Caracterização Fenotípica e Genotípica da Resistência aos Macrolídeos em Estreptococos Beta-Hemolíticos dos Grupos C e
G Isolados de Seres Humanos
Rachel Elise Cerqueira d’Oliveira
2006
Macrolídeos em Estreptococos Beta-Hemolíticos dos Grupos C e G Isolados de Seres Humanos
Rachel Elise Cerqueira d’Oliveira
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Orientadora: Profª. Angela Christina Dias de Castro
Rio de Janeiro
Rachel Elise Cerqueira d’Oliveira
Orientadora: Profª. Angela Christina Dias de Castro
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Microbiologia.
Aprovada por:
Presidente, Profª. Angela Christina Dias de Castro
Prof. Geraldo Renato de Paula
Profª. Maria Cândida de Souza Ferreira
Profª. Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
Profª. Rosana Rocha Barros
Rio de Janeiro Fevereiro/2006
Resistência em Cocos Gram Positivos no Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) sob a orientação da Profª Angela C. D. Castro, e no Riley’s Lab, School of Public Health, University of California, Berkeley, sob a orientação do Dr. Lee W. Riley.
e ao Rodolfo Medeiros
apoio e confiança constantes durante todo o período no laboratório, e pela amizade, fundamental para tornar agradável e tranqüila a realização deste trabalho. Agradeço também pelo grande incentivo, sem o qual eu não teria realizado o doutorado sanduíche.
Um agradecimento especial à Profª. Beatriz Meurer Moreira pelo grande apoio científico na realização da maior parte deste trabalho, e pela receptividade tão carinhosa em sua casa em Berkeley.
Agradeço também à Luiza Lessa pela colaboração constante na realização da parte fenotípica do trabalho, e pela enorme amizade e companheirismo, tão importantes pra mim, e que representam alguns dos melhores resultados deste trabalho.
Ao Dr. Lee Riley, pela grande oportunidade a mim oferecida para a realização da parte molecular da tese no seu laboratório, pela grandiosa contribuição científica, e pela amizade e boa hospitalidade, muito melhores do que o esperado.
Aos meus pais, Elisabeth e Djalma, e às minhas irmãs, Isabelle e Giselle, por todo o apoio e incentivo, desde sempre.
Ao Rodolfo Medeiros, meu marido, pelo apoio constante, e pela compreensão e incentivo durante a realização do doutorado sanduíche.
Às amigas do Instituto de Microbiologia: Caroline Soares, Eline Barboza, Flavia Pellegrino, Jéssica Manya e Renata Rabello, pela amizade e cumplicidade, tornando o desenvolvimento desse trabalho muito mais agradável.
Aos amigos do Riley’s Laboratory naUniversity of Califórnia, Berkeley, especialmente à Sherry Smith.
À minha grande amiga Patrícia Sequeira, que com a sua amizade tornou a minha estadia em Berkeley muito melhor.
À Semiramis pela amizade e apoio técnico, ao Sr. Luís pelo apoio técnico, e à Dilma pela atenção constante na biblioteca.
A todos os Professores e amigos que contribuíram na realização desta tese.
Aos laboratórios Ache Laboratórios Farmacêuticos, Medley Indústria farmacêutica, Teuto Brasileiro, Medipharma, Maxpharma e Tarifarma, pela doação dos antimicrobianos, e à BioLab bioMerrieux, pela doação do API 20 Strep.
Ao Instituto de Microbiologia na pessoa da sua Diretora, Profª. Ângela Hampshire.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), FAPERJ e
Caracterização Fenotípica e Genotípica da Resistência aos Macrolídeos em Estreptococos Beta-Hemolíticos dos Grupos C e G Isolados de Seres Humanos
Rachel Elise Cerqueira d’Oliveira
Orientadora: Profª. Angela Christina Dias de Castro
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Os estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G têm sido relatados recentemente com maior freqüência como agentes de infecções humanas graves. A alternativa mais utilizada para o tratamento destas infecções em pacientes alérgicos à penicilina são os macrolídeos. Neste trabalho foi detectada a prevalência da resistência aos macrolídeos nesses microrganismos na cidade do Rio de Janeiro pela determinação da concentração mínima inibitória para 109 amostras coletadas entre os anos de 1994 e 2002. Foi observada uma taxa de resistência de 13,7% na subespécieStreptococcus dysgalactiae equisimilis, e a ausência de amostras resistentes entre as espécies pertencentes ao grupo dos estreptococos “anginosus”.
De acordo com os resultados encontrados com os testes de duplo-disco difusão e de PCR, foi possível detectar que a resistência observada está relacionada aos três mecanismos fenotípicos e genotípicos de resistência comumente encontrados em estreptococos, sendo o fenótipo de resistência MLSB indutiva prevalente, assim como o gene ermTR. O seqüenciamento dos genes de resistência aos macrolídeos presentes em algumas das amostras estudadas revelou que os genes da classe erm encontrados em nosso meio são os mesmos já seqüenciados para outros microrganismos, entretanto, os genes da classe mef apresentam mutações, sendo um deles considerado uma nova variante do gene mef. Utilizando a técnica de PFGE foram observadas relações clonais significativas entre as amostras resistentes aos macrolídeos pelo mecanismo MLSB, sugerindo a disseminação clonal dessas amostras. Devido ao recente aumento nos relatos de infecções graves causadas por estes microrganismos e à possibilidade de uma rápida emergência na resistência aos macrolídeos como já foi relatada em outros países, tornam-se cada vez mais importantes os estudos de resistência aos macrolídeos em estreptococos, para que seja possível prevenir a emergência da resistência a esses antimicrobianos.
Palavras-chave: Estreptococos dos grupos C e G, Resistência, Macrolídeos Rio de Janeiro
Fevereiro/2006
Phenotypic and Genotypic Characterization of Macrolide Resistance in Group C and G Beta- Hemolytic Streptococci Isolated from Human Sources
Rachel Elise Cerqueira d’Oliveira
Orientadora: Profª. Angela Christina Dias de Castro
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Group C and G beta-Hemolytic streptococci have been reported to cause severe human invasive disease recently. Macrolides are the main alternative for treatment in penicillin allergic patients. We have detected rates of macrolide- resistance in 109 isolates from Rio de Janeiro between 1994 and 2002, by Minimum Inhibitorium Concentration method. In “anginosus” group no isolate showed resistance to macrolides, but in Streptococcus dysgalactiae equisimilis 13,7% were macrolide-resistant. Using the double-disk test and PCR we have noticed that all the 3 known phenotypic and genetic mechanisms of macrolide-resistance in streptococci are found among our isolates, with iMLSB phenotype and ermTR gene being prevalent. According to sequencing of macrolide-resistant genes, we could observe that erm genes present in our isolates have been found in other bacterial species.
However, mefgenes have unique sequences. Based on this, we have characterized a new mef variant. Genomic analysis by PFGE, showed that erm isolates have clonal relationships, suggesting a clonal dissemination of these resistant strains. The growing number of macrolide-resistance in streptococci is an increasing concern worldwide. Studies regarding this problem are required to avoid high rates of macrolide-resistant streptococci.
Key-Words: Estreptococos dos grupos C e G, Resistência, Macrolídeos
Rio de Janeiro Fevereiro/2006
Introdução ... 09
1. Gênero Streptococcus ... 09
2. O grupo “anginosus” ... 10
3. O grupo “piogênico”: espécie Streptococcus dysgalactiae ... 11
4. Susceptibilidade à penicilina ... 12
5. Resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas ... 13
6. Estudos de diversidade genética ... 27
Objetivos ... 31
Material e Métodos ... 33
1. Amostras Bacterianas ... 34
2. Identificação das amostras bacterianas ... 33
3. Testes de Susceptibilidade aos antimicrobianos ... 36
4. Caracterização dos fenótipos de resistência ... 37
5. Detecção dos genes de resistência MLSB ... 39
6. Seqüenciamento dos genesmefeerm ... 41
7. Análise dos perfis de fragmentação do DNA genômico ... 43
Resultados ... 46
1. Identificação das amostras bacterianas ... 46
2. Testes de Susceptibilidade aos antimicrobianos ... 47
3. Caracterização dos fenótipos de resistência ... 48
4. Detecção dos genes de resistência MLSB ... 49
5. Seqüenciamento dos genesmefeerm ... 49
6. Análise dos perfis de fragmentação do DNA genômico ... 50
Discussão ... 64
Conclusões ... 82
INTRODUÇÃO
1. Gênero Streptococcus:
O gênero Streptococcus compreende um grupo heterogêneo de mais de 30 espécies bacterianas. Muitas espécies são constituintes da microbiota anfibiôntica de seres humanos e animais, enquanto outras são altamente patogênicas (Kilian, 1998; Bisno & Rijn, 2000). A taxonomia desse gênero está sendo submetido a freqüentes alterações. A diferenciação dos microrganismos pertencentes ao gênero Streptococcus é baseada em uma combinação de características que incluem o padrão hemolítico (alfa, beta, ou não hemolítico) observado em meios de cultura contendo sangue, a composição antigênica e as características de crescimento e metabolismo.
