Análise dos Resultados - MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.6. Análise dos Resultados

Osdadosforamavaliadospela análise de variância a doiscritériosde avaliação (Two-wayANOVA).AscomparaçõesmúltiplasforamfeitaspeloTestedeBonferroni.

Paratodosostesteso níveldesignificância foiestabelecidoemp<0,05.Oprograma GraphPad Prism 4.0 foi utilizado paraa realizaçãodos cálculos estatísticos.

14 pe s o (g ) g lic o s e (m g /d l) 5.RESULTADOS

Todososanimaisforam pesadosimediatamente antesdainduçãododiabetes,e duranteoexperimentoforamfeitasmedidas daglicemia e dopesocorporalapósumjejum de8horas.ConformedemonstradonaFigura1,os animaisdiabéticosdemonstraram aumentosignificativodaconcentraçãoplasmáticade glicose(Figura 1A),assimcomouma perda progressiva de peso (Figura 1B) ao longo do tempo, confirmando a indução e

manutenção dadoença. (A) 500 400 + 300 + + + + + Normoglicêmicos Diabéticos 200 100 0 7 14 21 28 35 42 Dias (B) 400 Normoglicêmicos Diabéticos 300 200 + + ₊ + 100 0 7 14 21 28 35 42 Dias

15 C o m po rt a m en toN o c ic ep ti v o (s ) Figura1.Dosagem deGlicemia(mg/dl)ePesoCorporal(g)emrelaçãoaotempoemanimais diabéticos.(A)Osanimais diabéticosapresentaramconcentraçãodeglicoseplasmáticaacimade300mg/dl 7diasapósainduçãododiabetes.Osanimaisdiabéticosapresentaram umaconcentraçãodeglicose plasmáticasignificativamentemaioremrelaçãoaosnormoglicêmicosemtodosostempostestados(p<0,05: Two- ANOVA, TestedeBonferroni).(B)Foiobservadaumaperdasignificativaeprogressivadopesodos animaisdiabéticos21diasapósainduçãododiabetes.Osanimaisdiabéticosapresentarampesocorporal

significativamentemenoremrelaçãoaos normoglicêmicosapartirdo21ºdia deindução da doença(p<0,05: Two- ANOVA, TestedeBonferroni).Osímbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreanimais normoglicêmicose diabéticos.

Os dados demonstraram que os animais diabéticos apresentaram hiponocicepção na ATM 7 dias após a indução do diabetes. Esta hiponocicepção foi

observadaaté 42 dias após a indução do diabetes(Figura2).

250 200 Normoglicêmicos Diabéticos 150 100 50 + + ₊ + + + 0 7 14 21 28 35 42 Dias Formalina1,5% Figura2.FaseinicialdodiabetesinduzahiponocicepçãonaATM. Ainjeçãointra-articulardoagente inflamatórioformalina(1,5%)induziuumarespostanociceptivasignificativamente menornosratos diabéticosquando comparadoscomosanimaisnormoglicêmicosnos dias7,14, 21, 28,35e42diasapós induçãodadoença(p<0.05:Two-wayANOVA,testedeBonferroni).Osímbolo(+)indicadiferença

16 C o m po rt a m en toN o c ic ep ti v o (s )

Combase nosresultadosde hiponocicepçãoobservadosnográficoanterior,os experimentosforamreplicadoseosanimaistratadoscomuma injeçãointra-articular de capsaicina,umestímulonocivoque induzresposta nociceptiva atravésdosreceptores vanilóidesTRPV1 nasfibrasC-nociceptivasperiféricas(Tominaga andTominaga,2005; Niliusetal.,2007;Zhangetal.,2007).Os resultadosdemonstraramque asanimais diabéticosapresentaramhiponocicepçãoapenas7,14,21e28diasapósainduçãodo diabetes. 200 Normoglicêmicos Diabéticos 150 100

*

0 Veículo 7d 14d 21d 28d 35d 42d Capsaicina1,5% Figura3.Avaliaçãodainduçãodahiponocicepção pelafaseinicialdodiabetesnaATMpelotesteda capsaicina.Ainjeçãointra-articular decapsaicina(1,5%)induziuumarespostanociceptiva significativamentemenornosratosdiabéticosquandocomparadoscomosanimaisnormoglicêmicosnosdias 7,14,21e28diasapósinduçãodadoença(p<0.05:ANOVA,testedeTukey).Osímbolo(*)indica diferençaestatísticaentreosanimaisdiabéticose seusrespectivoscontroles. Considerandoosresultadosacimadescritos,emuma segundaetapa de experimentos,foiavaliadaarelaçãodaexpressãodediferentesisoformasdaPKCcoma hiponocicepçãoinduzidapelodiabetesnosdias7,14,21e28diasapósainduçãoda doença.

