Análise Estatística da Experimentação Animal

A área da lesão pode ser otimizada estatisticamente, se o tempo de aplicação de oxigênioterapia e os dias de tratamento forem conhecidos como uma função dos valores experimentais, gerando um modelo matemático. Um gráfico dessa função produz a superfície de resposta para a área da lesão.

A superfície de resposta pode ser representada pelo modelo matemático como segue:

Na equação descrita, a resposta (Z) ou variável dependente foi a área da lesão em mm², obtida para cada tempo de aplicação de oxigênioterapia e dias de avaliação. Os valores b são as estimativas dos coeficientes do polinômio, os valores X e Y representam os valores codificados tempo de aplicação de oxigênioterapia (0, 30, 60 minutos) e, dias de avaliação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18) respectivamente. Os termos lineares, b1X e b3Y, são responsáveis pelos efeitos principais, os termos quadráticos b2Y² e b4Y², são responsável pelo efeito da curvatura e pelo produto bifatorial do termo.

A análise de superfície de resposta apresenta n modelos, no entanto para a determinação deste em estudo, foram testados os valores e observados, permitindo analisar aquele que se aproximou da área da lesão real, prevendo assim, a equação com maior acurácia e precisão, descrito a cima. O coeficiente de determinação também influencia na escolha do modelo, pois quanto maior for o coeficiente, maior a acurácia do modelo. Na tabela 4.2, encontram-se os n modelos gerados com respectivo coeficiente de determinação, indicando o modelo abaixo como sendo o mais preciso para representação da área da lesão:

Tabela 4.2: Resumo da análise de superfície de resposta. UNIJUÍ, 2015.

Área da lesão (mm²) Modelo R² (%) Z = 45,18285 + 0,21X 1.5 Z = 108,32713 - 6.31604Y 82,9 Z = 102,02713 + 0,21X - 6,31604Y 84,5 Z = 103,01571 + 0,01228X + 0,00329X² - 6,31604Y 84,6

Z = 109,12396 + 0,21X - 9,15477Y + 0,1577Y² 85,9 Z = 110,11253 + 0,01228X + 0,00329X² - 9,15477Y + 0,1577Y² 86,0 Z = 98,53428 + 0,32642X - 5,92794Y - 0,01294XY 84,7 Z = 99,52285 + 0,12871X + 0,00329X² - 5,92794Y - 0,01294XY 84,8 X mínimo = 0 X máximo = 60 Y mínimo = 0 Y máximo = 18 Z mínimo = 3 Z máximo = 137

Z = área da lesão (mm²); X = dias de avaliação(0, 3, 6, 9, 12, 15, 18); Y = tempo de oxigênioterapia (0, 30, 60 minutos); R² = coeficiente de determinação.

Para verificar o desempenho nas condições definidas pelas análises por superfície de resposta, estas foram aplicadas em tempo de exposição ao tratamento e dias de avaliação, para prever a área da lesão. Por exemplo, no tempo de tratamento de 30 minutos e dia 3 o valor da área simulado pelo modelo é de 87.4, enquanto que o valor real observado na experimentação animal é de 89.8. Na Figura 4.7 está apresentado o gráfico da equação.

Figura 4.7: Gráfico da dinâmica de variação de área da lesão em mm2, da equação de análise da superfície de resposta, mostrando a área da lesão em função do tratamento de oxigênioterapia variando de 0 a 60 minutos, e dos dias de avaliação da lesão.

Na Tabela 4.3, o resumo da análise de variância evidencia-se diferenças estatísticas entre tempo de avaliação e tempo de exposição à oxigênioterapia sobre a variável resposta, área da lesão. De acordo com Flegg et al., 2010, existem vários protocolos que podem estimular a cicatrização de feridas, variando a pressão de 1 a 3 atm e tempos de exposição variando entre 0 a 180 minutos.

Tabela 4.3: Resultados da análise de variância para área da lesão, em seis diferentes dias de avaliação (0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 dias pós-operatórios) UNIJUÍ, 2015.