Uma das mais importantes classificações utilizadas para a caracterização dos estreptococos (especialmente os beta-hemolíticos) é a classificação em grupos sorológicos de Lancefield, baseada em um antígeno carboidrato presente na parede celular (Lancefield, 1933). Embora tenha sido de grande valor para a diferenciação entre os principais patógenos e outros estreptococos beta-hemolíticos, esta classificação não tem valor taxonômico. O grupo sorológico não representa, na maioria das vezes, uma espécie microbiana. Microrganismos de uma mesma espécie podem apresentar diferentes grupos sorológicos, assim como microrganismos de espécies diferentes podem apresentar o mesmo grupo sorológico (Brandt et al., 1999). Mesmo assim, a sorogrupagem permanece como um instrumento útil para a identificação destes microrganismos.
Recentemente, uma ferramenta muito importante para a identificação e classificação de estreptococos tem sido a análise comparativa de características genéticas como a da seqüência do rRNA 16S (Piscitelli et al., 1992; Brandt et al., 1999). De acordo com essa metodologia, o gênero Streptococcus foi dividido em 6 grupos principais: anginosus (também conhecido como grupo milleri), bovis, mitis, mutans, piogênico e salivarius. Algumas espécies não foram alocadas em nenhum desses grupos (Kawamura et al., 1995). Facklam (2002) reorganizou o esquema de identificação, alocando as espécies em grupos relacionados fenotipicamente através de poucos testes microbiológicos. Dessa forma, é apresentado um esquema simples para a identificação de estreptococos beta-hemolíticos, não beta-hemolíticos e ainda para a identificação de espécies incomuns.
Muitas espécies de Streptococcus causam doenças em seres humanos. No entanto, poucas são consideradas altamente virulentas e responsáveis por doenças graves. Dentre estas, estão as espécies S. pyogenes, S. agalactiae e S.
pneumoniae (Klein, 1995; Muñozet al., 1997).
Dentre os estreptococosβ-hemolíticos, oS. pyogenes (grupo A de Lancefield) e o S. dysgalactiae (grupos C ou G), ambos pertencentes ao grupo “piogênico” de Kawamura (1995), são os microrganismos mais freqüentemente isolados do trato respiratório superior humano. Embora menos freqüentes, representantes beta- hemolíticos do grupo conhecido como “anginosus” (que podem possuir antígenos de grupo A, C, F, G ou ainda, nenhum dos antígenos), também são isolados deste sítio anatômico (Horton et al., 1992; Piscitelliet al.,1992).
Os estreptococos dos grupos C e G de Lancefield, até o final da década de 1970, eram reconhecidos como causa de infecções apenas em animais. Relatos de infecções humanas causadas por estes microrganismos eram raros. Entretanto, a
partir da década de 1980, foi demonstrado o potencial patogênico destes microrganismos em infecções humanas, relacionadas principalmente a surtos de faringite e ocasionalmente a doenças invasivas sistêmicas como septicemia, endocardite, meningite e bacteremia, sendo a maioria dos pacientes imunocomprometidos (Efstratiou, 1989; Schugk et al., 1997).
A taxonomia dos estreptococos dos grupos C e G é confusa. Atualmente, são reconhecidas seis espécies. É possível realizar uma diferenciação fenotípica inicial pelos tipos de colônias. Aqueles formadores de colônias pequenas pertencem ao grupo dos estreptococos “anginosus”, compreendendo as espécies S. anginosus, S.
intermedius e S. constellatus. As amostras formadoras de colônias grandes pertencem ao grupo dos estreptococos “piogênicos”. Entre estas, a espécie S. equi, contém 2 subespécies: S. equi equi e S. equi zooepidemicus e compreende os estreptococos beta-hemolíticos do grupo C isolados de animais, principalmente eqüinos (Farrow & Collins, 1984). A espécieS. canis, compreende os estreptococos do grupo G isolados de animais, especialmente caninos e felinos (Devriese et al., 1986). Uma terceira espécie, S. dysgalactiae, possui a subespécie S. dysgalactiae dysgalactiae, a qual compreende os estreptococos alfa-hemolíticos do grupo C isolados principalmente de bovinos. A outra subespécie, S. dysgalactiae equisimilis compreende os estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G isolados de seres humanos, além dos estreptococos também beta-hemolíticos do grupo L isolados principalmente de animais (Vieira et al., 1998). Recentemente, foram relatadas amostras de estreptococos beta-hemolíticos do grupo A pertencentes à subespécie S. dysgalactiae equisimilis(Brandt et al.,1999).
2. O grupo “anginosus”
O grupo dos estreptococos “anginosus” é constituído pelas espécies S.
anginosus, S. intermedius e S. constellatus, representando um grupo heterogêneo e complexo que está assumindo um papel importante em infecções piogênicas graves (Bantar et al., 1996). Estes microrganismos pertencem à classe dos estreptococos
“viridans”, se destacando dos demais componentes desta classe pela grande tendência em causar infecções supurativas (Piscitelli et al., 1992; Jacobs &
Stobberingh, 1996; Aracil, Gomez-Garces e Alós et al., 1999). Os estreptococos incluídos neste grupo apresentam uma grande variedade de características fenotípicas: podem ser alfa, beta ou não hemolíticos; podem apresentar uma variedade de antígenos de Lancefield (A, C, F, G, ou podem ser não sorogrupáveis) e possuem diferenças no padrão de fermentação de carboidratos. Estas diferenças geraram várias modificações na sua denominação durante os últimos anos, e talvez por isso, estes microrganismos não sejam freqüentemente identificados no laboratório clínico, com conseqüente diagnóstico inadequado e tratamento muitas vezes incorreto (Molina et al., 1991; Gómez-Garcés et al., 1994). Os estreptococos
“anginosus” possuem habitat e potencial de patogenicidade muito variados podendo ser isolados de muitos sítios anatômicos (Gómez-Garcés, Alós e Cogollos 1994).
São membros da microbiota anfibiôntica da orofaringe, cavidade oral, trato gastro- intestinal e trato gênito-urinário feminino, porém têm sido encontrados como agentes etiológicos de faringite, abscessos, bacteremia e endocardite, geralmente relacionados a condições de imunocomprometimento (Molina et al., 1991; Horton et al., 1992; Baqueroet al., 1999). Estes microrganismos usam como porta de entrada o trato gastro-intestinal, a orofaringe, infecções dentais, cateteres, dentre outros,
podendo ser encontrados em culturas puras ou mistas (Molina et al., 1991). Os estreptococos “anginosus” formam colônias muito pequenas e para o seu crescimento necessitam de concentrações maiores de CO2 do que aquelas encontradas no ambiente. Além disso, produzem um odor característico de caramelo quando cultivados em meio de ágar-sangue (Piscitelli et al., 1992). Neste trabalho, foram estudadas as amostras de estreptococos “anginosus” beta- hemolíticas com antígenos de grupo C ou G de Lancefield.
3. O grupo “piogênico”: espécie Streptococcus dysgalactiae
A espécie S. dysgalactiae consiste de microrganismos adaptados a determinados hospedeiros e que possuem importância na medicina humana e veterinária. A subespécie S. dysgalactiae equisimilis, tem sido reconhecida pelo seu potencial patogênico. Tanto os microrganismos do grupo C quanto aqueles pertencentes ao grupo G de Lancefield têm espectro clínico similar, podendo causar uma variedade de doenças, desde faringite aguda a infecções graves como septicemia, meningite, celulite e endocardite (Tuazon, 1980; Efstratiou, 1989;
Cimolai et al., 1991; Bisnoet al., 1996; Tsambiraset al., 1998; Sylvetsky et al., 2002;
Erdem et al., 2003). Mais recentemente foram descritos na literatura alguns casos de estreptococos dos grupos C e G causando a Síndrome do Choque Tóxico e fascite necrosante (Kugi et al., 1998; Sharma, Khatib, Fakih, 2002; Korman et al., 2004). Muitas destas infecções ocorrem em indivíduos com alguma condição de susceptibilidade, como diabetes, alcoolismo, terapias imunossupressivas, neoplasias ou idade avançada (Koneman et al., 1992). Cimolai e colaboradores (1991)
enfatizaram a importância destes microrganismos na faringite, recomendando a pesquisa para estreptococos dos grupos C e G formadores de colônias grandes nesses casos. Dentre os casos de faringite bacteriana, os estreptococos dos grupos C e G constituem a etiologia mais freqüente após a espécie S. pyogenes (Pichichero, 1992).
