Avaliação do desenvolvimento de neuropatia diabética na ATM de ratos e a relação da expressão das isoformas da proteinoquinase C (PKC) neste processo

PIRACICABA 2014

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AUGUSTO MUZILLI JUNIOR

AVALIAÇÃO DODESENVOLVIMENTO DE NEUROPATIA

DIABÉTICANAATMDE RATOS EARELAÇÃO DAEXPRESSÃO

DAS ISOFORMAS DAPROTEINOQUINASE C(PKC) NESTE

PROCESSO

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

AUGUSTO MUZILLI JUNIOR

AVALIAÇÃO DODESENVOLVIMENTO DE NEUROPATIA

DIABÉTICANAATMDE RATOS EARELAÇÃO DAEXPRESSÃO

DAS ISOFORMAS DAPROTEINOQUINASE C(PKC) NESTE

PROCESSO

Dissertaçãoapresentada àFaculdade de Odontologia, da Universidade Estadual de Campinas, comopartedosrequisitosexigidosparaobtenção doTítulodeMestreem Odontologia,naáreade Fisiologia Oral.

Orientadora: Profª. Drª. JulianaTrindadeClemente Napimoga

Co-orientadora: Profª. Drª.Maria Cláudia Gonçalves de OliveiraFusaro

EsteexemplarcorrespondeàversãofinaldaDissertaçãodefendida

porAugusto MuzilliJuniore orientadopelaProfª.Drª.Juliana TrindadeClemente Napimoga.

Assinatura daOrientadora

PIRACICABA 2014

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene

Girello - CRB 8/6159

Muzilli Junior, Augusto, 1952-

M988a Avaliação do desenvolvimento de neuropatia diabética na ATM de ratos e a relação da expressão das isoformas da proteinoquinase C (PKC) neste processo / Augusto Muzilli Junior. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2014.

Orientador: Juliana Trindade Clemente Napimoga.

Coorientador: Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

1. Diabetes Mellitus experimental. 2. Neuropatias diabéticas. 3. Dor facial. 4. Articulação temporomandibular. I. Clemente-Napimoga, Juliana Trindade,1978-. II. Fusaro, Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira. III. Universidade Estadual de

Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Evaluation of the development of diabetic neuropathy in TMJ of rats and the relationship of the expression of the isoforms of protein kinase C (PKC) in this process Palavras-chave em inglês:

Diabetes Mellitus, experimental Diabetic neuropathies

Facial pain

Temporomandibular joint

Área de concentração: Fisiologia Oral Titulação: Mestre em Odontologia Banca examinadora:

Juliana Trindade Clemente Napimoga [Orientador] Elizabeth Ferreira Martinez

Antonio Wilson Sallum Data de defesa: 25-02-2014

Programa de Pós-Graduação: Odontologia

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UNIVERSIDADEESTADUALDECAMPINAS

FaculdadedeOdontologladePiracicaba

AComissaoJulgadora dos lfaba!hos deDefesadeDi.ssertaylod&M&strado.emu.ssAopUblica

reail.udaem25de Fevereirode 2014,considerouocandidateAUGUSTOMUZILLIJUNIOR aptova::ro.

Ptofa.Or3.JULlANATRINApEClEMENTENAPMOGA I

./

RESUMO

Adoença diabetesemsua fase inicialé conhecida por induzirdor neuropática, comoresultadode complicaçõesneurovascularesmediada pelavia diacilglicerol/ Proteinoquinase C(DAG/PKC). Considerandoque a neuropatia induzida pelodiabetesestá associadacomdiferentesisoformasda PKC,o objetivodesteestudofoiavaliaraexpressão dediferentesisoformasda PKCnascondiçõesdolorosasinduzidaspelo diabetestipo1na articulaçãotemporomandibular (ATM) deratos.Ratos Wistar (± 150g,2mesesde idade, n=4-6/grupo) foramtratadoscomuma injeçãointraperitonealde tampãocitrato(veículo; normoglicêmicos–NG)ouEstreptozotocina75mg/kg(diabéticos–DB). Asalterações dolorosasinduzidas pelo diabetestipo 1foramavaliadasatravésdamensuração do comportamentonociceptivodosanimaisinduzidopor umainjeçãointra-articular de formalina1,5% oucapsaicina1,5% nosdias7,14,21,28,35ou42dias apósa induçãodo diabetes ouveículo. Apósa avaliaçãodoscomportamentosnociceptivos,osanimaisforam mortosporanestesiaeotecidoperiarticular removidopara análisede WesternBlot.Afase inicialdodiabetestipo1induziuumahiponocicepçãonaATMdosratos7,14,21,28,35e

42diasdepoisdainduçãododiabetes(p<0.05:Two-way ANOVA,Bonferroni’stest).Os animaisdiabéticostratadoscomuma injeçãointra-articular de capsaicina demonstraram hiponocicepção7,14,21e 28diasdepoisdainduçãododiabetes(p<0.05:Two-way ANOVA,Bonferroni’stest). AanáliseporWesternBlotdemonstrouqueaexpressãodas proteinoquinasesPKC-β1,PKC-β2,PKC-δePKC-ε notecidoperiarticularfoi significativamente maiornosratosDBemcomparaçãoaosanimaisNG(p<0.05:Two-way ANOVA,Bonferroni’stest), enquantoa expressãoda PKC-αnotecidoperiarticular foi significativamentemenornosratosDBemcomparaçãoaosanimaisNG (p<0,05).Os resultadossugeremquea hiponocicepçãoinduzida pelodiabetesna ATMde ratosestá associadaàvariação daexpressãodas diferentesisoformas daPKC:-α, -β1,-β2, -δe-ε.

Palavras-chaves:DiabetesMellitusExperimental; NeuropatiasDiabéticas,DorFacial, ArticulaçãoTemporomandibular, ProteinoquinaseC.

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ABSTRACT

Diabetesinearly phaseisknowntoresultinpainfulneuropathy asaresultof neurovascularcomplicationsmediatedby theactivationofDiacylglycerol/ProteinkinaseC pathway (DAG/PKC).Consideringthatdiabetes-inducedneuropathy isassociatedwith differentPKCisoforms,theaimofthisstudywastoevaluatetheexpressionofPKCin diabetes type1-induced pain condition in the temporomandibularjoint (TMJ)ofrats. Wistar rats(±150g,2month-old,n=4-6/group) were treatedwithanintraperitoneal injectionof citrate buffer (vehicle;normoglycemic–NG) or Streptozotocin75mg/kg (diabetic–DB). Diabetes-inducedpainconditionswereassessedby theanimals’ nociceptivebehaviorinducedby anintra-articularinjectionof1.5%formalinor1.5% capsaicin 7, 14, 21, 28, 35 or 42 days after the diabetic induction or vehicle. After behavioralassays,animalswereterminally anesthetizedandtheirperiarticulartissue removed for WesternBlot analysis. Earlyphaseofdiabetestype1inducedhyponociception

intoTMJofrats7,14,21,28,35and42daysafterthediabeticinduction(p<0.05:Two-

wayANOVA,Bonferroni’stest). DBanimalstreatedwithanintra-articularinjectionof capsaicindemonstratedhyponociception 7, 14,21 and 28daysafter diabetes induction (p<0.05:Two-wayANOVA,Bonferroni’stest).WesternBlotanalysisdemonstratedthat

theexpressionofPKC-β1, PKC-β2, PKC-δand PKC-εintoperiarticular tissuewas significantly higherintheDBratsthanintheNGrats(p<0.05:Two-way ANOVA, Bonferroni’stest),whereastheexpressionof PKC-α intoperiarticular tissuewas significantlyhigherintheDBratsthanintheNGrats(p<0.05).Earlyphaseofdiabetes type1induce hyponociceptionintoratsTMJthatinvolveschangesintheexpressionof different kinds of PKC isoforms: -α, -β1, -β2,-δand -ε.

