Para determinar o tamanho da amostra foi analisado, previamente, o
número médio de fêmeas primíparas abatidas no frigorífico, durante os meses de
fevereiro e março de 2003. A média entre esses dois meses foi de 1.557 animais
abatidos com prevalência de prenhez estimada em 10%, e consideração do intervalo
de confiança de 95%. Posteriormente, esses números foram processados pelo pacote
estatístico Epi-Info®. O tamanho da amostra representou 33,26% do total de fêmeas
abatidas no período estipulado como referência.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O kit IDEXX para teste sorológico de N. caninum é um dos mais
utilizados para levantamento epidemiológico. A grande maioria dos trabalhos
consultados utilizaram esse procedimento como referência (PARÉ et al., 1998;
PITUCO et al., 1998; SANDERSON et al., 2000; MORALES et al., 2001; SARTOR et
al., 2003).
Das 518 novilhas testadas, 103 (19,88%) continham anticorpos anti-N.
caninum. Esse índice assemelha-se aos encontrados pela maioria das pesquisas
nacionais que utilizaram a mesma técnica de detecção e condições semelhantes de
amostragem. Isto é, em rebanhos onde não havia histórico de abortamento e as
amostras não eram provenientes de animais suspeitos de infecção, como relatado nos
trabalhos de Gondim & Sartor (1997) e de Pituco et al. (1998). Quando esse índice foi
comparado com achados de autores que trabalharam com o método de RIFI houve
semelhança (Tabela 1). Deve-se ressaltar, porém, que a RIFI, detecta menor
percentagem de animais infectados do que o método de ELISA aqui utilizado
(SARTOR et al., 2003).
Comparando-se com a literatura estrangeira, o índice da região é
ligeiramente superior aos encontrados no Canadá, Inglaterra e Dinamarca, cujas
ocorrências foram de 16,6%, 17,1% e 16,0%, respectivamente (PARÉ et al., 1998;
DAVISON et al., 1999a; JENSEN et al., 1999), e inferior aos verificados nos Estados
de 24%, 39,4% e 56%, respectivamente (SANDERSON et al., 2000; DIJKSTRA et al.,
2001b; MORALES et al., 2001).
O título de 10, utilizado para os fetos, foi escolhido visando maior
concentração de anticorpos no soro, pois esperava-se que o feto ainda não possuísse
seu sistema imunológico completamente desenvolvido, tendendo a apresentar menor
quantidade de anticorpos. Sugestão de diluição menor que a recomendada pelo
fabricante, em fetos, também foi citada por Osawa et al. (1998), embora os autores
não propusessem qual seria a ideal.
Com esse procedimento, da amostra total constatou-se que 38 fetos
apresentaram anticorpos anti-N. caninum e que todos eram procedentes de mães
infectadas pelo protozoário (Tabela 2).
Tabela 2 – Estado sorológico em 518 mães e fetos testados pela técnica de ELISA anti-Neospora caninum. ELISA Mãe Feto Diluição Número de mães e fetos (%) 1:100 1:10 415 80,11 NR NR 65 12,55 R NR 38 7,34 R R Total 518 100,00 NR: Não reagente R: Reagente
Observa-se na tabela 2 e 3 predomínio da situação mãe com seu
respectivo feto não reagente (NR). A maior porcentagem de fetos não reagentes,
ficando descartada a possibilidade da infecção transplacentária vir a ocorrer ao longo
da gestação em sua plenitude, fato que poderia levar os resultados a outro rumo.
Ao analisar a tabela 3, verifica-se que a taxa de infecção intra-uterina foi
ao redor de 37%, ficando também evidente que a infecção fetal pode ocorrer logo aos
quatro meses de gestação. A partir desse período é impossível saber em que período
da gestação ocorreu a infecção.
Tabela 3 - Fetos em diversas idades de gestação oriundos de 103 novilhas infectadas pelo Neospora caninum. ELISA diluição do soro 1:100 nas novilhas e 1:10 nos fetos.