Além das infecções causadas por esses microrganismos, é relatado o aparecimento da glomerulonefrite aguda difusa como uma seqüela de infecções causadas por estreptococos dos grupos C e G (Efstratiou, 1989; Almroth et al., 2005).
4. Susceptibilidade à penicilina:
O tratamento recomendado para as infecções causadas por estreptococos beta-hemolíticos é a penicilina, pela sua eficácia, segurança e baixo custo (Bisno et al., 1997). Mesmo após 50 anos de uso extensivo, e algumas vezes indiscriminado deste antimicrobiano, a susceptibilidade à penicilina se mantém uniforme entre os estreptococos piogênicos isolados de infecções humanas.
Entretanto, as falhas no tratamento de infecções causadas por estreptococos piogênicos com penicilina têm emergido como um problema freqüente. Estas falhas se relacionam à dificuldade em erradicar o patógeno responsável pela infecção, podendo o paciente permanecer com os sintomas (falhas clínicas) ou como portador assintomático do microrganismo (falhas bacteriológicas) (Ross, Holm e Kedah, 1985).
Pichichero (1992), propôs uma variedade de hipóteses para justificar estas falhas no tratamento. Entre elas, é possível destacar a presença de microrganismos pertencentes à microbiota anfibiôntica produtores de beta-lactamase. A beta- lactamase degrada o antimicrobiano, o que explicaria porque antimicrobianos que resistem à beta-lactamase são mais eficazes do que a penicilina no tratamento destas infecções. Além desta hipótese, Pichichero (1992) sugeriu também que as falhas podem estar associadas à eliminação pela ação da penicilina da microbiota (principalmente estreptococos alfa-hemolíticos) que compete por sítios de ligação no epitélio da faringe com estreptococos beta-hemolíticos ou ao fenômeno da tolerância à penicilina. Embora a tolerância à penicilina tenha sido demonstrada em vários estudos, há um consenso de que este fenômeno não tem relevância clínica quando relacionado aos estreptococos do grupo A (Kaplan, 1997).
A resistência intermediária à penicilina nunca foi relatada para estreptococos do grupo A. Entretanto, nos outros grupos sorológicos este perfil de susceptibilidade já foi relatado em alguns países (Traub & Leonhard, 1997; Wu et al., 1997). Relatos sobre a susceptibilidade aos antimicrobianos considerando a subespécie S.
dysgalactiae equisimilis são raros. Freqüentemente, encontram-se na literatura características de resistência relacionadas aos grupos sorológicos C e G de estreptococos beta-hemolíticos. Pfaller e Jones (1997), relataram que as amostras de estreptococos beta-hemolíticos analisadas nos Estados Unidos foram altamente sensíveis à penicilina com exceção de uma do grupo B e uma do grupo C que apresentaram resistência intermediária. Em 1997, na Alemanha, foram relatadas duas amostras do grupo C com susceptibilidade intermediária à penicilina (Traub &
Leonhard, 1997). Da mesma forma, entre 1993 e 1994 em Taiwan, foi relatada uma amostra do grupo C com susceptibilidade intermediária a esta droga, o que implicou
na necessidade de maiores doses de penicilina ou na combinação com outro antimicrobiano para o tratamento (Wu et al., 1997). Um relato de uma amostra de estreptococos do grupo C resistente à penicilina foi publicado por Eltringham e Hutchinson (1997). A amostra foi isolada de um quadro de faringite a partir de uma cultura pura e apresentou-se resistente à penicilina pelo teste de difusão em ágar.
Foi encontrada uma concentração mínima inibitória de 2mg/L para a penicilina e de 4mg/L para a ampicilina. Infelizmente, estudos mais aprofundados não puderam ser realizados, pois segundo os autores, a referida amostra perdeu a viabilidade. Com isso, não foi possível identificar a amostra como pertencente à subespécie S.
dysgalactiae equisimilis ou ao grupo “anginosus”. No grupo dos estreptococos
“anginosus” tem sido observada uma emergência da resistência à penicilina, a qual representa um problema clínico potencial na terapêutica das infecções causadas por esses microrganismos (Bantar et al., 1996). Na Espanha, foi observada uma taxa de 5,6% de amostras com resistência intermediária à penicilina neste grupo de estreptococos em amostras coletadas entre 1991 e 1996, principalmente na espécie S. constellatus (Limia et al., 1999). Jacobs e Stobberingh (1996) encontraram entre 1991 e 1994, 1,4% de amostras com resistência intermediária na Holanda, e Aracil, Gomes-Garcés e Alós, em 1995, detectaram que 7% das amostras pertencentes a este grupo coletadas na Espanha, apresentavam o mesmo perfil. Na Argentina foram detectadas 9% de amostras com resistência intermediária e 3% resistentes à penicilina (Bantaret al., 1996), sendo a maior incidência de resistência na espécie S.
anginosus. No Texas, Tracy e colaboradores (2001) encontraram 2 amostras de S.
constellatus e 2 deS. anginosuscom resistência intermediária à penicilina.
Quando é encontrada a alta incidência de falhas no tratamento com esse antimicrobiano, terapias alternativas para a erradicação do patógeno devem ser
consideradas devido à emergência das complicações sérias conseqüentes de infecções estreptocócicas.
5. Resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas:
Nos casos de falhas no tratamento com penicilina, bem como para pacientes alérgicos aos antimicrobianos beta-lactâmicos, o antimicrobiano recomendado para o tratamento de infecções causadas por estreptococos beta-hemolíticos foi durante muito tempo a eritromicina e mais recentemente, a azitromicina.
A eritromicina inibe a síntese de proteínas pela célula bacteriana através da sua ligação à subunidade 50S do ribossomo estimulando a dissociação da molécula de peptidil-tRNA do ribossoma durante o alongamento, interrompendo desta forma a síntese da cadeia proteica. A eritromicina é produzida por Saccharopolyspora erythraea, e quimicamente, apresenta-se como um anel de lactona, ligado a aminoaçúcares ou açúcares neutros, pertencendo à classe dos macrolídeos (Roberts et al., 1999).
Os macrolídeos comercialmente disponíveis podem possuir 14, 15 ou 16 elementos no anel de lactona, diferindo nas suas características químicas, propriedades farmacocinéticas e resposta aos mecanismos de resistência bacterianos, mas apresentando o mesmo mecanismo de ação (Leclercq & Courvalin, 1991).
A eritromicina é um macrolídeo de 14 elementos e foi introduzida em 1952 como o primeiro antimicrobiano desta classe, sendo eficaz para microrganismos Gram-positivos e cocos Gram-negativos. Alguns fatores, entretanto, limitaram a
utilização da eritromicina, como por exemplo problemas gastrintestinais freqüentes e uma meia-vida curta no soro.
Recentemente foram desenvolvidos os “novos macrolídeos” por substituições químicas na estrutura da eritromicina. Os “novos macrolídeos” apresentam várias vantagens sobre a eritromicina, relacionadas a um aumento na atividade antimicrobiana, e por serem compostos mais estáveis ao pH encontrado no estômago reduzindo a intolerância gastrintestinal. Além disso, a meia-vida maior e a melhor penetração tecidual permitem a administração apenas uma ou duas vezes por dia, por poucos dias, e a obtenção de maiores concentrações nos tecidos. Em 1992, o FDA (Food and Drug Administration) aprovou dois desses agentes, a azitromicina e a claritromicina para o uso clínico (Zuckerman, 2000). A claritromicina é um macrolídeo de 14 elementos e atividade semelhante ou superior à da eritromicina para estafilococos e estreptococos e consideravelmente superior para Chlamydia trachomatis. A azitromicina, um macrolídeo de 15 elementos, apresenta maior atividade para microrganismos Gram-negativos, provavelmente devido à maior capacidade para atravessar a membrana externa desses microrganismos (Zuckerman, 2000). Frequentemente a azitromicina é encontrada na literatura como um antimicrobiano azalídeo, uma subclasse dos macrolídeos, por apresentar diferenças químicas significativas com relação aos outros macrolídeos. Com relação à farmacocinética e à farmacodinâmica, a eritromicina e a claritromicina são semelhantes. A única diferença importante é a melhor absorção da claritromicina, o que melhora a sua biodisponibilidade. Uma diferença marcante entre a azitromicina e os demais macrolídeos, é com relação à meia-vida, que para a eritromicina e claritromicina fica em torno de 3,5 a 5 horas, enquanto para a azitromicina é de 68h, resultando num número menor de doses diárias e principalmente uma redução no
tempo de tratamento. Os três antimicrobianos apresentam atividade in vitro equivalente contra patógenos Gram positivos. Além desses, são encontrados vários outros macrolídeos de 14 e de 16 elementos, incluindo a espiramicina, um macrolídeo de 16 elementos disponível para a utilização clínica em alguns países (Kirst & Sides, 1989).