Key Words: Diabetes Mellitus, Experimental; DiabeticNeuropathies,Facial Pain, Temporomandibular Joint, Protein kinaseC.

1 SUMÁRIO DEDICATÓRIA xiii AGRADECIMENTOS xv 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO DE LITERATURA 3 3. PROPOSIÇÃO 9 4. MATERIAL E MÉTODOS 10 5. RESULTADOS 14 6. DISCUSSÃO 21 7. CONCLUSÃO 26 REFERÊNCIAS 27

ANEXO I:Certificado de aprovação daComissão deÉticano Uso deAnimais-

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DEDICATÓRIA

A Deus por tudo quesou;

Aos meus pais Augusto eCleydepeloamor dedicado e exemplo de retidão;

Aos meus filhos Tatiana,Tiago, Christina, MarinaeAugustinho;eaomeunetoJoão Pedro, o meu eterno amor porvocês;

Aos meus irmãos Oscar,Carlos Alberto eMarcelopela amizade fraternaeincentivo;

Ao grande amor da minha vida Cely, o meu eterno agradecimento pela dedicação, compreensão e apoio incondicional.

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AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOSESPECIAIS

ÀminhaorientadoraProf.Dra.JulianaTrindadeClementeNapimoga, pelasabedoria, orientação, dedicaçãoeempenho, meu eternoagradecimento;

ÀscolegaseamigasCristinaGomesdeMacedoeFabianaFurtadoFreitaspelaajuda, dedicação, carinho etudoqueme ensinaram meumuito obrigado;

À Prof. Dra.FernandaKlein Marcondes pelos ensinamentos epelo apoio dado;

AoProf.Dr.AntonioWilsonSallumpelaamizadefraternaepeloapoioincondicionalpara queingressassena FOP-UNICAMP;

AosfuncionárioseamigosCarlosAlbertoA.Feliciano,ElieteRighettoeMariaElizados Santospor tudo que fizeram e fazem paramim e pelos alunos demodo geral;

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AGRADECIMENTOS

À FaculdadedeOdontologia dePiracicaba, UniversidadeEstadual de Campinas;

Ao Programa dePós-Graduaçãoem Odontologia,pela oportunidadeoferecida;

AosProfessoresdoDepartamentodeFisiologiapelosensinamentosministradosepelo apoio à pesquisa;

AtodososamigosealunosdaPós-GraduaçãodaFaculdadedeOdontologiadePiracicaba- UNICAMP, pelo apoiomútuo e coleguismoético demonstrado;

Ao Prof. Dr.Lourenço Sobrinho pela amizadeeincentivo constante;

Ao Prof. Dr. Enilson Sallum peloapoio e carinho;

AtodososProfessoresquedeformadiretaouindiretacontribuíramparaonossomelhor aproveitamento;

AtodososfuncionáriosdaFaculdadedeOdontologiadePiracicabapeloprofissionalismo demonstrado ededicaçãoprestada;

A algum amigo queporventuranãotenha sidocitado, mas quecolaboroucom seu incentivo ededicação.

Santiago RamónY Cajal

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EPÍGRAFE

"Quando alguém deixa deaprender, deixa de escutar, deixa de veredefazer perguntas novas, então é tempo demorrer."

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1. INTRODUÇÃO

Diabetesmellitusé umadoença metabólica onde a principalcaracterística clínica é oaumentoanormalda glicemia acompanhadode sintomasclínicoscaracterísticos como a poliúria, apolifagiaeapolidipsia.

Atualmenteé umadasmaisfrequentesdoençasda humanidade,e asmudanças nocomportamentoe estilode vidadossereshumanosnoúltimoséculo,temresultadoem umdramáticoaumentona incidênciadestadoença nomundo(Zimmetetal.,2001). Segundoa FederaçãoInternacionaldoDiabetes,285milhões de pessoasnomundotema doençaeestima-sequepara oanode2030estenúmerocheguea438milhõesdepessoas. Sãodadosalarmantestendoemvistaqueascomplicaçõesdadoençacausamumalto

índicedemorbidadeemortalidade(Lin et al., 2014).

Em1997,aOrganizaçãoMundialda Saúde (OMS) e aAssociaçãoAmericana de Diabetes(ADA) definirama novaclassificaçãoda doença,baseadosemaspectos bioquímicos e clínicos:

-diabetes mellitus tipoI(insulinopênico)

-diabetes mellitus tipoII (resistênciaàinsulina ou insulinopenia relativa) -outros tiposespecíficosdediabetes mellitus

-diabetes mellitus gestacional

ApesardoDiabetes,especialmenteTipoI eII,apresentaremetiologias diferentes,compartilhamsinaise sintomascomuns,comoporexemplo,intolerânciaà glicose, hiperglicemiaehiperlipidemia. Asduasformasdeapresentaçãodesta doença apresentamcomplicaçõessimilares,dentre elasasanormalidades vascularese as neuropatias (Singletonetal., 2003; Daulhacet al.,2006).

Especificamenteem relação àsneuropatias periféricas sensoriaisinduzidas pelo diabetes, estas representamcomplicaçõesdebilitantes afetandomaisde 50% dospacientes diabéticos (Boultonetal.,2004). Sãodescritascomodistúrbiosnosistema nervoso periférico, ocasionados poralterações estruturaisnas fibras neuronais– como rompimento dascélulasde Schwann(desmielinização),degeneraçãoe perdasaxonais;lesões microvasculares e alterações nas sinalizações bioquímicas intracelulares (Arezzo and

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Zotova, 2002). Estasneuropatiasinduzema uma variedade de alteraçõesna condução nervosa incluindodorespontânea,hiperalgesiae alodínea,assimcomoquadrosde hipoalgesiae analgesia(Calcutt, 2004).

Neste sentido,estudos emhumanos temsugeridoque asalteraçõessensoriais decorrentes do diabetestambémestão relacionadascomdistúrbiosdo sistema estomatognático,taiscomoperda precoce deelementosdentais,disfunções temporomandibulares,dororofacial,síndromedaardênciabucaleperiodontite(Collinet

al.,2000;Arapetal., 2010;ZhuandNilolajczyk,2014).Noentanto,apesardebem estabelecidopela

literatura,asconsequênciasdecorrentesda neuropatia periférica induzida pelo diabetes, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos com o início e manutençãodestasneuropatiasaindasãopouco compreendidos(Daulhacetal., 2006;Johnson et

al., 2007).

Aliteraturatemsugeridoqueumprovávelmecanismopara o desenvolvimento da neuropatia diabética periférica sejaatravésdaativaçãoda via Diacilglicerol/Proteinoquinase C(DAG/PKC)(EvcimenandKing,2007).A PKCéum grupo de enzimasmembrosda família de proteinoquinasesdependentesdoAMPc,que

apresentammúltiplasfunçõescelulareseafetammúltiplasviasdesinalizaçãocelular,o

quepodecontribuirpara odesenvolvimentodasneuropatiasinduzidaspelodiabetes (Geraldes and King, 2011).

