A citoaderência de P. falciparum ao receptor humano endotelial ICAM1 ocorre pela interação especifica do domínio DBLβ seguido do domínio C2, sendo que estes são sempre encontrados em tandem em todos os repertórios de genes var completos analisados (132). Em 2003, Kramer e colaboradores (219) publicaram um artigo onde descreviam uma nova ferramenta para a amplificação de outros domínios DBL, uma vez que até aquele momento as únicas ferramentas descritas para a identificação de genes var parciais eram concentradas no domínio DBLα. Com isto, utilizamos o par de oligonucleotídeos descritos por estes autores para a amplificação do domínio DBLβ nos transcritos dos isolados selecionados
para CHOICAM1. Um fragmento de aproximadamente 500 pb foi amplificado a partir do
cDNA de todos os isolados selecionados para CHOICAM1 (Figura 17).
Figura 17. Amplificação do cDNA codificador do domínio DBLβ dos isolados selecionados em CHOICAM1.
Acima são indicados a fita molde utilizada para amplificação. RT (-) corresponde ao controle negativo da reação, onde a reação de RT-PCR foi onduzida na ausência de trascriptase reversa, para que possa ser excluída a presença de gDNA contaminante. RT (+) corresponde ao produto amplificado a partir do cDNA de cada isolado. G corresponde ao produto amplificado a partir do gDNA destes isolados. Abaixo são indicados os isolados. A seta indica o produto amplificado de aproximadamente 500 pb, em gel de agarose 1,2%, corado com brometo de etídeo.
No total foram analisadas 136 seqüências do domínio DBLβ (entre 13 e 22 por isolado). Em todos os isolados foi possível identificar um domínio observado com maior freqüência, e que denominamos de transcrito predominante. Nos isolados 32, 134, 135, S20 a seqüência predominante foi encontrada em mais de 50% dos clones analisados, no entanto, nos isolados 114, 106 e no clone 3D7 o mesmo não foi observado.
O caso particular das seqüências DBLβ encontradas no isolado 106 chama atenção. Entre três seqüências identificadas, duas são muito similares, tendo uma identidade de 93,5% entre estas. Estas duas seqüências são idênticas até o quarto final, onde divergem, resultando em duas seqüências diferentes.
Como estamos interessados em domínios que possam ser expresso no eritrócito infectado as seqüências nucleotídicas foram traduzidas à seqüências de aminoácidos. Isto
resultou em um descarte de 25% das seqüências devido a algum tipo de stop codon. Infelizmente é difícil distinguir stop codons reais, daqueles que foram introduzidos artificialmente. No entanto, alguns casos, como no isolado 32, foi observado o mesmo stop
codon em diversos clones diferentes, o que reforça a idéia de que seja um stop condon real.
Figura 18. Análise dos domínios DBLβ transcritos nos isolados selecionados em CHOICAM1, identificados a
partir do alinhamento de suas seqüências nucleotídicas. No eixo y é dada a freqüência da seqüência encontrada, dada pela porcentagem de clones (a freqüência foi igual ao número de clones encontrados referentes à seqüência dividido pelo número total de clones analisados, multiplicado por 100).
Após a eliminação de seqüências com stop codon, restaram 102 seqüências protéicas, onde foram identificadas 19 seqüências distintas. Quatro destas seqüências foram predominantes, pois foram encontradas em maior freqüência. Estas representam 67,6% de todas as leituras de seqüências traduzidas. Entre estas, uma foi encontrada exclusivamente no clone 3D7 (seqüência 16b), enquanto as seqüências 4b, 10b e 18b foram identificadas e
predominantes apenas em isolados brasileiros. Assim como foi observado para o domínio DBLα, a mesma seqüência predominante foi identificada em diferentes isolados, indicando uma redundância de seqüências entre isolados geneticamente distintos.
Entre as seqüências tidas como predominante, a seqüência 04b foi encontrada nos isolados 114 e 135, sendo predominante no isolado 114 (freqüência de 45%), e a segunda mais abundante no isolado 135 (21,4%). A seqüência 10b está presente nos isolados 106, 134 e S20, e em todos estes é a seqüência encontrada com maior freqüência (70%, 56,3%, 63,6%, respectivamente). A seqüência 18b foi encontrada nos isolados 32, 135 e 114, sendo também a seqüência predominante em todos estes isolados, com freqüências observadas de 75%, 35,7% e 45% respectivamente.
Cabe salientar que a seqüência 18b e a seqüência 15a foram encontradas nos mesmos isolados (32, 135 e 114), enquanto que as seqüências 10b e 29a foram encontradas no outro grupo de isolados (106, S20 e 134). Isto pode sugerir que estas duas combinações de domínios DBL (15a-18b e 29a-10b) possam ser associadas à presença de pelo menos duas PfEMP1s distintas associadas ao fenótipo adesivo em questão nos isolados brasileiros analisados.
A seqüência 16b encontrada no clone 3D7 (56,3% de freqüência), corresponde ao gene PFF0845c (antigo MAL6P1.252) o qual está localizado dentro da região central no cromossomo 06.
Embora as seqüências 4b, 10b, 16b e 18b tenham sido identificadas ao transcrito relacionado ao fenótipo adesivo ICAM1, estas quatro seqüências possuem apenas 51,7% (+/- 2,73) de identidade entre si, não sendo diferente da média encontrada entre todas as seqüências DBLβ transcritas (51% Id, +/- 7,1). No entanto todas as quatro possuem os resíduos de cisteínas, tidos como fundamentais para a interação com o domínio ICAM1 conservados (Figura 20), reforçando a idéia de que a estrutura seria mais importante que a seqüência primária envolvida no fenótipo adesivo.
Figura 19. Análise dos domínios DBLβ transcritos nos isolados selecionados em CHOICAM1, identificados a
partir do alinhamento de suas seqüências traduzidas. Obs. Cores iguais indicam o mesmo isolado. Os traços indicam seqüências iguais que foram encontradas em isolados diferentes. No eixo y é dada a freqüência da seqüência encontrada, dada pela porcentagem de clones (a freqüência foi igual ao número de clones encontrados referentes à seqüência dividido pelo número total de clones analisados, multiplicado por 100).
Figura 20. Alinhamento das principais seqüências do domínio DBLβ encontradas nos isolados
selecionados em CHOICAM1. Os asteriscos indicam os aminoácidos idênticos conservados ao
longo da seqüência, pontos indicam aminoácidos similares.
4.8 Análise do repertório de famílias multigênicas de isolados de Plasmodium