Em 1959, Lowbury e Hurst relataram pela primeira vez a resistência à eritromicina em estreptococos na espécie S. pyogenes em uma amostra isolada de uma unidade de tratamento de queimados no Reino Unido. Durante os 15 anos seguintes, relatos sobre este problema foram raros. Entretanto, na década de 1970, foram registradas no Japão taxas alarmantes de resistência à eritromicina em S.
pyogenes, superiores a 60%, provavelmente devido ao uso extensivo do antimicrobiano para o tratamento de infecções do trato respiratório naquele período (Maruyamaet al., 1979).
A partir de 1990, uma emergência na taxa de resistência à eritromicina entre os estreptococos beta-hemolíticos passou a ser observada em vários países(Cocuzza et al., 1997; Kriebernegg et al., 1998; Melo-Cristino e Fernandes, 1999). Na espécie S. pyogenes é possível encontrar taxas de resistência em torno de 21% a 36% na Europa (Kriebernegg et al., 1998; Melo-Cristino e Fernandes, 1999) e de até 63% em Taiwan (Yan et al., 2000). Nos outros grupos sorológicos são encontrados poucos relatos disponíveis na literatura referentes à resistência à eritromicina. Em Taiwan foram detectadas taxas elevadas de resistência à eritromicina nos grupos C (41,7%) e G (23,5%), mostrando que a eritromicina tem pouca atividade para estes microrganismos, abolindo o papel dos macrolídeos no tratamento alternativo empírico neste país (Wu et al., 1997). Entre os estreptococos
“anginosus” já foram relatadas taxas de resistência à eritromicina de 17% na
Espanha (Limia et al., 1999). No grupo dos estreptococos “anginosus”, Gomes- Garces e colaboradores (1994) relataram uma taxa de resistência à eritromicina de 14% em amostras coletadas entre 1992 e 1994.
Por outro lado, taxas baixas de resistência à eritromicina são encontradas em outras partes do mundo (Mhalu & Hofstad, 1997; Traub & Leonhard, 1997; Weiss et al., 1997). Em um trabalho realizado anteriormente em nosso laboratório, a taxa de resistência à eritromicina para amostras isoladas no Rio de Janeiro, entre 1994 e 1999, foi de 1,6% para S. pyogenes e 5,4% para S. agalactiae (d’Oliveira et al., 2003a, 2003b). Kataja e colaboradores (1998b), na Finlândia, entre 1992 e 1995, encontraram 3,6% de resistência à eritromicina entre estreptococos do grupo C e 3,5% no grupo G. Em um estudo realizado na Alemanha foi encontrado 6% de resistência em estreptococos dos grupos sorológicos C e G (Traub & Leonhard, 1997). Na Holanda, entre 1991 e 1994, no grupo dos estreptococos “anginosus” foi detectada taxa de 2,6% de resistência à eritromicina, relacionada às espécies S.
anginosus eS. constellatus(Jacobs & Stobberingh, 1996). Neste mesmo país, entre amostras coletadas no período de 1995 a 1999, a taxa de resistência à eritromicina detectada foi de 3,2%, sendo encontrada principalmente na espécie S. anginosus (Jacobs et al., 2001). Em um trabalho realizado na Argentina com este mesmo grupo de microrganismos, coletados entre 1992 e 1995, foram detectadas 2 amostras resistentes, 1 da espécie S. anginosuse a outra da espécie S. constellatus (Bantar et al., 1996).
Devido ao aumento na utilização de macrolídeos para o tratamento da faringite e infecções do trato respiratório superior e inferior, foi realizado um trabalho de vigilância da resistência à eritromicina em estreptococos beta-hemolíticos nos Estados Unidos. Foram encontradas taxas de resistência à eritromicina variando de
0 a 11% nos diversos grupos sorológicos de estreptococos beta-hemolíticos, sendo que as taxas mais elevadas foram detectadas para microrganismos do grupo C (Carrol et al., 1997). Em um estudo realizado na Finlândia, com amostras de estreptococos beta-hemolíticos obtidas a partir de cultura de sangue, foi observado que no grupo C, todas as amostras foram uniformemente sensíveis à eritromicina, enquanto no grupo G, 12% apresentaram-se como resistentes (Schugk et al., 1997).
Nos Estados Unidos, foram encontradas 3 amostras pertencentes ao grupo G e 1 pertencente ao grupo C resistentes à eritromina (Zaoutis, 1999).
Com relação aos outros macrolídeos foram detectadas na Alemanha taxas de resistência intermediária à claritromicina de 3,8% e 2,9%, nos grupos C e G respectivamente (Traub & Leonhard, 1997). Nos Estados Unidos, Carroll e colaboradores (1997) encontraram 12% de amostras resistentes tanto para a claritromicina quanto para a azitromicina no grupo C e 6% de resistência à claritromicina e 2% de resistência à azitromicina no grupo G. Em Taiwan foi detectada taxa de 83% e 29% de resistência à azitromicina nos grupos C e G, respectivamente (Wuet al.,1997).
Três mecanismos principais são responsáveis pela resistência à eritromicina em bactérias: a inativação enzimática da eritromicina, a modificação do sítio alvo e o efluxo ativo da droga (Leclercq & Courvalin, 1991; Sutcliffe, Tait-Kamradt e Wondrak, 1996b). Nenhuma forma de inativação enzimática de macrolídeos foi descrita até o momento para os estreptococos.
Em estreptococos, assim como em muitas outras bactérias Gram-positivas, a modificação do sítio alvo é um mecanismo comum de resistência à eritromicina.
Este mecanismo é mediado por uma metilase. Esta enzima adiciona dois grupamentos metil a um resíduo de adenina do rRNA 23S. A metilação resulta em
uma alteração conformacional no ribossoma, levando a uma diminuição da ligação de macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B (os quais embora quimicamente distintos apresentam mecanismo de ação semelhante e sítios alvo sobrepostos) ao seu sítio alvo na subunidade 50S ribossomal, caracterizando a chamada resistência MLSB(macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B). Nos últimos 30 anos, foi descrita uma grande quantidade de diferentes metilases em vários gêneros bacterianos. Em geral os genes que codificam estas metilases são conhecidos como erm(erythromycin ribosome methilation) (Robertset al., 1999).
A produção da metilase pode ser constitutiva ou indutiva. A produção constitutiva ocorre quando a enzima é produzida continuamente. Ao contrário, quando é indutiva, há necessidade de um antimicrobiano indutor para a sua produção (Leclercq & Courvalin, 1991). Neste caso, há resistência a baixas concentrações de alguns macrolídeos, incluindo à eritromicina e em presença destes, a bactéria torna-se resistente aos demais macrolídeos, aos lincosamídeos e às estreptograminas B (Leclercq & Courvalin, 1991).
Uma grande variedade de metilases foram descritas para bactérias Gram- positivas. No entanto, duas classes de genes erm estão associadas à resistência à eritromicina em estreptococos beta-hemolíticos: ermB e o recentemente descrito ermTR, o qual apresenta 82% de similaridade com a seqüência do gene ermA associado a este fenótipo emStaphylococcus aureus e apenas 58% de similaridade com o gene ermB (Leclercq & Courvalin, 1991; Seppälä et al., 1998). Utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é possível observar que ambos os genes podem estar associados aos fenótipos de resistência MLSBindutiva ou constitutiva (Seppäläet al., 1998).
Recentemente, um novo mecanismo de resistência à eritromicina foi descrito para S. pyogenes e S.pneumoniae no qual ocorre uma mutação nos genes que codificam as proteínas ribosomais L4 ou L22 (Bingen et al., 2002; Leclercq et al., 2002). Nestes casos, as amostras são resistentes aos macrolídeos, mas em geral não apresentam os genes erm.