Considerandoque aneuropatia periférica induzidapelodiabetespodeestar relacionada comofatorderiscopara odesenvolvimentodeumadisfunção temporomandibular severa,opresenteestudoteve comopropostaavaliarasalterações sensoriaisinduzidaspelodiabetesnaATM de ratose sesuarelaçãocomaexpressão de diferentes isoformas da PKC.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

“O diabetesé uma aflição horrorosa,nãomuitofrequente entre oshomens,em

queascarnes,osbraçoseaspernassederretememurina.Osdoentes nuncaparamde urinar,e ofluxoé incessante comoaaberturade umaqueduto.A vidaé pequena, desagradável e dolorosa.” (Areteus daCapadócia-séculoIId.C.).

O Diabetes (dogrego:sifão), assimdenominadoporAreteusdevidoa exagerada eliminaçãode água pelosrins,é uma doença metabólicaonde a principal característica clínicaéoaumentoanormaldaglicemiaacompanhadodesintomasclínicos

característicoscomoapoliúria,apolifagiaeapolidipsia.Ossinaisclínicosrelacionados

comodiabetese mesmoalgumasde suascomplicaçõessãoconhecidos desdeostempos mais remotos: O papiro de Ebers (1500 a.C.) já descrevia o tratamento da poliúria, referindoque a urinatinha gostodoce;Galeno considerava a doença comoumafraqueza dosrins;eosjaponesesechinesesnoséculoII a.C.jáachamavamde“doençadasede” (Thomaz, 1977).

Willian Cullen,noséculoXVIII,acrescentouoadjetivomellitusaotermo

diabetespara diferenciardodiabetesinsipidus,que pode ser causadopela deficiênciana

produção,na secreçãoouna açãodohormônioantidiuréticoe nãoapresenta hiperglicemia. Epartindodesta época,surgiramosestudosdescrevendoteoriassobre aetiologiae mecanismosenvolvidoscomodesenvolvimentoda doença,nointuitode desenvolver tratamentos.

Em1869,oalemão PaulLangheransdescreve que opâncreasé constituídode inúmerasilhas,posteriormente sendodenominadasdeIlhotasdeLangherans.A degeneraçãodasIlhotasdeLangheransfoicorrelacionadacomodiabetesporOppieem

1900,cuja funçãoendócrina foireconhecida.Em1907,Lane,pela primeira vez, feza distinçãoentreascélulasalfaebetapancreáticas.EmToronto,Bantingemcolaboração

comBest(1921),descobriue isoloua insulina (dolatim: que vemdasilhas), determinando ummarcoculminante na história daciência.Noanoseguinte,emjaneiro de 1922,foi aplicada,pelaprimeiravez,ainsulinanohomemquepassouaserregularmenteusadaa

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expectativadevida(Thomaz,1977).Noentanto, otratamentocomdieta,hipoglicemiantes oraisereposiçãodeinsulina não fezdeclinar significativamenteasmanifestaçõesdas doenças vasculares na população diabética (Thomaz, 1977).

Apesar do diabetes tipos Ie II apresentarem etiologias diferentes, compartilhamsinaise sintomascomunse asduasformasde apresentaçãodestadoença apresentam complicações similares, divididas em agudas e crônicas.

Ascomplicações agudassãorepresentadasprincipalmente peloquadrode cetoacidose ou pelo coma hiperosmolar, a desidratação e as diferentes infecções em diversaslocalizações,sendoopé diabéticouma dasmaispreocupantes.Já ascomplicações crônicas são representadaspelodepósitodegordura na paredearterial,a retinopatia diabética,a insuficiênciarenalprogressiva,alémde alteraçõesmetabólicascomdestaque paraasanormalidadesvasculareseasneuropatias(Singletonetal.,2003;Daulhacetal.,

2006).

O desenvolvimento das neuropatias periféricas sensoriais induzidas pelo diabetesestádiretamenteassociadocoma falta docontroleglicêmico,tempode instalação dadoença,fatoresmicrovasculares(microangiopatias)efatoresderiscocardiovasculares

(hipertensão,hiperlipidemia,obesidadee fumo)(Tesfayeetal.,1996;Boultonetal.,2004; Tesfaye andSelvarajah,2012).Estasneuropatiasinduzema umavariedade de alteraçõesna conduçãonervosaincluindodorespontânea,hiperalgesiaealodínea,assimcomoquadros

dehipoalgesia eanalgesia (Calcutt, 2004).

Nestesentido,estudos clínicostemdemonstradoqueaprincipalqueixade pacientesdiabéticosé,frequentemente,aperda desensibilidadenasextremidades (hipoalgesia),queemestágiosavançadospodeevoluirparacompletaanalgesia(ausência

dasensibilidade dos nervos periféricos), facilitando aocorrênciadeacidentes queacarretam emdanosteciduaisequadrosinfecciosos, podendo levar,emcasosmaisgraves,à amputação do membroafetado (Calcutt, 2004).

Apesar da literatura escassa, estudos em humanos tem sugerido que as alterações decorrentes do diabetes também estão relacionadas com distúrbios do sistema estomatognático,taiscomoperda precoce deelementosdentais,disfunções temporomandibulares,dororofacial,síndromedaardênciabucaleperiodontite(Collinet

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al.,2000;Arapetal., 2010;ZhuandNilolajczyk,2014).Emparticular,aneuropatia periférica

induzida pelodiabetesestárelacionadacomofator deriscoparao desenvolvimento dedisfunção temporomandibular severa. Considerando quepacientescom neuropatia diabética tambémdesenvolvemquadrosde hipoalgesia,temsidosugeridoque a perda desensibilidadenaarticulaçãotemporomandibular(ATM)podeinduziràsdesordens

articularesedeformidadescomo,porexemplo,asarticulaçõesdeCharcot(Collinetal.,

2000).AarticulaçãodeCharcot,umaneuroartrite,éconsequênciadalesãodosnervos, como no caso da neuropatia induzida pelo diabetes, que impede a percepção da dor articular acarretando em lesões e fraturas insignificantes e repetidas (de forma despercebida)até adeterioração permanente daarticulação (Rogerset al., 2011).

Apesardebemdemonstradopelaliteratura ascomplicaçõesenvolvidascoma neuropatia periférica induzida pelodiabetes,osmecanismoscelularese moleculares envolvidoscomoinício emanutençãodestasneuropatiasaindasãopoucocompreendidos (Daulhacet al., 2006; Johnsonet al., 2007).

Muitasinformaçõesquantoà teoria dasneuropatiasdiabéticastêmsido publicadasnosúltimosanos,porémébastanteimprovávelque haja apenasuma causa envolvida neste processo, mas sim umaassociação de diferentes anormalidades, culminando emumquadroclínico comumdeneuropatia(Tesfayeetal.2010).Neste sentido,a literatura sugere uma relaçãodiretaentre oestadohiperglicêmico,mantido cronicamente,e ascomplicaçõesmicro e macrovasculares,suportandoa hipótese de que a hiperglicemiaéofatordeterminantenagênesedascomplicaçõesdodiabetes(Boultonet

al. 2005).