Foram avaliadas 5 isoformas da PKC no tecido periarticular da ATM testada: PKC-alpha (PKC-α), PKC-beta1 (PKC-β1), PKC-beta2 (PKC-β2), PKC-delta

(PKC-δ)ePKC-epsilon(PKC-ε). Osresultadosdemonstraramqueosanimaisdiabéticos apresentaramumaexpressãoda PKC-α significativamente menoremrelaçãoaos normoglicêmicos(Figura4).

Figura4:Avaliação daexpressão daPKC-αnaATMdeanimais diabéticos em relaçãoaos

normoglicêmicos.AexpressãodaPKC-α notecido periarticulardosanimaisdiabéticos (DB)foisignificante

menoremrelaçãoaos animaisnormoglicêmicos(NG) nostempos7, 14 e 21dias (p<0.05:Two-way ANOVA,testedeBonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

Aanálise por WesternBlotdasdemaisisoformas demonstraramque a expressãodaPKC-β1ePKC-β2(Figura5),PKC-δ(Figura6)ePKC-ε(Figura7)foi

significativamentemaiornosanimaisdiabéticosemrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos. A expressão dasproteinoquinases PKC-β1 ePKC-β2estãoaumentadasnosanimais diabéticos

Figura5:AvaliaçãodaexpressãodaPKC-β1ePKC-β2naATMdeanimaisdiabéticos emrelaçãoaos

normoglicêmicos.Aexpressão daPKC-β1ePKC-β2notecidoperiarticulardosanimaisdiabéticos(DB)foi

significantemaioremrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos(NG)emtodosostempostestados(p<0.05:Two- way ANOVA,Testede Bonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

AexpressãodaPKC-δfoisignificativamentenosanimaisdiabéticosapartirdo 7º dia daindução dadoença(Figura6).

Figura6:AvaliaçãodaexpressãodaPKC-δ naATMdeanimaisdiabéticos emrelaçãoaos

normoglicêmicos.AexpressãodaPKC-δnotecido periarticulardosanimais diabéticos(DB)foisignificante

maioremrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos (NG)emtodosostempostestados(p<0.05: Two-way ANOVA,testedeBonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

AexpressãodaPKC-εfoisignificativamentenosanimaisdiabéticosapartirdo 7º dia daindução dadoença(Figura7).

Figura7:Avaliação daexpressão daPKC-εnaATMdeanimaisdiabéticosem relaçãoaos

normoglicêmicos.Aexpressão daPKC-εnotecido periarticulardosanimais diabéticos(DB)foisignificante

maioremrelação aosanimaisnormoglicêmicos(NG)apartirdo21ºdiadeindução dadoença(p<0.05:Two- way ANOVA,testede Bonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreos grupos.

6. DISCUSSÃO

No presente estudofoi demonstradoque odiabetesinduzuma hiponocicepção na ATM a partir do7ºdia de induçãoda doença.Estesdadossugeremquea fase inicialdo diabetesinduzumaalteraçãosensorialnosistematrigeminalquepodeestarrelacionado

comaslesõesdostecidosoraisdepacientesdiabéticos(Collinetal.,2000;Arapetal., 2010; Zhu&Nilolajczyk, 2014).

Nopresenteestudoodiabetesfoiinduzido nosanimaisatravésdeumainjeção intraperitonealdeSTZ(75mg/kg)(Daulhacetal.,2006;Courteixetal.,2007,Leietal.,

2013),sendoquea confirmaçãoda instalaçãodadoençafeitapeladosagemperiódica da concentração plasmáticaeglicoseeavaliação dopeso corporal dos animais. De acordo com a evoluçãoda doença,osanimaisdiabéticosdemonstraramglicemiasuperior a 300mg/dle perdaprogressivado peso corporal, validando omodelo experimental.