Fonte de Variação GL Quadrado Médio

Lesão (mm²)

Bloco 4 863.6

Tempo de Avaliação (TA) 6 25827.63*

Oxigênioterapia (O) 2 1491.76* TO x DT 12 211.96ns Erro 80 221.79 Total 104 Média Geral 51.4 CV (%) 28.9

* = Significativo pelo teste de F em nível de 5% de probabilidade de erro; ns = Não significativo pelo teste de F em nível de 5% de probabilidade de erro;. CV = Coeficiente de variação. GL = Grau de liberdade.

Na tabela 4.4, encontram-se os valores médios das áreas de feridas cirúrgicas em camundongos, ao longo de dezoito dias de avaliação cicatricial, mostrando as comparações entre os grupos e dentro de cada grupo, a fim de compará-los entre eles.

Tabela 4.4: Valores médios das áreas de feridas cirúrgicas em camundongos, ao longo de dezoito dias de avaliação da cicatrização. UNIJUÍ, 2015

Dias de Avaliação Área da lesão (mm²)

Tempo 0 Tempo 30 minutos Tempo 60 minutos

0 A 116,75 a A 115,92 a A 125,46 a 3 B 67,97 a B 89,79 b A 101,15 b 6 B 58,06 a C 71,47 a B 82,27 a 9 C 41,03 a D 41,80 a B 67,25 a 14 D 21,6 b E 13,55 a C 30,72 b 15 D 13,06 b E 7,26 a C 18,70 b 18 D 2,00 b E 0,94 a C 2,56 b

Letras minúsculas comparam valores dentro das linhas e as letras maiúsculas comparam valores na coluna, considerando a probabilidade de 5% de erro pelo teste de Scott Knott.

Baseado nos três tratamentos propostos de feridas abertas limpas, avaliou-se a evolução da cicatrização durante 21 dias. Percebe-se que na primeira avaliação, três dias após

a lesão, os animais tratados apenas com solução fisiológica, apresentaram redução da ferida estatisticamente superior aqueles submetidos à oxigenioterapia hiperbárica. Credita-se essa resposta, ao fato dos primeiros três dias após a lesão, ocorrer a fase denominada de fase inflamatória da cicatrização. Essa fase, inicia no primeiro dia e estende-se até o terceiro após a injúria, havendo grande migração de células de defesa para a lesão, com intuito de fagocitar as bactérias, desbridar corpos estranhos e direcionar o desenvolvimento do tecido de granulação (MANDELBAUM et al. 2003). Fazem parte dessa linha de defesa os macrófagos, os mediadores químicos, os fibroblastos, os queratinócitos e as células endoteliais, que chegam na região por quimiotaxia. Ocorre que, as células são atraídas pela umidade, fato que facilita a diapedese até a lesão (FAZIO et al, 2000). Considerando que, secções de oxigênioterapia hiperbárica ressecam a superfície exposta, acredita-se que esse ressecamento foi o responsável pela redução da atração celular.

A segunda fase da cicatrização é o desbridamento, a qual se estende até o sexto dia após a lesão. Tem a função de limpar a região, tornando feridas contaminadas, em feridas limpas (TOWNSEND et al. 2014). Tratando-se desse trabalho, o qual utilizou-se de feridas cirúrgicas, ou seja, feridas limpas e sem qualquer grau de contaminação, a fase de desbridamento, praticamente não ocorreu, transpassando rapidamente da fase do desbridamento para a fase de proliferação. Visualizando a tabela 4.4, referente à evolução da cicatrização, nota-se a igualdade entre os três grupos nas avaliações de seis e nove dias, justamente por tratar-se de uma condição igual entre os animais, sendo todos portadores de feridas limpas.

