
sistema API 20 Strep. Clarridge e colaboradores (1999) utilizaram o API 20 Strep para a identificação das espécies de estreptococos “anginosus” e compararam o resultado obtido com a identificação molecular realizada com as mesmas amostras utilizando-se o seqüenciamento do rRNA 16S. Foi observado que para as espécies
S. anginosus e S. intermedius, o API 20 Strep mostrou-se muito eficiente. Entretanto, para a espécie S. constellatus foram encontrados resultados discrepantes, sendo esta identificada incorretamente como uma das outras duas espécies em algumas amostras. Tais discrepâncias podem ter sido decorrentes de reações do API erroneamente interpretadas ou da variabilidade bioquímica existente dentro das próprias espécies.
No nosso trabalho, foram encontradas algumas discrepâncias entre o resultado do teste convencional de VP e o teste de VP presente no API. Em alguns casos, o teste de VP do API era negativo, enquanto o convencional era positivo. Nas amostras onde a discrepância foi observada, a identificação pelos dois métodos foi repetida e o VP do API, na segunda tentativa tornou-se positivo. Em uma amostra entretanto, foi observado o contrário: o teste de VP do API foi positivo, enquanto o VP convencional foi negativo. Após várias repetições de ambos os métodos os resultados se mantiveram. Outro problema encontrado com o sistema API foi com relação a 8 amostras que não puderam ser identificadas, fato esse já relatado por outros autores (Bosshard et al., 2004). Entre as 8 amostras, 6 apresentavam o mesmo número, inexistente na tabela de identificação. Possivelmente seria necessária a realização da identificação genotípica dessas 6 amostras para que um novo perfil fenotípico viesse a ser incluído no sistema API. Entre essas 8 amostras, apenas uma pertence ao grupo C, sendo esta positiva para o teste convencional de VP e as demais, negativas para esse teste.
De acordo com os resultados obtidos pelo API, 87 amostras pertencem à subespécie S. dysgalactiae equisimilis, 12 amostras à espécie S. constellatus, 1 amostra à espécie S. anginosus e 1 à espécie S. intermedius. É interessante observar que as 14 amostras positivas para o teste convencional de VP neste trabalho não são as mesmas 14 identificadas pelo API como pertencentes ao grupo “anginosus”. Uma amostra identificada pelo API como pertencente a esse grupo foi negativa para o teste convencional de VP, enquanto uma amostra positiva para o teste de VP, quando testada pelo API, não pode ser identificada.
Pela tipagem molecular através da técnica de PFGE utilizada neste trabalho, foi possível observar que entre as amostras não identificadas pelo API, existem dois