Ainduçãododiabetesatravésda STZ éummodeloexperimentalcomumente utilizadoparaavaliaçãodasalteraçõesnociceptivasinduzidaspelodiabetes(Daulhacetal.,

2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013). ASTZ éuma nitrosamidalargamente utilizada comoindutora de diabetesemanimaisexperimentais,que temcomoefeito,a destruiçãodascélulasbeta-pancreáticaseconsequentementeumadeficiêncianaprodução

deinsulina.AliteraturademonstraqueainduçãoexperimentaldediabetescomSTZem

roedoresinduzhipernocicepçãoemdiferentes modelosexperimentais. Particularmente, tem sidodemonstradoque odiabetesinduzhipernocicepçãona pata 3a 4semanasapóso tratamentosistêmicocomSTZ(Daulhacetal.,2006;Courteixetal.,2007,Leietal.,

2013).

Aliteratura temdemonstradoqueasestruturasorofaciaissãoafetadaspelo diabetes (Trogeret al., 1999; Colinet al, 2000; Bragaet al., 2001),no entanto, o númerode estudos é escassoeos dados contraditóriosemrelaçãoàs alterações nainervação trigeminal pelodiabetes.Utilizandoomodelode diabetesinduzidopelaSTZ,Rodella etal.(2000) demonstrara,queafaseinicialdodiabetesinduzhipernocicepçãotérmicafacialeapós8a

12semanasdepoisdainjeçãodaSTZ,enquantoNonesetal.(2013)nãoobservoudiferença na estimulação térmica e tátil orofacial na fase inicial do diabetes. Em uma análise

OpresenteestudodemonstrouqueodiabetesinduzhiponocicepçãonaATM observadopelotestedaformalinaaté42diasapósotratamentosistêmicocomSTZ.Para

comparativa entre osdoisestudossupra citadose oatualtrabalho,doisaspectosdevemser observados:aregiãoavaliada entre osestudos(pata,facee ATM) e otipode teste utilizado paradetecção das alterações dasensibilidade somática(teste térmico, mecânicoepor agente químico).

Emrelaçãoà região avaliada entre osestudossabe-se que a diferençaentre tecidossubcutâneos(face,pata e lábio) e tecidosprofundos(ATM) resulta dofatode que estestecidossãopredominantemente inervadospor diferentessubtiposde neurônios aferentesprimários.Devidoaofatodasinervaçõesde tecidoprofundoinduziruma maior ativaçãona excitabilidade de neurônioscentraisemrelaçãoàsinervaçõesde tecidos cutâneos,maioresdistúrbiossensoriaispodemocorreremcondiçõesdolorosas envolvendo tecidosprofundos (Imbeetal.,2001).Alémdomais,já foidemonstradoque ostecidosda ATM sãomaissensitivosa processosinflamatóriosenvolvendo liberaçãode aminas simpatomiméticas e PGE2do quetecidos cutâneos(Rodrigueset al., 2006).

Outropontoaserconsideradoéadiferençadetestesutilizadosnosdiferentes

estudos.O testetérmicodetecta principalmenteativaçãode fibrasnociceptivas superficiais, enquantooteste mecânico detectanociceptoressubcutâneos,envolvendo diferentes mecanismosna ativaçãodestasdiferentesfibrasnociceptivas(Vivancosetal.,2003; Pedrosa, 2011).

O teste daformalina (teste químico) induzuma hipernocicepçãoproduzidapela sensibilizaçãoperiféricadosnociceptoreseestruturasneuronaisenvolvidas(Roveroniet

al.,2001;Clementeetal.,2004).No presente estudo,foi utilizada formalina na concentraçãode

1.5%, considerada uma concentraçãoda formalina (testequímico),induz uma hipernocicepçãoproduzida pela sensibilizaçãoperiférica dosnociceptoressubmáxima (Roveroni etal., 2001;Clementeetal., 2004) permitindo avaliarrespostastanto hipernociceptivas quanto hiponociceptivas de alterações sensoriais neuronais. Sendo assim,pode-se hipotetizar que o fatoda ATM envolver tecidosprofundoscomdiferentes subtiposdeinervaçõessomáticaseseremmaisresponsivosamediadoresinflamatórios, pode explicar, pelo menos em parte, as diferençasencontradas entreosestudos.

debilitanteempacientesdiabéticosqueacometeemproporçãocrescentenestespacientes

confirmareverificarumpossívelmecanismo envolvidocomahiponocicepção,os experimentosforamreplicadosutilizandoo testedacapsaicina.Noentanto,a hiponocicepçãoinduzida pelodiabetesna ATM foiobservadanoteste dacapsaicinaaté28 dias após o tratamento sistêmico com STZ.