Assim, tem sidohipotetizados mecanismos bioquímicos envolvidos nas anormalidadesestruturaise funcionaisrelacionadasà exposiçãoprolongada dostecidos vascularesà hiperglicemia, taiscomoformaçãode produtosda glicaçãonãoenzimática, aumentoda atividade aldose-redutase,alteraçãodosradicaislivrese ativaçãoda ProteinoquinaseC (PKC)através davia do Diacilglicerol(Forbeset al. 2005).

Aglicosepresentenocompartimentoextracelularétransportadapara o compartimento intracelular por difusão, por ação de transportadores de glicose. Esta

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uma pequena parte daglicose intracelularé metabolizada pela via aldose-redutase,oque resultariaemumaumentodaviadosorbitolcomalteraçãodasviasdetransduçãode

sinais,comoporexemplo,aviaDiacilglicerol/ProteinoquinaseC(DAG/PKC)(Idrisetal., 2001).

O DAGpode ser derivadodahidrólise defosfatidil-inositídeos,pelo metabolismodafosfatidilcolinaporaçãodafosfolipaseC;oupelasíntese"denovo" através dosintermediários glicolíticos (com aumento do sorbitol), fosfato de diidroxiacetona e gliceral-3-fosfato; com subsequente ativação da PKC (Evcimen and King,2007).A via DAG/PKCtambémpode ser ativada pela hiperglicemiacomoresultado doaumentodoestresseoxidativo,comoporexemplo,peloaumento deperóxidode hidrogênio,oqualé umconhecidoativador da PKC,sejade forma diretaouindiretapelo aumentoda produçãodoDAG.(Konishietal.,1997;Nishikawaetal.,2000).A PKCé um grupo de proteínas,membroda família de proteinoquinasesdependentesdoAMPc,que apresenta múltiplas funçõescelularese afeta muitas viade transduçãode sinais(Geraldes and King, 2010).

O DAG é oprincipalativador fisiológico da PKC.O aumentodosníveisde DAG nodiabetespode ocorrer atravésde múltiplasvias(EvcimenandKing,2007)e sua ativaçãoestádiretamente relacionada coma hiperglicemia dospacientesdiabéticose desenvolvimento das alterações neurovasculares (Evcimenand King, 2007).

Umdosmecanismos fisiológicosimportantenaregulaçãodeproteínas intracelularesé odeadicionarou removergruposfosfatos,tornandoessasproteínasem enzimas,receptoresou segundo-mensageiros. Umasérie de respostascelularesmediadas por receptorese pelasviasmetabólicaspode serativada oudesativadapor quinases(com adiçãodegrupofosfato)intracelulares.A PKCéuma dastrêsprincipaisquinasesserina- treonina(sãoaquelasque fosforilamproteínasemresíduosserina e treonina) estando envolvida emeventosde transduçãode sinais,respondendoàestímulosespecíficos hormonais, neuronais e de fatores de crescimento(Geraldes and King, 2010).

A família da PKCapresentapelomenos12isoformas(α,βI,βII,δ,ε,γ, t,ƞ,λ, μ,θ,ζ),classificadasem:(1) Convencionais(α,βI,βII e γ)que são cálcio-dependentes ativadaspelafosfatidil-serinaepeloDAG;(2)Originais(δ,ε,θeƞ)quesãocálcio-

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independentes, reguladaspeloDAG e fosfatidil-serina);e (3) Atípicas(ζ,te λ) que são cálcio-independentesenão requeremDAG paraativação(WhitesideandDlugosz,2002; Geraldesand King,2010).

Omecanismopeloquala PKCcontribuipara o desenvolvimentodaneuropatia diabética ainda nãoestá esclarecido,noentanto,temsidodemonstradoque algumas isoformasda PKCcontribuempara o desenvolvimentodasneuropatiasinduzidaspelo diabetesinterferindoemmecanismosneurovascularestaiscomofluxosanguíneo e velocidade de conduçãonervosa(GeraldesandKing,2010). Nestesentido,estudos imunohistoquímicosdemonstrarama presençadasisoformasPKC-α,-β1,-β2,-εe –δem tecidos

neurais (Kimet al., 1991; Borghiniet al., 1994).

A PKC-α é umasdasisoformasmenosestudadas,apesar de estudosterem demonstradosua presença emtecidosneuronais (EvcimenandKing,2007), existe uma escassezdeestudosdemonstrando seu papelemalteraçõesneurovasculares.Emtecido cardíaco, apesar de estudos iniciais sugerirem queaPKC-αtenhaum importante papel para estimular a hipertrofia destestecidos,pesquisasemratos,suportama teoria de PKC-α no tecidocardíacotemumpapelregulador da contratilidadetecidualaoinvésda induçãode hipertrofias (Evcimen and King, 2007).

A PKC-βestáenvolvida emváriasfunçõescelularesdiferentes,taiscomoa ativaçãodecélulasB,ainduçãodeapoptose,proliferaçãodecélulasendoteliais, ea absorção intestinal de açúcares. Tem sido a isoforma mais estudada em relação à neuropatia.Estudosmostramque a utilizaçãode inibidoresde PKC-βemcasosde animais diabéticosinduzidosporestreptozotocinaaumentouofluxosanguíneononervociático

bemcomosuavelocidade de condução,sugerindoque a microcirculaçãoe a isquemia estejamenvolvidasna neuropatia diabética,bemcomoaativaçãodestaisoforma da PKC (Sasaseet al., 2004).

A PKC-δé bastante expressa no cérebro, medula e neurônios. Tem sido demonstradoqueaPKC-δestárelacionada aváriasfunçõesneuronaistaiscomoa potenciação de longo prazo (LTP)e depressão a longo termo (LTD). Tem sido demonstradoqueoaumentodaexpressãoda PKC-δestáenvolvidocomoaumentoda apoptose de células vasculares em retinopatia diabética, com sensível piora e

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irreversibilidade doquadro,mesmoapósocontrole da glicemia e diminuiçãoda expressão do DAG (Geraldesand King, 2010).

A PKC-εtem sido bem estudada por estar envolvida em várias funções celulares diferentes, tais comoa apoptose, a cardioproteção naisquemia, o choque térmico deresposta,liberaçãoinsulínicaedesenvolvimentodehiperalgesiainflamatória. Neste contexto,sabe-se que asinjurias teciduaiseoprocessoinflamatóriodecorrenteestão associadosà síntesedeprostanóides quesensibilizamosneurôniossensitivosprimários resultando em hiperalgesiaatravés da ativação da PKC-ε(Sachs et al, 2009).

Emsuma,considerandoqueaalteração desensibilidade induzidapelodiabetes nosistema trigeminalpode ocasionar lesõesseverasna ATM,esteestudotemcomo proposta avaliar as condições dolorosas induzidaspelo diabetes naATM deratos e associá- las avariação da expressão as isoformas daPKC-α, -β1, -β2, -ε e–δno tecido periarticular.