Nº Fetos positivos (%) Nº Fetos positivos (%) Idade de gestação (meses) Nº total (%) 7 6,8 3 4 3,9 23 22,33 4 6 5,8 14 13,60 5 9 8,74 13 12,62 6 9 8,74 03 2,91 7 9 8,74 02 1,94 8 1 0,97 03 2,91 9 Total 38 36,89 65 63,11 --- 103 100
O índice de fetos infectados constatado na tabela 3 pode ser baseado em
constatações de Wouda et al. (1997), onde a titulação de anticorpos anti-N. caninum
em uma concentração de 1:25 é considerada específica para o diagnóstico de
neosporose, diluição esta, muito superior à testada neste experimento.
A distribuição sexual das progênies, em relação a fetos reagentes e não
reagentes foi semelhante, com predomínio, em ambas situações do sexo feminino.
provenientes de mães reagentes, foram encontrados 24 e 34 fetos do sexo feminino
em cada grupo, respectivamente; porém, não houve diferença significativa entre o
predomínio sexual.
Características semelhantes foram encontradas por Paré et al. (1996),
que analisaram dois rebanhos de bovinos leiteiros na Califórnia em relação à infecção
congênita para N. caninum. Em ambos os rebanhos o sexo feminino predominou em
relação ao sexo masculino, porém não houve diferença significativa.
A reação da polimerase em cadeia disponibiliza os resultados mais
rápido que o isolamento. A técnica alia sensibilidade e especificidade, podendo ser
feita em tecido parcialmente destruído, autolisado ou contaminado, superando o
problema de uma degradação antigênica e reatividade cruzada presente em
sorodiagnósticos.
A técnica da PCR utilizada neste estudo é a mesma de Pitel et al. (2001),
quando constataram em 104 vacas que abortaram 22 fetos com anticorpos anti-N.
caninum, é o DNA era o mesmo em 21 dos cérebros. Do material colhido dos fetos,
103 amostras de cérebro passaram pelo processo de maceração e foram submetidas
à reação da polimerase em cadeia. Em nenhuma amostra analisada, houve
amplificação do DNA de N. caninum. O resultado obtido contraria Pitel et al. (2001).
Deve-se salientar, porém, que esses pesquisadores trabalharam com fetos
provenientes de abortamento natural. Nessa condição, supõe-se que a infecção seja
mais proeminente e, com isso, haja maior número de parasitas, tornando mais fácil
sua detecção. Esses achados sustentam as afirmações de Ellis (1998), nas quais a
sensível para o diagnóstico de animais infectados, corroborando Dubey et al. (1988a)
e Thilstead et al. (1989), que citam que a sensibilidade do PCR para N. caninum, pode
ser comprometida em função da pequena presença numérica do protozoário, no tecido
animal.
Provavelmente, a baixa sensibilidade da PCR nesse trabalho, seja em
virtude da não realização de uma segunda amplificação, pois, segundo De Paula
(2003), o limiar de detecção da técnica convencional é de 100 taquizoítos/mL em
suspensão de cérebro bovino congelado, enquanto que a PCR, após uma segunda
amplificação, detecta 1 taquizoíto/mL. Ho et al. (1997) observaram a incapacidade de
detecção do N. caninum em todos os cortes teciduais e De Marez et al. (1999)
verificaram que nem sempre o DNA de N. caninum era detectado em todas as
repetições da mesma amostra.
Talvez o método citado por Ellis et al. (1998) e Holmdahl et al. (1996),
que verificaram alta especificidade e sensibilidade do “nested” PCR para diagnóstico
do N. caninum fosse correto, para a utilização neste ensaio. Segundo os autores, a
transcrição do espaço interno da fita de DNA ribossômico é o ideal para o
desenvolvimento da técnica, porque ela apresenta uma alta cópia numérica e
conserva a seqüência de bases da espécie, muito bem caracterizada para N. caninum.
A realização de duas amplificações sucessivas, utilizando pares de “primers”
5 CONCLUSÕES
- Anticorpos anti-N. caninum estão presentes em novilhas prenhes e respectivos
fetos, da região de Presidente Prudente, São Paulo.
- A transmissão vertical foi detectada a partir do quarto mês de gestação.
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