Otestedaformalinaéumtesteamplamenteutilizadopara avaliaçãodosefeitos de novasdrogasanalgésicase/ouanti-inflamatóriasemanimaisexperimentais.O agente nociceptivoformalina induzuma resposta dolorosa bifásica:a primeira fase(neuronal)é caracterizadapelaativaçãode receptoresTRPA1nosneurôniosnociceptivosaferentes primários;enquantoqueasegundafase(inflamatória)éresultadodeumasensibilização

dosnociceptoreseestruturasneuronaiscomprojeçãocentral(McNamaraetal., 2007). Basicamente a injeçãoemtecidosperiféricosdoagenteformalina agediretamentenos receptoresTRPA1 (receptoresdotipoionotrópicos) ativandoasfibrasnociceptivas primárias, mas também,induzdano tecidual econsequentemente migraçãodecélulas inflamatórias, particularmente osmastócitos.Uma vezativados,osreceptoresTRPA1,via liberação deneuroquininas,estimulamadegranulaçãodosmastócitosliberandohistaminae

5-hidroxitriptamina,que atravésde uma açãosinérgica,sensibilizamasfibrasC- nociceptivas desenvolvendo um quadrodehipernocicepção (Paradaet al.,2001; Ting et al.,

2007; Macphersonet al., 2007; MacNamaraet al.,2007;Fisheret al., 2008).

Por outrolado a capsaicina é conhecida por ativar receptoresvanilóidestipo TRPV1 nasfibrasperiféricasC-nociceptivasqueaumentaacondutânciadascorrentesde Na+ eCa2+ resultandoemcomportamentosnociceptivos(TominagaandTominaga,2005; Niliusetal.,2007).TantoosreceptoresTRPA1comoosreceptoresTRPV1 aumentama permeabilidadeaoCa2+.O aumentodaconcentraçãodeCa2+intracelularativacascatas de sinalizaçõesbioquímicas,comoporexemplo,a viafosfolipaseC(PLC)/diacilglicerol (DAC) / ProteinoquinaseCque porsuavezresultamna sensibilizaçãodefibrasaferentes primárias(Costigan andWoof, 2000; Woolfand Salter, 2000).Sendo assim,a diferença entre osresultadosobtidosnostestesdaformalina ecapsaicina podemestar relacionados com o mecanismo deação de cadaum dos respectivos agentes algésicos.

duranteaprogressãodadoença(Daulhacetal.,2006).Emdecorrênciadadebilitação

severadasneuropatiasinduzidaspelodiabetes, estudosvêmexplorando seusmecanismos para melhorentendimentodadoençaeassimdesenvolvernovasperspectivasterapêuticas

paraseucontrole etratamento (Boultonetal. 2005).

Váriossãoosmecanismosdescritosenvolvidosna gêneseda neuropatia diabéticacomoliberaçãodemetabólicos,alteraçõesvascularese reaçõesautoimunes. No entanto,aliteraturasugere uma relaçãodiretaentreoestadohiperglicêmico,mantido cronicamente e ascomplicaçõesmicro e macrovasculares,suportandoa hipótese de que a hiperglicemia seja o fatordeterminante nagênesedascomplicaçõesdodiabetes.Temsido demonstrado que a hiperglicemia induz as complicações neurovasculares através da ativação davia Diacilglicerol/ProteinoquinaseC (DAG/PKC) (Evcimenand King, 2007).

O DAG é oprincipalativador fisiológico da PKC.O aumentodosníveisde DAGnodiabetespodeocorreratravésdemúltiplasvias(EvcimenandKing,2007).O DAGpodeser derivadodahidrólisedefosfatidilinositídeos;pelo metabolismoda fosfatidilcolina poraçãoda fosfolipase C;oupela sínteseatravésdosintermediários glicolíticos,fosfatode diidroxiacetona egliceral-3-fosfato;comsubsequente ativaçãoda PKC(EvcimenandKing,2007).Avia

DAG/PKCtambémpode ser ativada pela hiperglicemia

comoresultadodoaumentodoestresseoxidativo,comoporexemplo,pelo

aumentodooxidanteH2O2,oqualéumconhecidoativadordaPKC,sejadeformadireta

ouindiretapeloaumentodaproduçãodoDAG.(Konishietal.,1997;Nishikawaetal., 2000).