Até 1993, a modificação no sítio alvo do antimicrobiano era o único mecanismo conhecido de resistência à eritromicina em S. pyogenes. Porém, no início dos anos 90, houve um aumento nas taxas de resistência à eritromicina emS.
pyogenes na Finlândia e foi observado que várias amostras apresentavam um mecanismo de resistência diferente daqueles já relatados na literatura. Um fenótipo até então desconhecido de resistência à eritromicina foi identificado em S.
pyogenes, no qual as amostras resistentes a esta droga permaneciam sensíveis aos lincosamídeos como a clindamicina, mesmo após a indução com eritromicina (Seppälä et al., 1993). Sutcliffe, Tait-Kamradt e Wondrak (1996b) concluíram que o mecanismo de resistência relacionado a este novo fenótipo é o efluxo ativo da droga, e demonstraram que as amostras com este fenótipo possuem uma bomba de efluxo dependente de energia que mantém os níveis intracelulares de eritromicina baixos. Tal resistência está associada à expressão de um gene descrito como mefA (macrolide efflux) (Clancy et al., 1996). A proteína codificada pelo gene mefA, está relacionada a uma resistência específica para os macrolídeos de 14 e 15 elementos como eritromicina, azitromicina e claritromicina. Os macrolídeos de 16 elementos, lincosamídeos e estreptograminas B permanecem ativos. Este fenótipo é conhecido como fenótipo M (Sutcliffe, Tait-Kamradt e Wondrak, 1996b). Na espécie S.
pneumoniae foi descrito pela primeira vez o gene mefE , o qual tem 90% de similaridade com o gene mefA (Sutcliffe et al., 1996a; Tait-Kamradt et al., 1997). O
gene mefE foi encontrado também na espécie S. agalactiae e no grupo dos estreptococos “anginosus”, além do gene mefA (Arpin et al., 1999; Jacobs, et al., 2001). Roberts e colaboradores (1999), observando a grande similaridade entre os dois genes, sugeriram que fossem considerados como uma única classe, mefA, e que a sua diferenciação não seria necessária. Entretanto, del Grosso e colaboradores (2002) analisando as diferenças encontradas nas características das amostras de S. pneumoniae que apresentam o gene mefA e nas características daquelas que apresentam o gene mefE sugeriram que a distinção entre os dois genes deve ser mantida. De qualquer forma, os iniciadores utilizados para a detecção dos genes pela técnica de PCR na literatura são idênticos, e a distinção se faz pelo seqüenciamento do gene (Robertset al., 1999).
As amostras com resistência MLSB constitutiva, costumam apresentar resistência a altas concentrações de todos os antimicrobianos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B, enquanto as amostras com resistência MLSB
indutiva ou com fenótipo M costumam apresentar resistência apenas a baixas concentrações (Cocuzza et al., 1997; de Azavedo et al., 1999; Portillo et al., 1999;
Jacobs et al., 2001).
Na maior parte do mundo, o fenótipo de resistência à eritromicina mais encontrado em S. pyogenesatualmente é o fenótipo M, com uma proporção muitas vezes próxima a 100% como foi detectada na Suécia, Finlândia, Canadá, Áustria, Chile e Bélgica (Jasir & Schalén, 1998; Kataja et al., 1998a; Kriebernegg et al., 1998; de Azavedo et al., 1999; Descheemaekeret al., 2000; Palavecinoet al., 2001).
Em alguns locais porém, o fenótipo de resistência MLSB constitutiva ou indutiva é predominante como ocorre na França, Portugal, Itália e Espanha (Cocuzza et al., 1997; Gómes-Lus et al., 1999; Melo-Cristino e Fernandes, 1999; Bingen et al.,
2000). Em nosso laboratório, foi observado que na espécie S. pyogenes, os fenótipos M e de resistência MLSB indutiva são encontrados na mesma proporção, não tendo sido encontradas amostras com resistência constitutiva à eritromicina nesta espécie (d’Oliveira et al., 2003a). Entre as amostras de S. agalactiae, nós observamos uma prevalência do fenótipo de resistência MLSB indutiva, embora os outros dois mecanismos de resistência também tenham sido detectados (d’Oliveira et al., 2003b). Entre os microrganismos pertencentes aos grupos C e G, Kataja e colaboradores (1998b), na Finlândia, entre 1992 e 1995, observaram que o fenótipo M prevalece no grupo C, mas em contrapartida no grupo G, o fenótipo prevalente é o de resistência MLSB indutiva, mostrando uma diferença entre os mecanismos de resistência nos dois grupos sorológicos. Nos grupos C e G, Wu e colaboradores (1997) observaram a predominância do fenótipo de resistência MLSBconstitutiva em Taiwan. Em um trabalho realizado na Espanha com os grupos A, C e G, 93% das amostras resistentes à eritromicina apresentaram o fenótipo M (Baquero et al., 1999). No grupo dos estreptococos “anginosus”, foi observada a prevalência do fenótipo de resistência MLSB constitutiva na Holanda (Jacobs et al., 2001). A identificação da prevalência do fenótipo M em estreptococos tem implicações nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos e pode ter impacto na escolha da terapia antimicrobiana na clínica prática (Sutcliffeet al., 1996b).
Uma taxa elevada de erradicação dos estreptococos beta-hemolíticos tem sido observada após o tratamento com clindamicina, mas o uso freqüente deste agente não é apropriado, devido aos seus efeitos colaterais que apesar de não serem freqüentes são graves (Pichichero, 1992). Estes efeitos estão relacionados principalmente ao desconforto abdominal com alta incidência de diarréia (2 a 20%).
Aproximadamente 10% destes pacientes desenvolvem colite pseudomembranosa (Kieserman, Williams e Linstrom, 1995).
As taxas de resistência à clindamicina são variáveis de acordo com a região analisada, mas costumam ser baixas para S. pyogenes, como pode ser observado na Alemanha, em Israel, na Itália e no Brasil (Traub & Leonhard, 1997; Weiss et al., 1997; Basseti et al., 2000; d’Oliveira et al., 2003a). Dentre os microrganismos pertencentes ao grupo C, Kataja e colaboradores (1998b), em estudos desenvolvidos entre 1992 e 1995 na Finlândia, encontraram 1% de resistência. No grupo G foram encontradas 0,3% de amostras resistentes à clindamicina. Nos Estados Unidos, Carroll e colaboradores (1997) detectaram 2% de resistência à clindamicina no grupo G. Em Taiwan, entre 1993 e 1994 esta taxa ficou em torno de 67% no grupo C e 91% no grupo G (Wu et al., 1997). Nos grupos C e G, 3% das amostras mostraram-se resistentes à clindamicina na Alemanha (Traub & Leonhard, 1997). No grupo dos estreptococos “anginosus” foi detectada uma taxa de 2,4% das amostras resistentes à clindamicina na Holanda e 14% no Texas (Jacobs &
Stobberingh, 1996; Tracy et al., 2001). Também no grupo dos estreptococos
“anginosus”, na Espanha, foi encontrada uma taxa de 13% de resistência a este antimicrobiano (Gómez-Garcés, Alós e Cogollos, 1994). Em um trabalho realizado na Finlândia utilizando apenas amostras invasivas de estreptococos beta- hemolíticos, a resistência à clindamicina não foi detectada no grupo C. Entretanto, no grupo G, essa taxa foi de 4% (Schugket al., 1997).
6. Estudos de diversidade genética
Os estudos de diversidade genética podem ser realizados com a utilização de uma grande variedade de técnicas moleculares. A análise do DNA genômico pela fragmentação do DNA utilizando uma enzima de restrição pela técnica de eletroforese em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE), constitui um instrumento importante na epidemiologia molecular, sendo considerada no momento o método mais eficiente para a tipagem genotípica de estreptococos piogênicos, devido à sua reprodutibilidade, seu poder discriminatório e sua utilidade bem estabelecida para uma grande variedade de microrganismos, incluindo os estreptococos beta-hemolíticos (Bert, Branger e Lambert-Zechovsky, 1997a). As limitações do método envolvem o alto custo do equipamento, dos acessórios e dos reagentes e o extenso período de tempo necessário para a execução da metodologia.
De acordo com a metodologia da eletroforese em campo pulsado o grau de diversidade observado entre os perfis de fragmentação do DNA cromossômico indica o número de eventos mutagênicos que ocorreram e consiste em um critério importante na verificação da origem clonal de amostras da mesma espécie e na interpretação epidemiológica.
Vários trabalhos já foram realizados visando observar a variabilidade clonal entre as amostras de S. pyogenes e S. agalactiae resistentes aos macrolídeos.
