Análise dos vinhos

Os vinhos, safra 2008, produzidos com os clones 169 e 685 da variedade Cabernet Sauvignon, locais A e B, foram analisados entre 6 e 8 meses após a microvinificação. Todas as análises foram realizadas em triplicata com três repetições para cada amostra de vinho.

2.5.1 Análises Físico-químicas

As análises físico-químicas realizadas foram pH (pH meter 220 MP Metler- Toledo), acidez total (g/L ácido tartárico), acidez volátil (g/L ácido acético) e teor alcoólico (ebuliometria) de acordo com a OIV (1990).

2.5.2 Determinação do conteúdo total das famílias de polifenóis

Os vinhos foram analisados por espectrofotômetro UV-VIS (Hitachi U 2010, CA, USA) quanto aos polifenóis totais (PT) (mg/L ácido gálico), polifenóis não- polimerizados (PNP) (mg/L catequina), polifenóis polimerizados (PP) (mg/L catequina), orto-difenóis (OD) (mg/L catequina), éster tartárico (ET) (mg/L ácido cafeico) e flavonol (FLV) (mg/L quercetina). PT foram determinados utilizando o reagente Folin-Ciocalteu (SINGLETON; ROSSI, 1965); PNP foi realizado através de reação com a vanilina e o PP através da diferença entre o teor de polifenóis totais expresso em catequina dos polifenóis não-polimerizados (PARONETTO, 1977); OD foram determinados utilizando o reativo de Arnow (FLANZY; AUBERT, 1969); éster tartárico e flavonol foram determinados de acordo com Glories (1978).

2.5.3 Parâmetros de cor

A cor foi determinada utilizando dois métodos: medida da absorbância espectrofotométrica do vinho em 420, 520 e 620 nm (GLORIES, 1984), realizada diretamente em cubeta de 1 mm, utilizada para determinar a intensidade da cor (IC): A420 + A520 + A620; e a tonalidade da cor (TC): A420/ A520.

A cor também foi determinada utilizando os parâmetros do sistema CIElab obtidos por colorimetria (Minolta Chromo Meter CR-400). Os parâmetros observados foram as coordenadas a* (índice cromático vermelho/verde), b* (índice cromático amarelo/azul), L* (luminosidade). C* (cromaticidade) foi calculado através da seguinte equação: C* = (a* 2 + b* 2)1/2.

O conteúdo de antocianinas monoméricas, poliméricas e copigmentadas nas amostras de vinhos foram determinados de acordo com Levengood e Boulton (2004). O método consiste nos efeitos colorimétricos do SO2 e acetaldeído sob as formas das

antocianinas. Neste processo, em uma amostra de 2 mL de vinho foi adicionado 20 µL de acetaldeído 20 % (v/v) e submetida a agitação e posteriormente repouso por 45 minutos no escuro (Aacet). Uma segunda amostra de 2 mL de vinho foi adicionada de 160 µL de solução de SO2 10 % (m/v) homogeneizada e deixado em repouso durante 10

minutos (ASO2). A absorbância para cada amostra foi medida em 520 nm utilizando cubeta de 1mm. Foi determinada a absorbância direta da amostra de vinho em 520 nm (Avinho). Para o cálculo foram utilizadas as equações abaixo, e as absorbâncias corrigindo para cubetas de 1 cm:

Antocianinas copigmentadas = Aacet - Avinho (1) Antocianinas monoméricas = Avinho - ASO2 (2) Antocianinas poliméricas = Aacet – Avinho (3)

O teor de antocianinas monoméricas totais (AMT) foi determinado através do método do pH diferencial (GIUSTI; WROLSTAD, 2001), utilizando-se dois sistemas: tampão cloreto de potássio (pH 1,0) e tampão acetato de sódio (pH 4,5). Os valores de absorbância foram medidos em espectrofotômetro de absorção UV-Visível no

comprimento de onda de máxima absorção e a 700 nm. A concentração foi expressa em malvidina-3-glicosídeo (massa molecular de 529 e absortividade molar de 28000).

2.5.4 Determinação Cromatográfica

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando cromatógrafo líquido de alta eficiência, Shimadzu (Kyoto, Japan), equipado com desgaseificador (DGU-14A), bomba quaternária (LC-10AT), detector UV-vis (SPD-10AV) e injetor manual de 20 µL, com software CLASS-VP (ver 6.1). A coluna (4,6 mm x 250 mm, 5 µm tamanho de partícula) e pré-coluna (4,6 mm x 12,5 mm) C18 fase reversa (Hichrom, Europe).

Para as análises de polifenóis, resveratrol e antocianinas, as amostras de vinho foram filtradas em filtro de membrana PTFE modificado com poro de 0,45 um e 13 mm de diâmetro (Millipore) e injetadas diretamente no cromatógrafo líquido. Para análise dos ácidos orgânicos as amostras de vinho foram filtradas em membrana 0,45 um PTFE modificada (Millipore) e diluídas em água ultra-pura (Milli-Q) (1:10) e posteriormente injetadas no sistema cromatográfico.

A identificação de cada composto foi realizada pela comparação do tempo de retenção e espectro dos picos UV-vis das amostras de vinho com aqueles obtidos pela injeção dos padrões. Para todas as análises cromatográficas foram determinados os seguintes parâmetros analíticos: coeficiente de determinação (R2), os limites de determinação (LOD) e quantificação (LOQ) e a recuperação (%) (ICH, 1994).