Considerando que mudanças no comportamento e estilo de vida dos seres

humanos, como sedentarismo e obesidade, no último século, têm resultado em um dramáticoaumentona incidênciadodiabetesnomundo(Zimmetetal.,2001), tratando-se de umcrescente problema de saúde pública,sendoresponsávelpor umaltoíndice de morbidade emortalidade (Libmanetal.,1993;Linetal.,2014),odesenvolvimentodo

trabalhopropostoéderelevânciaclínicaumavezqueauxilianomelhorentendimento sobre osmecanismosenvolvidosnasalteraçõesda sensibilidade somáticana ATMpelo diabetes e

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3. PROPOSIÇÃO

Considerando que a neuropatia periférica induzida pelo diabetes está relacionada comofatorderiscopara odesenvolvimentodeumadisfunção temporomandibularsevera, o presente estudoapresentou os seguintes objetivos:

(1) Avaliarodesenvolvimentodecondiçõesdolorosasinduzidaspelodiabetes na ATM deratosatravésdostestesdeavaliaçãodocomportamentonociceptivoinduzido pela da formalina e/ou capsaicina.

(2)AvaliarasalteraçõesdaexpressãodasisoformasdaproteinoquinaseC–

PKCα,PKCβ1,PKβ2,PKCδePKCε–notecidoperiarticularemratosdiabéticosatravés do método

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4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Animais

Para arealizaçãodestetrabalhoforamutilizadosratosmachosWistar provenientesdoCEMIB(CentroMultidisciplinar paraInvestigaçãoBiológica na Área da CiênciaemAnimaisdeLaboratório)e mantidosnoBiotérioda FOP-UNICAMP.Os animaisforammantidosemgaiolasplásticas(4 por gaiola) contendomaravalha, em ambientecomcontroledeluminosidade(ciclosclaro/escurode12h)etemperatura(23oC

+/-1oC),comalimentaçãoeágua,adlibitum.Todososprocedimentosexperimentaisforam

aprovadospeloComitêde ÉticaemExperimentaçãoAnimaldaUniversidade Estadualde Campinas,protocolo2835-1(AnexoI)eestãodeacordocomasdiretrizesdeterminadas

peloConselhoNacionalde Controlede ExperimentaçãoAnimal(CONCEA)e pela AssociaçãoInternacionalpara Estudoda Dor (IASP),emanimaisconscientes (Zimmermann, 1983).

4.2. Delineamento experimental

Pararealização dos experimentosos animais foram divididos em2 grupos: GRUPOI: Normoglicêmicos GRUPOII:Diabéticos Nostempos7,14,21,28,35e42diasapósainduçãododiabetes,todosos animaisreceberamumainjeçãointra-articular,naATMdireita,de30µIdeFormalina 1.5% (Roveronietal.,2001)oucapsaicina1,5%e oscomportamentosnociceptivosforam avaliados(item4.4).Imediatamente apósasanálisescomportamentaisosanimaisforam mortospor decapitaçãopararemoçãodeamostrasde tecidoperiarticular e posterior realizaçãodasanálisespor WesternBlot(item4.5). Foramutilizados4 a 6animaispor grupoexperimental.

11

4.3. Indução do Diabetes

O diabetesfoiinduzidonosanimaiscom2mesesde idade,por meiodeuma injeçãointraperitonealdeestreptozotocina(STZ;Sigma-Aldrich,USA)75mg/kg (Courteix

etal.,2007)dissolvidaem0,1Mdetampãocitrato(pH4.5).Osanimaisforamsubmetidos a

umjejumde 8horasantesda injeçãodeSTZ.Ainduçãoda diabetesfoiconfirmada atravésda dosagemdonívelde glicose plasmática por amostrasde sangue da veiacaudal utilizandoo método enzimáticoglicose-oxidase(OptiumXceed;Abbott).Foram considerados paraoestudo apenasos animais queapresentaram concentração plasmática de glicose maior que 300mg/dlapósjejumde 8horas (Braga etal.,2011). Osanimais normoglicêmicos(controle) receberamumainjeçãointraperitonealapenasdoveículo.O peso corporal e a concentração de glicose plasmática foram avaliados semanalmente

durante todo o períodoexperimental, conforme descrito acima.

de ratos

4.4.AvaliaçãododesenvolvimentodecondiçõescomportamentaisnaATM

Assessõesde teste foramrealizadasdurante a fase claraentre 9he 17h emsala silenciosa,comtemperaturaambientemantidaa25°C(Rosland,1991). Duranteotesteos animaisnãotiveramacessoàáguaouàcomida.Paraminimizaroestresseduranteas

sessõesexperimentais,osanimaisforampreviamentemanipuladospelopesquisadorpor umperíodode7dias.Narealizaçãodasanálisescomportamentaisusou-seumacaixade

observaçãomedindo30x30x30cmcombase e3lateraisespelhadase frente de vidro.Cada animalfoiinicialmentecolocadoemantidonacaixapor10minutosparahabituar-seao ambiente de experimentação eminimizar o estresse (Abbottet al. 1986).

4.4.1.Injeções naregiãodaATM:Paraadministraçãode formalinaou

capsaicinanaregiãodaATM direita osanimaisforambrevemente anestesiadospor inalação deIsoflurano.Aseguir,umaagulhacalibre 30,conectadaaumaseringade microlitroHamilton(50µl)porumtubodepolietilenoP50,foiinseridanaporção

12

inferiordabordapóstero-inferiordoarcozigomático,sendoavançadaemdireção anterior até contactar a região póstero-lateral do côndilo.

4.4.2. Testecomportamental:Imediatamenteapós ainjeçãointra- articular

oanimaljáconsciente, foirecolocadona câmara deobservaçãoeas respostascomportamentaiscaracterizadaspeloatode coçar a regiãoinjetada coma patadianteiraoutraseira epeloatodelevantar reflexamentea cabeçaforam quantificadasdurante45min.paraosanimaistratadoscomformalinae30min. para osanimaistratadoscomcapsaicina.Otempoemsegundosqueoanimal

permaneceucoçandoaregiãoorofacialfoiquantificadoatravésda utilizaçãode um cronômetro,e onúmerode vezesque oanimallevantoureflexamente acabeça foi quantificadoporumcontadordecélulas(Roveronietal.,2001).Considerandoque

oatodelevantarreflexamenteacabeçasegueumpadrãouniformede1sde

duração,aintensidadeda resposta nociceptivafoiquantificada somando-se esse comportamentoaoatode coçar aregiãoinjetada,comopreviamente padronizado (Roveroni et al., 2001). 4.5. AvaliaçãodaexpressãodasisoformasdaPKCnotecidoperiarticular -WesternBlot AsamostrasdotecidoperiarticularforamhomogeneizadasemtampãoPBS,pH 7.4,contendoinibidoresde protease:etilenodiaminatetracetatodesódio(EDTA) 10mM, Benzamidina1mM,fluoretodefenilmetilsulfonila(PMSF)0,3mM,Aprotinina0,3µMe β-mercaptoetanol2mM,embanhode gelo.Umaalíquotadohomogeneizadofoiseparada paradosagemdeproteínas.Emseguidaasproteínasforamseparadasporeletroforeseem

geldepoliacrilamida SDS-PAGE10%etransferidaspara membranasdenitrocelulose.As membranasforamincubadas"overnight" a4°Ccomtampãodebloqueio{PBS5%(p/v)de leite desnatadoe 0,1% Tween20}.As membranasforamlavadastrêsvezescom PBS0,1% Tween 20. Em seguida foram incubadas em solução de PBS contendo 5% de leite desnatadoe0,1%Tween20contendoanticorpoprimárioespecíficoparacadaisoforma

13

testada. Apósalavagem,asmembranasforamincubadascomanticorpo secundário conjugadoHRPe novamente lavadas.Asmembranasforamentãoreveladascomkitde quimioluminescência(ECL,Amershan PharmaciaBiotech,Little Chalfont,U.K.) como descritonomanualde instruções.O controle negativofoiobtidopela omissão doanticorpo primário.A densitometria dasbandasfoirealizada atravésdoprogramaImage J.Osdados foram normalizados considerando o controle (NG)igual ao valor 1.