Entretanto, para os estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G, estes relatos são raros. Em nosso laboratório, utilizando a técnica de PFGE com amostras de S.
pyogenes resistentes à eritromicina, observamos que entre as três amostras que apresentaram o fenótipo de resistência MLSB indutiva, duas mostraram-se idênticas,
e a outra não era relacionada às demais (d’Oliveiraet al., 2003a). Entre as amostras de S. agalactiaeonde foram encontrados os 3 mecanismos fenotípicos e genotípicos de resistência aos macrolídeos, foi observado que todas as amostras resistentes apresentavam perfis bem distintos após o PFGE (d’Oliveira et al., 2003b). Em um estudo realizado na Itália, utilizando a técnica de PFGE, foi observada uma grande variabilidade genética em todos os fenótipos de resistência (Valisena et al., 1999).
No Japão, entre as amostras de S. pyogenes coletadas entre 1981 e 1997, 17 amostras num total de 224 mostraram-se resistentes à eritromicina, sendo que entre estas, 14 possuíam o gene ermB e padrão idêntico de PFGE, indicando a disseminação de um único clone. Duas amostras apresentaram o gene ermTR e uma apresentou o gene mefA, mostrando que esses genes não se disseminaram no Japão (Murase et al., 2000). Em Taiwan foi verificado que dentre 42 amostras de S.
pyogenes resistentes à eritromicina coletadas entre 1992 e 1998, 40 apresentavam fenótipo de resistência MLSB constitutiva e o mesmo padrão clonal, sugerindo que os determinantes genéticos sejam cromossômicos (Yan et al., 2000). No Canadá, devido à grande variabilidade genética observada nas amostras que possuem o gene ermTR, foi sugerida a transferência horizontal deste gene entre amostras com origens genéticas diferentes (de Azavedo et al., 1999). Por outro lado, em um trabalho semelhante realizado na Califórnia, foi possível observar, também utilizando a técnica de PFGE, a presença de dois clones predominantes entre as amostras invasivas de S. pyogenes que apresentavam resistência MLSB indutiva à eritromicina, coletadas entre 1994 e 1995, sendo que um dos clones, apresentava uma característica interessante de resistência à bacitracina (Yorket al., 1999).
Kataja e colaboradores (1998a) analisaram as características clonais das amostras de S. pyogenes resistentes à eritromicina através da técnica de RAPD
(Randomically Amplified Polymorphic DNA). Foi observado que dentre as amostras que apresentavam o fenótipo M, 88% possuíam a mesma origem clonal, enquanto as demais mostraram-se estreitamente relacionadas, mostrando a disseminação de um clone de estreptococos do grupo A com um novo fenótipo de resistência à eritromicina, contribuindo significativamente para o aumento nas taxas de resistência à eritromicina na Finlândia. A pressão seletiva exercida pela eritromicina provavelmente teve papel importante na disseminação das amostras pertencentes ao clone prevalente. Na Bélgica, em amostras coletadas entre 1993 e 1997, apresentando o fenótipo M, foi observada uma grande variabilidade genética, sugerindo que o determinante para este mecanismo de resistência seja extracromossômico, e que apresente transferência horizontal, explicando a natureza policlonal da resistência (Descheemaeker et al., 2000). Em Taiwan, da mesma forma, entre as amostras que apresentavam o fenótipo M foram detectados muitos clones distintos, sugerindo a possível disseminação de um plasmídio de resistência, em função da emergência deste mecanismo de resistência em vários clones em um período muito curto (Yanet al., 2000). Na França, utilizando a técnica de RAPD com amostras de estreptococos “anginosus” que possuem o gene mefA, foi possível observar que esta característica de resistência é multiclonal (Arpin et al., 1999). Em um estudo realizado na Holanda, entre amostras pertencentes ao grupo dos estreptococos “anginosus”, foi possível observar que as amostras resistentes à eritromicina possuem características clonais distintas (Jacobs et al., 2001).
Em geral, os genes de resistência aos antimicrobianos no gênero estreptococos são carreados no cromossomo e freqüentemente associados a transposons conjugativos, embora possam ser também encontrados em plasmídios (Roberts et al., 1999).
Atualmente tem se observado um aumento nos relatos de infecções humanas, incluindo as doenças invasivas causadas por estreptococos beta- hemolíticos dos grupos C e G. Este fato pode ter sido influenciado primeiramente pela disponibilidade de sistemas sensíveis e específicos de grupagem sorológica ou, por um aumento na virulência, ou ainda pela expansão da população de hospedeiros imunocomprometidos. Devido ao recente aumento das infecções graves causadas por estes microrganismos e à possibilidade de uma rápida emergência na resistência à eritromicina, torna-se cada vez mais importante a vigilância constante quanto ao aparecimento da resistência à penicilina e o estudo da resistência à eritromicina e a outros macrolídeos, pelo fato de constituírem a alternativa mais utilizada para o tratamento destas infecções em pacientes alérgicos à penicilina.
OBJETIVOS
A resistência aos antimicrobianos em bactérias é um dos maiores problemas de Saúde Pública em todo o mundo. Atualmente, mesmo microrganismos como os estreptococos beta-hemolíticos que se mantém uniformemente sensíveis aos antimicrobianos novos e antigos, requerem vigilância cuidadosa devido à possibilidade do aparecimento ou aumento de resistência aos antimicrobianos mais utilizados no tratamento. Desde o início da década de 1990, nosso laboratório vem desenvolvendo projetos de pesquisa relacionados à resistência à eritromicina em estreptococos beta-hemolíticos dos grupos A, B, C, F e G. Com uma monografia e duas teses de Mestrado já defendidas, o nosso grupo de pesquisa vem contribuindo para o acúmulo de informações referentes a esses microrganismos, já que no Brasil, não é de nosso conhecimento estudos sistemáticos sobre a resistência aos antimicrobianos em estreptococos beta-hemolíticos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar a susceptibilidade dos estreptococos β- hemolíticos dos grupos C e G aos antimicrobianos macrolídeos e caracterizar os mecanismos de resistência a esses antimicrobianos, visando as seguintes estratégias de estudo:
Ê Estimar o perfil de susceptibilidade dos estreptococos beta-hemolíticos da subespécie S. dysgalactiae equisimilis e do grupo dos estreptococos
“anginosus”, coletados entre 1994 e 2002 na cidade do Rio de Janeiro, à penicilina, a alguns macrolídeos e à clindamicina, pela determinação da concentração mínima inibitória (CMI);
Ê determinar os mecanismos fenotípicos da resistência aos macrolídeos que estão sendo expressos, com a finalidade de observar se algum dos fenótipos conhecidos (iMLSB, cMLSBe M) é predominante nesta cidade;
Ê pesquisar entre os outros macrolídeos estudados além da eritromicina, a característica de indutor da resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas em amostras iMLSB.
Ê determinar os mecanismos genotípicos da resistência aos macrolídeos, pela detecção dos diferentes determinantes genéticos relacionados à resistência aos macrolídeos anteriormente descritos para o gênero estreptococos, utilizando a técnica de PCR.
Ê investigar a similaridade entre os genes relacionados à resistência aos macrolídeos encontrados, e os determinantes genéticos já conhecidos em outras espécies de estreptococos, com o objetivo de esclarecer se os genes são os mesmos nas diferentes espécies do gênero;
Ê analisar a diversidade genética entre as amostras estudadas pela comparação dos perfis de fragmentação do DNA genômico.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Amostras bacterianas
Foram estudadas 109 amostras de estreptococos beta-hemolíticos dos grupos C e G isoladas na comunidade, no período de 1994 a 2002 na cidade do Rio de Janeiro. As amostras são originárias de laboratórios particulares ou eventualmente isoladas no Laboratório de Patogênese e Resistência em Cocos Gram Positivos do IMPPG, UFRJ, por solicitação de médicos do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ. As amostras bacterianas foram isoladas a partir de orofaringe, lesão de pele, entre outros sítios anatômicos e foram mantidas em leite desnatado (10%) adicionado de glicerol (10%) a –20ºC.
2. Identificação das amostras bacterianas
A identificação de cada amostra foi realizada ou confirmada a partir da observação da morfologia colonial e do padrão hemolítico em meio sólido (Blood Agar Base, Oxoid, Hampshire, Inglaterra) contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro após incubação a 35ºC por 24h.