Ácidos orgânicos

Os ácidos orgânicos: tartárico, málico, lático, cítrico e succínico foram diluídos separadamente em água ultra-pura (Milli-Q) (10 g/L) e a solução de trabalho foi obtida com a mistura de todos os padrões (5 g/L). As curvas foram construídas por padronização externa.

A metodologia utilizada foi de acordo com Escobal et al. (1998) com modificações. A separação cromatográfica foi realizada através de eluição isocrática, com detecção em 212 nm. A fase móvel consistiu de água ultra pura (Milli-Q) acidificada com ácido fosfórico (1,2% m/v) com pH de 2,4. O fluxo do eluente foi de 0,7 mL/min, e o tempo da corrida cromatográfica foi de 40 minutos.

Compostos fenólicos

Todas as soluções padrões dos compostos fenólicos foram preparadas individualmente em metanol (1000 mg/L) e armazenadas sob proteção da luz a -18 °C. Foram preparadas soluções estoque com concentração de 150 mg/L em vinho sintético (solução hidroalcóolica: 5 g/Lde ácido tartárico, etanol 12% v/v e pH 3,2). As soluções de trabalho para a construção das curvas de calibração forma prepardas em vinho sintético contendo a mistura dos padrões de polifenóis, com exceção do ácido gálico, preparado individualmente. Solução de morin foi preparada em vinho sintético (16,2 mg/L) e foi utilizada como padrão interno e adicionada na solução de calibração dos compostos fenólicos e na amostra de vinho.

A separação cromatográfica dos compostos fenólicos foi realizada de acordo com método desenvolvido e validado no laboratório de Bioquímica de Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina (Capítulo 1). Foi utilizado como fase móvel água:ácido acético com pH 3,2 como solvente A e 20 % do solvente A com 80 % de acetonitrila como solvente B. Os compostos fenólicos foram eluídos com três estágios de gradiente linear: 0-30 % solvente B por 35 minutos, de 30 a 50 % de B por cinco minutos, 50 a 100 % de B durante 15 minutos, e retornando em 0 % de solvente B durante 15 minutos. O fluxo utilizado foi 1,2 mL/min, e a temperatura da sala foi mantida em 20 °C ± 1.

Os compostos foram quantificados por padronização interna utilizando solução de morin (16,2 mg/L), conforme descrito no Capitulo 1, com exceção do ácido gálico que foi determinado por padronização externa.

Trans-resveratrol

A solução estoque de trans-resveratrol foi preparada em metanol (100 mg/L) e a curva de calibração foi construída por padronização externa. Para análise foi seguida metodologia proposta por Souto et al. (2001), com modificações. O método para eluição utilizado foi isocrático, com fase móvel composta de água ultra pura (Milli-Q) e acetonitrila (75:25). O pH da solução foi ajustado para 3 com a adição de ácido fosfórico. O fluxo da fase móvel foi de 1,2 mL/min, com detecção em 306 nm.

Antocianinas livres

Soluções estoque de malvidina, delfinidina e peonidina-3-glicosídeo foram preparadas individualmente em metanol (150 mg/L) e as curvas de calibração foram construídas por padronização externa.

A análise das antocianinas foi realizada de acordo com método descrito García- Falcón et al. (2007) com modificações. Foi utilizado como fase móvel água ultra-pura (Milli-Q) acidificada com 5 % v/v de ácido fórmico (solvente A) e metanol acidificado com ácido fórmico (solvente B). O gradiente de eluição utilizado foi: 20-40 % de solvente B de 0-40 min, 40-100 % de B durante 10 min, 100 % de B foi mantido por 5 min. A coluna foi preparada para re-equilibrar com o solvente do tempo zero durante 5 min, antes da injeção da próxima amostra. O fluxo da fase móvel foi de 0,8 mL/min, com detecção em 520 nm.

2.5.5 Atividade antioxidante

A Atividade antioxidante dos vinhos foi avaliada através de 3 métodos in vitro: DPPH, ABTS e FRAP, e os resultados foram expressos em atividade antioxidante equivalente a trolox (mM TEAC por Lde vinho).

A atividade do radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) foi medida através da extinção do máximo da absorção em 517 nm (KIM; GUO; PACKER, 2002). O método consiste na incubação da amostra de vinho com solução metanólica do radical DPPH (1 mM) durante 30 minutos.

O método ABTS (ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfônico)) foi realizado conforme descrito por Re et al. (1999). O radical ABTS foi adicionado na amostra de vinho e foi realizada leitura espectrofotométrica em 754 nm no tempo inicial (tempo zero) e após 6 minutos de reação.

O método FRAP foi realizado de acordo com Benzie e Strain (1996) com algumas modificações descritas por Arnous, Makris e Kefalas (2002). Uma alíquota da amostra foi adicionada em solução de cloreto férrico (3 mM) e deixado em banho-maria durante 30 minutos. Posteriormente foi adicionado a solução de TPTZ (2,4,6-tri(2- piridil)-s-triazina) e após 10 minutos foi realizado a leitura da absorbância em 620 nm.