4.6. Análise dos Resultados

Osdadosforamavaliadospela análise de variância a doiscritériosde avaliação (Two-wayANOVA).AscomparaçõesmúltiplasforamfeitaspeloTestedeBonferroni.

Paratodosostesteso níveldesignificância foiestabelecidoemp<0,05.Oprograma GraphPad Prism 4.0 foi utilizado paraa realizaçãodos cálculos estatísticos.

14 pe s o (g ) g lic o s e (m g /d l) 5.RESULTADOS

Todososanimaisforam pesadosimediatamente antesdainduçãododiabetes,e duranteoexperimentoforamfeitasmedidas daglicemia e dopesocorporalapósumjejum de8horas.ConformedemonstradonaFigura1,os animaisdiabéticosdemonstraram aumentosignificativodaconcentraçãoplasmáticade glicose(Figura 1A),assimcomouma perda progressiva de peso (Figura 1B) ao longo do tempo, confirmando a indução e

manutenção dadoença. (A) 500 400 + 300 + + + + + Normoglicêmicos Diabéticos 200 100 0 7 14 21 28 35 42 Dias (B) 400 Normoglicêmicos Diabéticos 300 200 + + ₊ + 100 0 7 14 21 28 35 42 Dias

15 C o m po rt a m en toN o c ic ep ti v o (s ) Figura1.Dosagem deGlicemia(mg/dl)ePesoCorporal(g)emrelaçãoaotempoemanimais diabéticos.(A)Osanimais diabéticosapresentaramconcentraçãodeglicoseplasmáticaacimade300mg/dl 7diasapósainduçãododiabetes.Osanimaisdiabéticosapresentaram umaconcentraçãodeglicose plasmáticasignificativamentemaioremrelaçãoaosnormoglicêmicosemtodosostempostestados(p<0,05: Two-ANOVA, TestedeBonferroni).(B)Foiobservadaumaperdasignificativaeprogressivadopesodos animaisdiabéticos21diasapósainduçãododiabetes.Osanimaisdiabéticosapresentarampesocorporal

significativamentemenoremrelaçãoaos normoglicêmicosapartirdo21ºdia deindução da doença(p<0,05: Two-ANOVA, TestedeBonferroni).Osímbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreanimais normoglicêmicose diabéticos.

Os dados demonstraram que os animais diabéticos apresentaram hiponocicepção na ATM 7 dias após a indução do diabetes. Esta hiponocicepção foi

observadaaté 42 dias após a indução do diabetes(Figura2).

250 200 Normoglicêmicos Diabéticos 150 100 50 + + ₊ + + + 0 7 14 21 28 35 42 Dias Formalina1,5% Figura2.FaseinicialdodiabetesinduzahiponocicepçãonaATM. Ainjeçãointra-articulardoagente inflamatórioformalina(1,5%)induziuumarespostanociceptivasignificativamente menornosratos diabéticosquando comparadoscomosanimaisnormoglicêmicosnos dias7,14, 21, 28,35e42diasapós induçãodadoença(p<0.05:Two-wayANOVA,testedeBonferroni).Osímbolo(+)indicadiferença

16 C o m po rt a m en toN o c ic ep ti v o (s )

Combase nosresultadosde hiponocicepçãoobservadosnográficoanterior,os experimentosforamreplicadoseosanimaistratadoscomuma injeçãointra-articular de capsaicina,umestímulonocivoque induzresposta nociceptiva atravésdosreceptores vanilóidesTRPV1 nasfibrasC-nociceptivasperiféricas(Tominaga andTominaga,2005; Niliusetal.,2007;Zhangetal.,2007).Os resultadosdemonstraramque asanimais diabéticosapresentaramhiponocicepçãoapenas7,14,21e28diasapósainduçãodo diabetes. 200 Normoglicêmicos Diabéticos 150 100

*

*

*

50

*

0 Veículo 7d 14d 21d 28d 35d 42d Capsaicina1,5% Figura3.Avaliaçãodainduçãodahiponocicepção pelafaseinicialdodiabetesnaATMpelotesteda capsaicina.Ainjeçãointra-articular decapsaicina(1,5%)induziuumarespostanociceptiva significativamentemenornosratosdiabéticosquandocomparadoscomosanimaisnormoglicêmicosnosdias 7,14,21e28diasapósinduçãodadoença(p<0.05:ANOVA,testedeTukey).Osímbolo(*)indica diferençaestatísticaentreosanimaisdiabéticose seusrespectivoscontroles. Considerandoosresultadosacimadescritos,emuma segundaetapa de experimentos,foiavaliadaarelaçãodaexpressãodediferentesisoformasdaPKCcoma hiponocicepçãoinduzidapelodiabetesnosdias7,14,21e28diasapósainduçãoda doença.

Foram avaliadas 5 isoformas da PKC no tecido periarticular da ATM testada: PKC-alpha (PKC-α), PKC-beta1 (PKC-β1), PKC-beta2 (PKC-β2), PKC-delta

17

(PKC-δ)ePKC-epsilon(PKC-ε). Osresultadosdemonstraramqueosanimaisdiabéticos apresentaramumaexpressãoda PKC-α significativamente menoremrelaçãoaos normoglicêmicos(Figura4).

Figura4:Avaliação daexpressão daPKC-αnaATMdeanimais diabéticos em relaçãoaos

normoglicêmicos.AexpressãodaPKC-α notecido periarticulardosanimaisdiabéticos (DB)foisignificante

menoremrelaçãoaos animaisnormoglicêmicos(NG) nostempos7, 14 e 21dias (p<0.05:Two-way ANOVA,testedeBonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

Aanálise por WesternBlotdasdemaisisoformas demonstraramque a expressãodaPKC-β1ePKC-β2(Figura5),PKC-δ(Figura6)ePKC-ε(Figura7)foi

significativamentemaiornosanimaisdiabéticosemrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos. A expressão dasproteinoquinases PKC-β1 ePKC-β2estãoaumentadasnosanimais diabéticos

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Figura5:AvaliaçãodaexpressãodaPKC-β1ePKC-β2naATMdeanimaisdiabéticos emrelaçãoaos

normoglicêmicos.Aexpressão daPKC-β1ePKC-β2notecidoperiarticulardosanimaisdiabéticos(DB)foi

significantemaioremrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos(NG)emtodosostempostestados(p<0.05:Two- way ANOVA,Testede Bonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

AexpressãodaPKC-δfoisignificativamentenosanimaisdiabéticosapartirdo 7º dia daindução dadoença(Figura6).

19

Figura6:AvaliaçãodaexpressãodaPKC-δ naATMdeanimaisdiabéticos emrelaçãoaos

normoglicêmicos.AexpressãodaPKC-δnotecido periarticulardosanimais diabéticos(DB)foisignificante

maioremrelaçãoaosanimaisnormoglicêmicos (NG)emtodosostempostestados(p<0.05: Two-way ANOVA,testedeBonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreosgrupos.