Colônias puntiformes, acinzentadas, circundadas por um halo de hemólise total (beta-hemólise) foram submetidas à coloração de Gram e observadas ao microscópio. Os cocos Gram-positivos foram testados quanto à capacidade de produzir a enzima catalase. Para esse teste, foi utilizada como controle positivo a
amostra de Staphylococcus aureus ATCC 25923. Como controle negativo, foi utilizada a amostra de S. pneumoniae ATCC 49619. Os microrganismos catalase- negativos foram grupados sorologicamente. Com as amostras positivas para os sorogrupos C ou G, foi realizado o teste de Voges-Proskauer (VP) para a diferenciação entre a subespécie S. dysgalactiae equisimilis e os estreptococos beta-hemolíticos classificados como estreptococos “anginosus” (Koneman et al., 1997; Facklam, 2002).
2.1 Grupagem sorológica
Para a grupagem sorológica das amostras bacterianas foi utilizado o Kit comercial para identificação de estreptococos (Streptococal Grouping Kit, Oxoid) de acordo com as recomendações do fabricante. Foram feitas suspensões de 2 a 5 colônias de estreptococos beta-hemolíticos em um tubo de ensaio com 0,4mL da enzima extratora. Em cada divisão de um cartão apropriado para a reação foi aplicada uma gota do soro específico para um dos grupos sorológicos (grupos A,B,C,F ou G) de estreptococos beta-hemolíticos. Sobre o soro foi adicionada uma gota da suspensão bacteriana a ser identificada. Após a homogeneização, a amostra foi identificada como pertencente ao grupo sorológico com o qual foi observada uma reação de aglutinação.
2.2Teste de Voges-Proskauer (VP)
Este teste detecta a presença da acetoína como produto metabólico, característico dos estreptococos “anginosus”. Algumas colônias de uma cultura pura
de cada amostra dos grupos C ou G crescida em meio de ágar sangue em atmosfera de 5% de CO2por 48h a 35ºC, foram transferidas para um tubo contendo 2mL de caldo VP (MR-VP Medium, Difco, Detroit, EUA). Após a incubação dos tubos a 35ºC por 48h foram adicionadas 5 gotas de α-naftol e 5 gotas de KOH a 40% adicionado de 3% de creatina. Os tubos foram agitados para uma maior aeração do meio e a leitura foi realizada após 5 minutos. O resultado positivo é representado pela produção de uma coloração avermelhada no meio de cultura (Facklam & Washington, 1991). As amostras que mostraram-se negativas no teste, foram classificadas como S. dysgalactiae equisimilis. As amostras positivas pertencem ao grupo dos estreptococos “anginosus”. Como controle positivo do teste foram utilizadas as amostras de estreptococos beta-hemolíticos do grupo F, 22/99 e 126/97 da coleção de culturas do laboratório.
2.3 Identificação das espécies de estreptococos “anginosus”
Todas as amostras estudadas foram submetidas à identificação fenotípica utilizando o sistema API 20 Strep (bioMerieux, Marcy l’Etoile, França) com o objetivo de confirmar os resultados obtidos pelo teste de VP e de identificar as amostras pertencentes ao grupo dos estreptococos “anginosus” ao nível de espécie (S.
anginosus, S. intermedius e S. constellatus). A identificação foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
3. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos:
A susceptibilidade aos antimicrobianos foi realizada pela determinação da CMI, utilizando o teste de diluição em ágar, o qual foi realizado segundo recomendações do NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2000).
As amostras bacterianas foram submetidas a testes para a determinação da menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano para os seguintes antimicrobianos: azitromicina, um macrolídeos de 15 elementos (Laboratório Teuto Brasileiro, Anápolis, Brasil); claritromicina, um macrolídeo de 14 elementos (Laboratório Medley S/A Indústria farmacêutica, Campinas, Brasil); clindamicina, um lincosamídeo; eritromicina, um macrolídeo de 14 elementos; espiramicina, um macrolídeo de 16 elementos e penicilina (Sigma, St. Louis, EUA).
Diluições duplas seriadas de antimicrobiano (2mL) foram adicionadas a 18 mL de meio ágar Müeller Hinton (Müeller Hinton Agar, Difco) adicionado de 5% de sangue desfibrinado de carneiro, o qual foi vertido em placas de Petri. As concentrações utilizadas, variaram entre 0,03 e 64µg/mL para todos os antimicrobianos testados, exceto para a penicilina, para a qual as concentrações testadas estavam entre 0,004 e 0,24µg/mL. Placas contendo meio ágar Müeller Hinton (Difco) sem antimicrobiano foram utilizadas como controle do crescimento bacteriano.
O inóculo foi preparado a partir de culturas crescidas por 24h a 35ºC em ágar sangue. Os microrganismos foram suspensos em solução salina (0,9%, p/v), cuja turvação foi ajustada ao grau 0,5 da escala de Mc Farland (aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL). As suspensões foram diluídas 1:10 em solução salina estéril,
resultando num inóculo de 107UFC/mL. Com o auxílio de um replicador do tipo Steers, 1 a 2 µL das suspensões foram transferidos para cada placa, resultando num inóculo bacteriano final de aproximadamente 104UFC/spot.
As placas foram incubadas por 20 a 24h a 35ºC em atmosfera de 5% de CO2. A CMI foi considerada a menor concentração de antimicrobiano que não permitiu a observação visual de crescimento bacteriano.
Como controle do teste foram utilizadas as cepas padrão de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 eStaphylococcus aureusATCC 29213.
Para a claritromicina, clindamicina e eritromicina foram consideradas resistentes as amostras que apresentaram CMI ≥ 1µg/mL, sensíveis aquelas com CMI ≤ 0,25µg/mL e com resistência intermediária aquelas com CMI = 0,5µg/mL.
Para a penicilina, foi considerada resistente a amostra que apresentou CMI ≥ 0,12µg/mL. Para a azitromicina, foram consideradas resistentes as amostras que apresentaram CMI ≥ 2µg/mL, sensíveis aquelas com CMI ≤ 0,5µg/mL e com resistência intermediária aquelas com CMI = 1µg/mL. (NCCLS, 2001). Para a espiramicina, foram considerados os mesmos valores utilizados para a azitromicina.
4. Caracterização dos fenótipos de resistência:
4.1. Método do duplo-disco
Para a determinação dos fenótipos de resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B, suspensões em salina (0,85%, p/v) de 1 a 2 x 108 UFC/mL (turvação equivalente ao grau 0,5 da escala de Mc Farland) das
amostras resistentes à eritromicina, foram semeadas com o auxílio de um swab estéril sobre a superfície de placas de Petri contendo meio ágar Mueller Hinton acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro com o objetivo de obter um crescimento uniforme e confluente. Sobre a semeadura, foi aplicado um disco de eritromicina (15µg) distante 15 mm de um disco de clindamicina (2µg) (CECON, São Paulo, Brasil). As placas foram incubadas a 35ºC em atmosfera ambiente (Seppälä et al., 1993; Mello-Cristino e Fernandes, 1999).
Após 24h foi observado o aspecto do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco de clindamicina. Para as amostras consideradas resistentes à clindamicina de acordo com os critérios de interpretação preconizados pelo NCCLS para testes de difusão de antimicrobianos (NCCLS, 2002), foi caracterizada a resistência MLSB constitutiva, revelando a produção contínua da enzima metilase, mesmo na região onde não há indução da resistência pela presença de eritromicina. Aquelas amostras que apresentaram halo uniforme de sensibilidade à clindamicina foram consideradas portadoras do fenótipo M (resistência apenas a macrolídeos). Quando foi observada uma redução do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco de clindamicina na região próxima ao disco de eritromicina, a amostra foi caracterizada como portadora de resistência MLSBindutiva. Neste caso, a redução do halo de inibição é resultado da indução da resistência à clindamicina exercida pela eritromicina difundida no meio de cultura (Seppäläet al., 1993).
4.2. Método da indução em caldo
Para confirmar os resultados obtidos pelo teste do duplo-disco, as amostras resistentes à eritromicina foram crescidas em meio THB (Todd Hewitt Broth, Difco) contendo concentração subinibitória (0,06µg/mL) de eritromicina. Após a incubação por 90min a 37ºC, as amostras foram submetidas à determinação da CMI para clindamicina pelo método de diluição em ágar como descrito anteriormente no item 3. Esperava-se que as amostras que apresentaram resistência MLSB indutiva pelo método do duplo-disco apresentassem um aumento considerável no valor da sua CMI para clindamicina após indução com concentração subinibitória de eritromicina quando comparada à CMI obtida sem indução prévia. As amostras com resistência MLSB constitutiva deveriam permanecer resistentes, enquanto aquelas que apresentaram o fenótipo M deveriam permanecer sensíveis à clindamicina (Seppälä et al., 1993).