A fase de proliferação inicia após a limpeza da ferida e estende-se até o 14ºdia após a lesão. É quando o ferimento inicia o seu fechamento (TOWNSEND et al. 2014). Os queratinócitos movimentam-se atraídos pela umidade do leito da ferida, como mencionado anteriormente. Logo após, inicia a fibroplasia e a formação da matriz para que resulte em tecido de granulação. A formação desse tecido depende do fibroblasto, que longe de ser apenas produtor de colágeno, produz também elastina, fibronectina, glicosaminoglicanase e proteases, responsáveis pelo remodelamento fisiológico (MANDELBAUM et al. 2003). Ainda nessa fase, ocorre a angiogênese, definida como a formação de novos vasos para aumentar o suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização (FAZIO et al, 2000). Conforme observado na tabela 4.4, justamente na avaliação de 12 dias, ocorre uma alteração estatística entre o grupo que recebeu oxigênioterapia hiperbárica por 30 minutos e os demais grupos. O aporte de oxigênio extra, em pressão elevada e por tempo restrito (30 minutos), resultou em aceleramento da fase de proliferação. Após essa avaliação, a distância entre esse

grupo e os outros dois, somente aumentou, demonstrando a diferenciação da utilização da oxigênioterapia hiperbárica por 30 minutos.

A última fase da cicatrização é reconhecida como remodelamento ou maturação, e ocorre no colágeno e na matriz, com duração de 14 dias até um ano. Apresenta ação sobre a força de tensão da pele e na diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. A neovasculatura diminui, e com o decorrer do tempo a cicatriz é considerada avascular (FAZIO et al, 2000). Nesse trabalho, ainda que se tenha avaliado os animais até os 21 dias após os procedimentos, ao 18º dia, as lesões encontravam-se cicatrizadas, com pequenas porções de tecido róseo. Aos 21 dias, todos os ferimentos foram considerados cicatrizados.

Quando analisada a cicatrização individualmente em cada grupo de tratamento, nota-se que cada um apresentou comportamento individual até o nono dia de avaliação. Nesse período, somente os animais tratados com oxigenioterapia durante 30 minutos, apresentaram redução significativa da ferida a cada aferição de áreas. A partir do 12º dia de avaliação, não ocorreu alteração estatística dentro dos grupos, contudo, os animais que permaneceram por 30 minutos na câmara, apresentaram cicatrização estatisticamente melhor até o final. Curiosamente, esse resultado foi oposto aos animais que permaneceram por 60 minutos em tratamento, os quais resultaram em maiores áreas de feridas. Não foi possível inferir justificativa para esse resultado negativo, mas pode-se concluir que o tempo de exposição no interior câmara hiperbárica, interfere na velocidade de cicatrização, havendo um período ideal a ser definido.

5 CONCLUSÕES

Esta dissertação analisou matematicamente como oxigênio difunde-se para o espaço da ferida a partir do tecido saudável circundante, que estabelece um gradiente local de oxigênio promovendo a migração de capilares para o interior da lesão. Com a solução criada foi possível mostrar a mudança da concentração de oxigênio como uma função de ambos, tempo e espaço, verificando uma maior concentração de oxigênio na borda da ferida durante o tratamento, baixando os níveis da concentração após o término de cada sessão. Verificou-se que o modelo de difusão de oxigênio é capaz de avaliar o efeito de tratamento de feridas com oxigênioterapia, quantificando a concentração do gás no leito da lesão.

A câmara proposta nesse trabalho possui capacidade de avaliação instantânea dos animais durante o tratamento, e não compromete a sua condição fisiológica sob 2,4 bars de pressão por até 60 minutos.

O tempo de exposição no interior câmara hiperbárica, interfere na velocidade de cicatrização, considerando que, animais submetidos à 30 minutos diários de tratamento, apresentam obliteração de feridas limpas precocemente aqueles animais submetidos ao dobro desse período.

O modelo matemático obtido, baseado em dados experimentais, coletados no hospital veterinário da UNIJUÍ, aplicadas em tempo de exposição ao tratamento e dias de avaliação, prevê a área da lesão de forma satisfatória.

A construção de um programa de análise computacional de imagens digitalizadas, permite analisar de forma precisa a área de feridas cutâneas. É possível afirmar que o processamento de imagem digital aliado a análises estatísticas são ferramentas que se adaptam adequadamente a projetos ligados a cicatrização de lesões cutâneas.

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