AexpressãodaPKC-εfoisignificativamentenosanimaisdiabéticosapartirdo 7º dia daindução dadoença(Figura7).

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Figura7:Avaliação daexpressão daPKC-εnaATMdeanimaisdiabéticosem relaçãoaos

normoglicêmicos.Aexpressão daPKC-εnotecido periarticulardosanimais diabéticos(DB)foisignificante

maioremrelação aosanimaisnormoglicêmicos(NG)apartirdo21ºdiadeindução dadoença(p<0.05:Two- way ANOVA,testede Bonferroni).O símbolo(+)indicadiferençaestatísticaentreos grupos.

21

6. DISCUSSÃO

No presente estudofoi demonstradoque odiabetesinduzuma hiponocicepção na ATM a partir do7ºdia de induçãoda doença.Estesdadossugeremquea fase inicialdo diabetesinduzumaalteraçãosensorialnosistematrigeminalquepodeestarrelacionado

comaslesõesdostecidosoraisdepacientesdiabéticos(Collinetal.,2000;Arapetal., 2010; Zhu&Nilolajczyk, 2014).

Nopresenteestudoodiabetesfoiinduzido nosanimaisatravésdeumainjeção intraperitonealdeSTZ(75mg/kg)(Daulhacetal.,2006;Courteixetal.,2007,Leietal.,

2013),sendoquea confirmaçãoda instalaçãodadoençafeitapeladosagemperiódica da concentração plasmáticaeglicoseeavaliação dopeso corporal dos animais. De acordo com a evoluçãoda doença,osanimaisdiabéticosdemonstraramglicemiasuperior a 300mg/dle perdaprogressivado peso corporal, validando omodelo experimental.

Ainduçãododiabetesatravésda STZ éummodeloexperimentalcomumente utilizadoparaavaliaçãodasalteraçõesnociceptivasinduzidaspelodiabetes(Daulhacetal.,

2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013). ASTZ éuma nitrosamidalargamente utilizada comoindutora de diabetesemanimaisexperimentais,que temcomoefeito,a destruiçãodascélulasbeta-pancreáticaseconsequentementeumadeficiêncianaprodução

deinsulina.AliteraturademonstraqueainduçãoexperimentaldediabetescomSTZem

roedoresinduzhipernocicepçãoemdiferentes modelosexperimentais. Particularmente, tem sidodemonstradoque odiabetesinduzhipernocicepçãona pata 3a 4semanasapóso tratamentosistêmicocomSTZ(Daulhacetal.,2006;Courteixetal.,2007,Leietal.,

2013).

Aliteratura temdemonstradoqueasestruturasorofaciaissãoafetadaspelo diabetes (Trogeret al., 1999; Colinet al, 2000; Bragaet al., 2001),no entanto, o númerode estudos é escassoeos dados contraditóriosemrelaçãoàs alterações nainervação trigeminal pelodiabetes.Utilizandoomodelode diabetesinduzidopelaSTZ,Rodella etal.(2000) demonstrara,queafaseinicialdodiabetesinduzhipernocicepçãotérmicafacialeapós8a

12semanasdepoisdainjeçãodaSTZ,enquantoNonesetal.(2013)nãoobservoudiferença na estimulação térmica e tátil orofacial na fase inicial do diabetes. Em uma análise

OpresenteestudodemonstrouqueodiabetesinduzhiponocicepçãonaATM observadopelotestedaformalinaaté42diasapósotratamentosistêmicocomSTZ.Para

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comparativa entre osdoisestudossupra citadose oatualtrabalho,doisaspectosdevemser observados:aregiãoavaliada entre osestudos(pata,facee ATM) e otipode teste utilizado paradetecção das alterações dasensibilidade somática(teste térmico, mecânicoepor agente químico).

Emrelaçãoà região avaliada entre osestudossabe-se que a diferençaentre tecidossubcutâneos(face,pata e lábio) e tecidosprofundos(ATM) resulta dofatode que estestecidossãopredominantemente inervadospor diferentessubtiposde neurônios aferentesprimários.Devidoaofatodasinervaçõesde tecidoprofundoinduziruma maior ativaçãona excitabilidade de neurônioscentraisemrelaçãoàsinervaçõesde tecidos cutâneos,maioresdistúrbiossensoriaispodemocorreremcondiçõesdolorosas envolvendo tecidosprofundos (Imbeetal.,2001).Alémdomais,já foidemonstradoque ostecidosda ATM sãomaissensitivosa processosinflamatóriosenvolvendo liberaçãode aminas simpatomiméticas e PGE2do quetecidos cutâneos(Rodrigueset al., 2006).

Outropontoaserconsideradoéadiferençadetestesutilizadosnosdiferentes

estudos.O testetérmicodetecta principalmenteativaçãode fibrasnociceptivas superficiais, enquantooteste mecânico detectanociceptoressubcutâneos,envolvendo diferentes mecanismosna ativaçãodestasdiferentesfibrasnociceptivas(Vivancosetal.,2003; Pedrosa, 2011).

O teste daformalina (teste químico) induzuma hipernocicepçãoproduzidapela sensibilizaçãoperiféricadosnociceptoreseestruturasneuronaisenvolvidas(Roveroniet

al.,2001;Clementeetal.,2004).No presente estudo,foi utilizada formalina na concentraçãode

1.5%, considerada uma concentraçãoda formalina (testequímico),induz uma hipernocicepçãoproduzida pela sensibilizaçãoperiférica dosnociceptoressubmáxima (Roveroni etal., 2001;Clementeetal., 2004) permitindo avaliarrespostastanto hipernociceptivas quanto hiponociceptivas de alterações sensoriais neuronais. Sendo assim,pode-se hipotetizar que o fatoda ATM envolver tecidosprofundoscomdiferentes subtiposdeinervaçõessomáticaseseremmaisresponsivosamediadoresinflamatórios, pode explicar, pelo menos em parte, as diferençasencontradas entreosestudos.

debilitanteempacientesdiabéticosqueacometeemproporçãocrescentenestespacientes

23

confirmareverificarumpossívelmecanismo envolvidocomahiponocicepção,os experimentosforamreplicadosutilizandoo testedacapsaicina.Noentanto,a hiponocicepçãoinduzida pelodiabetesna ATM foiobservadanoteste dacapsaicinaaté28 dias após o tratamento sistêmico com STZ.

Otestedaformalinaéumtesteamplamenteutilizadopara avaliaçãodosefeitos de novasdrogasanalgésicase/ouanti-inflamatóriasemanimaisexperimentais.O agente nociceptivoformalina induzuma resposta dolorosa bifásica:a primeira fase(neuronal)é caracterizadapelaativaçãode receptoresTRPA1nosneurôniosnociceptivosaferentes primários;enquantoqueasegundafase(inflamatória)éresultadodeumasensibilização

dosnociceptoreseestruturasneuronaiscomprojeçãocentral(McNamaraetal., 2007). Basicamente a injeçãoemtecidosperiféricosdoagenteformalina agediretamentenos receptoresTRPA1 (receptoresdotipoionotrópicos) ativandoasfibrasnociceptivas primárias, mas também,induzdano tecidual econsequentemente migraçãodecélulas inflamatórias, particularmente osmastócitos.Uma vezativados,osreceptoresTRPA1,via liberação deneuroquininas,estimulamadegranulaçãodosmastócitosliberandohistaminae

5-hidroxitriptamina,que atravésde uma açãosinérgica,sensibilizamasfibrasC- nociceptivas desenvolvendo um quadrodehipernocicepção (Paradaet al.,2001; Ting et al.,

2007; Macphersonet al., 2007; MacNamaraet al.,2007;Fisheret al., 2008).