Esta metodologia foi utilizada também para as amostras que possuíam resistência indutiva que apresentaram resistência a outro macrolídeo testado com o objetivo de observar se outros macrolídeos podem ser indutores da resistência.
Nesse caso as amostras com resistência indutiva foram submetidas ao crescimento em concentração subinibitória do macrolídeo e foi determinada a CMI para a clindamicina.
5. Detecção dos genes de resistência MLSB
Para a detecção dos diferentes determinantes genéticos responsáveis pelos mecanismos de resistência aos macrolídeos, lincosamídeos e estreptograminas B nas amostras estudadas foi utilizada a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).
Todas as amostras em estudo foram submetidas à amplificação do DNA com iniciadores específicos para os genes ermB, ermTR e mefA. Foram utilizadas as seguintes seqüências de iniciadores:
mefA → 5’ AGTATCATTAATCACTAGTGC 3’ e
5’ TTCTTCTGGTACTAAAAG TGG 3’ (Sutcliffeet al., 1996a).
ermB → 5’ GAAAAGGTACTCAACCAAATA 3’ e
5’ AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC 3’ (Sutcliffeet al., 1996a).
ermTR → 5’ GCATGACATAAACCTTCA 3’ e
5’ AGGTTATAATGAAACAGA 3’ (Seppäläet al., 1998).
As amostras foram semeadas em meio de ágar sangue e incubadas por 24h a 35ºC em atmosfera ambiente. O DNA total foi obtido a partir de uma suspensão bacteriana em 300µL de água estéril, a qual foi aquecida por 30min a 60ºC. Após o aquecimento, a amostra foi submetida à centrifugação por 3min a 12.000 x g e o sobrenadante foi desprezado. O sedimento foi ressuspenso em 50µL de água estéril, adicionado de 6µL de mutanolisina (5.000 U/mL) (Sigma). Após a incubação
a 37ºC por 30min, a amostra foi aquecida a 100ºC por 10min (http://www.cdc.gov/
ncidod/biotech/strep/protocols.html).
A reação de PCR consistiu em um volume final de 50µL contendo 0,2mM de dNTP; 0,5µM de cada iniciador; 0,5U de Taq polimerase; 10mM de tampão de reação; 2,0mM de MgCl2para a detecção dos genes ermBe ermTRe 4,0mM para o gene mefA (todos os reagentes obtidos da Boehringer Mannheim, Indianapolis, EUA) e 1µL do DNA da amostra.
Os ciclos de PCR consistiram em desnaturação inicial a 93ºC por 3min seguida de 35 ciclos de amplificação com desnaturação a 93ºC por 1min, anelamento a 52ºC por 1min e extensão a 72ºC por 1min. A última etapa de extensão foi à temperatura de 72ºC por 5min (Sutcliffe,et al., 1996a).
Para distinguir os produtos da amplificação foi realizada eletroforese em gel de agarose (Ultrapure, LifeTechnologies, Grand-Island, EUA) a 1,5% em tampão TBE 0,5X (Tris 0,05mM, EDTA 1,25mM, ácido bórico 0,05M).
O gel foi corado com brometo de etídio (0,5µg/mL) e a imagem captada no programa “Quantity One” (BioRad).
O tamanho dos produtos de PCR foi estimado usando marcador padrão (100 Base-Pair Ladder, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). Os tamanhos esperados para estes produtos foram: 639pb para o gene ermB, 206pb para o gene ermTR e 348pb para o genemefA(Sutcliffeet al., 1996a; Seppäläet al., 1998).
6. Seqüenciamento dos genes mefeerm
Com o objetivo de caracterizar qual dos dois determinantes genéticos, mefA ou mefE, é encontrado nos estreptococos dos grupos C e G isolados na nossa população e de comparar os genes encontrados com as seqüências conhecidas para outros estreptococos, foram selecionadas duas amostras portadoras de cada um dos genes para a realização do seqüenciamento.
Foram desenhados novos iniciadores a partir das seqüências gênicas depositadas no banco de dados genético (GenBank) os quais foram capazes de amplificar a seqüência completa dos 3 genes. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:
Gene mefA:
AEF1 : 5’ AGACCAAAAGCCACATTGTGGATTTAGGCCTGC 3’
AER1 : 5’ AACATTTCCTCCTGTCTATAATCGCATGCTTTC 3’
Gene ermB:
BF1 : 5’ ATGAACAAAAATATAAAATATTCTCAAAAC 3’
BR1 : 5’ TTATTTCCTCCCGTTAAATAATAGATAAC 3’
Gene ermTR:
TRF1 : 5’ ATGAAACAGAAAAACCCGAAAAATACGC 3’
TRR1 : 5’ TTATTGAAATAATTTGTAACTATTGAAAACAG 3’
As condições de PCR foram as mesmas utilizadas para a detecção dos genes. Os produtos obtidos para o genes mefA (1.380pb), ermB (820pb) e ermTR (940pb) das amostras 02, 16, 07, 83, 06 e 95 foram purificados utilizando o kit de purificação “QIAquick PCR purification Kit (50)” (Qiagen, Valencia, CA), conforme as instruções do fabricante. O produto purificado foi quantificado pela comparação da intensidade da banda após corrida em gel de agarose utilizando-se um marcador de 1Kb (1Kb DNA ladder, Invitrogen) como padrão.
Os segmentos de DNA amplificados foram seqüenciados na “UC Berkeley DNA Sequencing Facility”, University of California, Berkeley, Califórnia, EUA. Após obtenção das seqüências gênicas, as mesmas foram analisadas e comparadas às seqüências disponíveis no GenBank no “National Center for Biotechnology Information website” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando-se o programa Blast:
Nucleotide-nucleotide e Megablast. As seqüências encontradas foram traduzidas pelo programa Transeq (http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/).
7. Análise dos perfis de fragmentação do DNA Genômico
Todas as amostras de estreptococos β-hemolíticos dos grupo C e G foram analisadas pela técnica de PFGE para o estudo da diversidade genética. A extração, fragmentação e separação dos fragmentos de DNA cromossômico gerados foi baseada na metodologia descrita por d’Oliveira (2002) com algumas modificações.
As amostras foram cultivadas em placas contendo meio de ágar sangue e incubadas por 24h a 35ºC. Após este período, um inóculo equivalente à escala 5 de
Mc Farland preparado em 200µL de tampão PIV (NaCl 1,0M, Tris-HCl 10mM, pH 7,6) foi misturado a um volume igual de agarose de baixa temperatura de fusão (Nu Sieve GTG Low Melting Agarose, FMC BioProducts, Rockland, EUA) a 2%, e distribuído em moldes para a obtenção de blocos, os quais foram resfriados a 4ºC.
Para a lise celular, os blocos já solidificados foram tratados com solução contendo 1mg de lisozima e 5 U de mutanolisina (Sigma) por mL e incubados durante 18 a 24h a 37ºC sob agitação suave. Esta solução foi então substituída por 2,0mL de solução ES (EDTA 0,5M, 1% N-lauril-sarcosina) contendo 0,1mg/mL de proteinase K (Roche, Indianapolis, IN) e incubada por 18 a 24h a 50ºC.
Antes do tratamento com enzima de restrição, cada bloco foi lavado com 2,0mL de tampão TE 1X (Tris-HCl 10mM pH 7,6, EDTA 0,1mM) 10 vezes a 37ºC sob agitação. Cada bloco foi então tratado com 250µL da solução tampão-específica para a enzima de restrição (Roche) para o equilíbrio da reação durante 1h a temperatura específica para a enzima (25µL de tampão A 10X concentrado + 225µL de H2O milliQ estéril). A seguir, o tampão foi removido e foi adicionado novo tampão contendo 30U da enzima de restrição SmaI ou SfiI. Os blocos foram incubados por 18 a 24h a 25ºC (SmaI) ou 50ºC (SfiI) (Sigma).
O tampão e a enzima foram removidos, e os blocos de agarose foram fundidos a 72ºC e aplicados em reservatórios do gel de corrida preparado com agarose a 1,3% (Pulsed Field Certified Agarose - BioRad) em tampão TBE 0,5X (Tris 0,05M, EDTA 1,25mM e ácido bórico 0,05M).
Os fragmentos foram separados por eletroforese em campo pulsado empregando-se o equipamento CHEF DR II (Bio Rad, Hercules, EUA).
Os parâmetros utilizados foram: tempo de pulso crescente de 3,0 a 45,0s, por 25h a 6V/cm na temperatura de 11ºC.