A PKCé umgrupo de enzimasmembrosdafamília deproteinoquinases dependentesdoAMPc,queapresentammúltiplas funçõescelulareseafetammuitasviasde transduçãode sinais. No entanto,omecanismopeloquala PKCcontribuiparao desenvolvimentoda neuropatia diabética ainda nãoestáesclarecido.Nopresenteestudofoi demonstradoquea hipoalgesia demonstrada nosanimaisdiabéticosestá relacionadacomo aumentodaexpressãodasPKC-β1,PKC-β-2,PKC-δePKC-εediminuiçãodaexpressão

daPKC-α.

Oimportantepapeldoaumentodasatividadesdaaldoseredutase(importante mediadornometabolismodaglicose)ediferentesisoformasdaPKCrelatadosemestudos

experimentaistêm sidoconfirmados emestudos clínicos em pacientesdiabéticos com polineuropatiasensório-motora(Obrosova2009).Particularmente,aPKC-β(Sasaneetal.,

2005)e PKC-ε (Huchoetal.,2005)estãodiretamenteenvolvidasnodesenvolvimentoda hipernocicepção(incluindohipernocicepçãodecorrentedodiabetes),enquantoqueaPKC- δ e PKC-α estão vinculadasa danosneurais(Robertsetal.,1997; Sakaueetal.,2003).É importanteressaltar,quepesquisaspara odesenvolvimentodepossíveistratamentospara a neuropatiainduzidapelodiabetesvêmutilizandoinibidoresdestesmediadores(Obrosova,

2009).

OaumentodaexpressãodasPKC-β,PKC-δePKC-εrelacionadoà hiperglicemia induzida pelo diabetes demonstrado no presente estudo, corrobora a literatura,noentanto,naATMfoiobservadoquadros de hiponocicepção.Por outrolado, a expressão daPKC-αfoisignificativamente menor nosanimaisdiabéticosem relaçãoaos animaisnormoglicêmicos.Considerandoofatode que existe umarelaçãoentre PKC-α e a bombaNa+/K+/ATPase(Yangetal.,2012);equeodiabetesinduzumainibiçãodabomba

Na+/K+/ATPasepromovendoumaretençãodeNa+,comconsequenteedemadabainha

mielínica,disjunçãoaxogliale degeneraçãonervosa (Gagliardietal.,2003),é possívelque nostecidosda ATMafase inicialdodiabetesinduzumadiminuiçãona expressãoPKC-α e consequentemente inibiçãoda bombaNa+/K+/ATPase,diminuindoassima excitabilidade neuronal econsequentemente induzindo a umahiponocicepção.

7. CONCLUSÃO

Opresenteestudodemonstrouque a faseinicialdodiabetesinduzuma hiponocicepçãona ATM de ratose estáassociada aoaumentoda expressão dasisoformas PKC- β1, PKC-β2, PKC-δ ePKC-ε, assim como com a diminuição da expressão daPKC-α.

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.' ' 'M1 ANEXO1 CEVA!Unioe.mp

ComissAo deEticanoUsodeAnimais

CEUAIUnieamp

CERTIFICADO

Certifieamosque oprojelo "AVALIACAODODESENVOLVIMENTODE NEUROPATIA DIABETICANAATMDERATOSE0PAPELDASISOFORMAS DAPROTENOQUINASEC!PKClNESTEPROCESSO"(protocolo n•28351),

sobaresponsabllidadedeProfa.Ora.JulianaTrindadoClomenteNaplmoga1 Augusto Muzilli Junior,esta deacordo com os Pr·incipiosE.ticosna

ExperimentacaoAnimaladotadospelaSoeledadeBraslielradeCl6nelaem AnimalsdeLaborat6rio(SBCAL)ecomalegislayaovigente,LEIN°11.794,DE

8DEOUTUBRODE2008.queestabeleeeprocedimentosparaousoeientlficode animais,eoDECRETON•6.899,DE15DEJULHODE2009.

0projeto foiaprovadopelaComissaodeEteano UsodeAnmi alsda UniversidadeEstadualdeCampnas•CEUAIUNICAMP•em27de agosto de

2012.

7deagostode2012.

Proia.Ora.Ana

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riaAChuaraldo Presidente

FtimaAlonso SeeretaraExecutiva

CEW..VNICA.-Y.P

No documento Avaliação do desenvolvimento de neuropatia diabética na ATM de ratos e a relação da expressão das isoformas da proteinoquinase C (PKC) neste processo (páginas 30-50)