Por outrolado a capsaicina é conhecida por ativar receptoresvanilóidestipo TRPV1 nasfibrasperiféricasC-nociceptivasqueaumentaacondutânciadascorrentesde Na+ eCa2+ resultandoemcomportamentosnociceptivos(TominagaandTominaga,2005; Niliusetal.,2007).TantoosreceptoresTRPA1comoosreceptoresTRPV1 aumentama permeabilidadeaoCa2+.O aumentodaconcentraçãodeCa2+intracelularativacascatas de sinalizaçõesbioquímicas,comoporexemplo,a viafosfolipaseC(PLC)/diacilglicerol (DAC) / ProteinoquinaseCque porsuavezresultamna sensibilizaçãodefibrasaferentes primárias(Costigan andWoof, 2000; Woolfand Salter, 2000).Sendo assim,a diferença entre osresultadosobtidosnostestesdaformalina ecapsaicina podemestar relacionados com o mecanismo deação de cadaum dos respectivos agentes algésicos.

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duranteaprogressãodadoença(Daulhacetal.,2006).Emdecorrênciadadebilitação

severadasneuropatiasinduzidaspelodiabetes, estudosvêmexplorando seusmecanismos para melhorentendimentodadoençaeassimdesenvolvernovasperspectivasterapêuticas

paraseucontrole etratamento (Boultonetal. 2005).

Váriossãoosmecanismosdescritosenvolvidosna gêneseda neuropatia diabéticacomoliberaçãodemetabólicos,alteraçõesvascularese reaçõesautoimunes. No entanto,aliteraturasugere uma relaçãodiretaentreoestadohiperglicêmico,mantido cronicamente e ascomplicaçõesmicro e macrovasculares,suportandoa hipótese de que a hiperglicemia seja o fatordeterminante nagênesedascomplicaçõesdodiabetes.Temsido demonstrado que a hiperglicemia induz as complicações neurovasculares através da ativação davia Diacilglicerol/ProteinoquinaseC (DAG/PKC) (Evcimenand King, 2007).

O DAG é oprincipalativador fisiológico da PKC.O aumentodosníveisde DAGnodiabetespodeocorreratravésdemúltiplasvias(EvcimenandKing,2007).O DAGpodeser derivadodahidrólisedefosfatidilinositídeos;pelo metabolismoda fosfatidilcolina poraçãoda fosfolipase C;oupela sínteseatravésdosintermediários glicolíticos,fosfatode diidroxiacetona egliceral-3-fosfato;comsubsequente ativaçãoda PKC(EvcimenandKing,2007).Avia

DAG/PKCtambémpode ser ativada pela hiperglicemia

comoresultadodoaumentodoestresseoxidativo,comoporexemplo,pelo

aumentodooxidanteH2O2,oqualéumconhecidoativadordaPKC,sejadeformadireta

ouindiretapeloaumentodaproduçãodoDAG.(Konishietal.,1997;Nishikawaetal., 2000).

A PKCé umgrupo de enzimasmembrosdafamília deproteinoquinases dependentesdoAMPc,queapresentammúltiplas funçõescelulareseafetammuitasviasde transduçãode sinais. No entanto,omecanismopeloquala PKCcontribuiparao desenvolvimentoda neuropatia diabética ainda nãoestáesclarecido.Nopresenteestudofoi demonstradoquea hipoalgesia demonstrada nosanimaisdiabéticosestá relacionadacomo aumentodaexpressãodasPKC-β1,PKC-β-2,PKC-δePKC-εediminuiçãodaexpressão

daPKC-α.

Oimportantepapeldoaumentodasatividadesdaaldoseredutase(importante mediadornometabolismodaglicose)ediferentesisoformasdaPKCrelatadosemestudos

25

experimentaistêm sidoconfirmados emestudos clínicos em pacientesdiabéticos com polineuropatiasensório-motora(Obrosova2009).Particularmente,aPKC-β(Sasaneetal.,

2005)e PKC-ε (Huchoetal.,2005)estãodiretamenteenvolvidasnodesenvolvimentoda hipernocicepção(incluindohipernocicepçãodecorrentedodiabetes),enquantoqueaPKC- δ e PKC-α estão vinculadasa danosneurais(Robertsetal.,1997; Sakaueetal.,2003).É importanteressaltar,quepesquisaspara odesenvolvimentodepossíveistratamentospara a neuropatiainduzidapelodiabetesvêmutilizandoinibidoresdestesmediadores(Obrosova,

2009).

OaumentodaexpressãodasPKC-β,PKC-δePKC-εrelacionadoà hiperglicemia induzida pelo diabetes demonstrado no presente estudo, corrobora a literatura,noentanto,naATMfoiobservadoquadros de hiponocicepção.Por outrolado, a expressão daPKC-αfoisignificativamente menor nosanimaisdiabéticosem relaçãoaos animaisnormoglicêmicos.Considerandoofatode que existe umarelaçãoentre PKC-α e a bombaNa+/K+/ATPase(Yangetal.,2012);equeodiabetesinduzumainibiçãodabomba

Na+/K+/ATPasepromovendoumaretençãodeNa+,comconsequenteedemadabainha

mielínica,disjunçãoaxogliale degeneraçãonervosa (Gagliardietal.,2003),é possívelque nostecidosda ATMafase inicialdodiabetesinduzumadiminuiçãona expressãoPKC-α e consequentemente inibiçãoda bombaNa+/K+/ATPase,diminuindoassima excitabilidade neuronal econsequentemente induzindo a umahiponocicepção.

26

7. CONCLUSÃO

Opresenteestudodemonstrouque a faseinicialdodiabetesinduzuma hiponocicepçãona ATM de ratose estáassociada aoaumentoda expressão dasisoformas PKC-β1, PKC-β2, PKC-δ ePKC-ε, assim como com a diminuição da expressão daPKC-α.

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33

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.' ' 'M1 ANEXO1 CEVA!Unioe.mp

ComissAo deEticanoUsodeAnimais

CEUAIUnieamp

CERTIFICADO

Certifieamosque oprojelo "AVALIACAODODESENVOLVIMENTODE NEUROPATIA DIABETICANAATMDERATOSE0PAPELDASISOFORMAS DAPROTENOQUINASEC!PKClNESTEPROCESSO"(protocolo n•28351),

sobaresponsabllidadedeProfa.Ora.JulianaTrindadoClomenteNaplmoga1 Augusto Muzilli Junior,esta deacordo com os Pr·incipiosE.ticosna

ExperimentacaoAnimaladotadospelaSoeledadeBraslielradeCl6nelaem AnimalsdeLaborat6rio(SBCAL)ecomalegislayaovigente,LEIN°11.794,DE

8DEOUTUBRODE2008.queestabeleeeprocedimentosparaousoeientlficode animais,eoDECRETON•6.899,DE15DEJULHODE2009.

0projeto foiaprovadopelaComissaodeEteano UsodeAnmi alsda UniversidadeEstadualdeCampnas•CEUAIUNICAMP•em27de agosto de

2012.

7deagostode2012.

Proia.Ora.Ana

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