A análise estatística foi feita utilizando-se o teste t de Student para comparação entre dois grupos. Para amostras não homogêneas foi utilizado o teste de Mann & Whitney. Para ambos os testes foi adotado o nível de significância p<0,05 (Sampaio, 1998).
A avaliação de trabalhos descritos na literatura nos mostra que a IL-10 tem importante papel na suscetibilidade do BALB/c à L.(L.) major, já que animais deficientes nesta citocina desenvolvem lesão menor e apresentam menor parasitismo que os animais controles (Kane & Mosser, 2001). Outros autores, estudando um modelo de resistência à L.(L.) major, mostram que o tratamento de camundongos C57BL/6 com α IL-10R infectados com L.(L.) major após 24 semanas de infecção induziu cura parasitológica da lesão (Belkaid e cols. 2001).
Tendo em vista estes dados, decidimos avaliar o papel da IL-10 em um modelo murino onde o animal é resistente à L.(L.) major, mas susceptível à L.(L.) amazonensis. Para isto inoculamos animais C57BL/6 com 1x105 formas promastigotas metacíclicas de L.(L.) amazonensis cepa PH8 e tratamos estes animais com anticorpo α−IL-10R utilizando o protocolo B de tratamento. O curso da infecção destes animais foi avaliado semanalmente pela medida da lesão da pata.
A figura 1 mostra o desenvolvimento da lesão nos animais tratados comα-IL- 10R, IgG total de rato ou não tratados. Observamos que não há diferença entre os grupos quanto ao início do desenvolvimento da lesão, que ocorre por volta da 5asemana de infecção. Também não observamos diferença significativa entre o tamanho da lesão entre o grupo experimental e os controles durante as dez semanas de acompanhamento.
Embora o tamanho da lesão seja estatisticamente igual para todos os grupos, dados obtidos por Solbach & Laskay (1996) apontam para o fato de que a lesão reflete não somente o parasitismo, mas também o infiltrado inflamatório presente. Assim, a avaliação da quantificação de parasitas na lesão torna-se importante para a melhor compreensão do processo de infecção.
Figura 1 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o curso da infecção de animais C57BL/6 inoculados com L.(L.) amazonensis
Os animais foram inoculados com 1x105formas metacíclicas de L.(L.) amazonensis e o tratamento feito
utilizando o protocolo B, com inoculação de 6 doses de 0,5 mg deα−IL-10R durante as três primeiras semanas de infecção. A IgG total de rato foi inoculada seguindo o mesmo protocolo. Cada ponto representa a média do tamanho da lesão + desvio padrão. n= 3 animais por grupo. Representativo de dois experimentos. Não houve diferença significativa entre os grupos (p≥0,05).
A figura 2 mostra que a quantidade de parasitas recuperada na lesão da pata, após três semanas de infecção, foi semelhante para animais tratados comα-IL-10R (3,9) em comparação àqueles tratados com IgG total de rato (3,0). Estes animais foram submetidos ao protocolo A de tratamento, ou seja, quatro doses de α-IL-10R ou IgG total de rato durante as duas primeiras semanas de infecção e sacrificados após três semanas decorridas da data da inoculação.
T am an ho da le sã o (m m ) Semanas de Infecção 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sem tratamento IgG de rato Anti IL-10R
Figura 2 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais C57BL/6 inoculados com L.(L.) amazonensis após 3 semanas de infecção
Os animais foram inoculados com 1x105formas metacíclicas de L.(L.) amazonensis e o tratamento feito
de acordo com o protocolo A (4 doses de 0,5mg deα−IL-10R ou IgG total de rato/dose). O sacrifício foi feito após 3 semanas de infecção sendo a lesão da pata coletada, processada em macerador de vidro e plaqueada em 12 diluições (1:10) seriadas. A leitura de todos os poços foi feita após sete dias de incubação do material a 260C. Cada barra representa a média do log do título de parasitas + desvio
padrão. n=3 animais por grupo. Representativo de dois experimentos. Não houve diferença significativa entre os grupos (p≥0,05).
O perfil de citocinas produzido durante a infecção por Leishmania é determinante para a suscetibilidade ou resistência do animal. Afonso & Scott (1993) mostraram que a suscetibilidade de animais C57BL/10 está relacionada com a presença de citocinas tipo Th1, e não com a ausência de citocinas tipo Th2. No entanto, as citocinas Th2, principalmente IL-4 (Chatelain e cols., 1992) e IL-10 (Kane & Mosser, 2001), são importantes para a suscetibilidade da linhagem BALB/c à L.(L.) major.
Com o objetivo de avaliar a influência do bloqueio do receptor de IL-10 sobre a produção de citocinas no início da infecção, foram avaliados os perfis de IFN-γ, IL-4 e TNF no sobrenadante de cultura de células mononucleares de baço e linfonodo de animais C57BL/6 infectados com L.(L.) amazonensis nos quais ação da IL-10 foi impedida pelo bloqueio do seu receptor. O tratamento foi feito com quatro doses de 0,5 mg/doseα-IL-10R ou IgG total de rato, seguindo o protocolo A.
P ar as it as na le sã o (l og ) 0 1 2 3 4 5 6
A figura 3 mostra a dosagem de IFN-γ e TNF de esplenócitos e células mononucleares de linfonodo de animais infectados com quatro doses de α-IL-10R ou IgG total de rato estimuladas com antígeno em dois experimentos independentes.
Nas figuras 3A e 3B, observamos que a produção estimulada de IFN-γ por esplenócitos de animais tratados com α-IL-10R foi semelhante à produção dessa citocina por células dos animais controles, em ambos os experimentos (p>0,05).
Nestes experimentos, foi feito um pool de linfonodos dos animais submetidos ao mesmo tratamento. Observamos um aumento na produção de IFN-γ por células de pool de linfonodo estimuladas com antígeno de PH8, de animais C57BL/6 infectados com L.(L.) amazonensis por três semanas e tratados com quatro doses de α-IL-10R quando comparados aos grupos tratado com IgG total de rato (figuras 3A e 3B). Este aumento foi de 83% e 74% no primeiro e segundo experimentos, respectivamente.
Nas figuras 3C e 3D, observamos que a produção de TNF por esplenócitos de animais tratados com quatro doses de α-IL-10R e infectados com L.(L.) amazonensis por três semanas não foi diferente da produção desta citocina por células de animais tratados com IgG total de rato, quando estimuladas com antígeno de PH8 (p>0,05).
Embora a produção de TNF observada tenha sido baixa, já que esta citocina foi dosada em sobrenadantes de cultura de 72 horas, observamos um aumento significativo (170% e 81%, primeiro e segundo experimentos, respectivamente) na produção de TNF por células de pool de linfonodos estimuladas com antígeno de PH8, de submetidos ao protocolo A quando comparados aos grupos tratados com IgG total de rato (figuras 3C e 3D).
Dando seguimento à avaliação do perfil de citocinas de animais inoculados com α-IL-10R, verificamos a produção de IL-4 em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de baço e linfonodo estimuladas com antígeno PH8. Sendo a IL-4 uma citocina característica da linhagem de linfócitos do tipo Th2, sua presença pode relacionar-se a um perfil de suscetibilidade à Leishmania. No entanto, não encontramos presença de IL- 4, em níveis detectáveis pela ELISA, em sobrenadantes de células de animais tratados ou não comα-IL-10R.
Figura 3 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 inoculados com L.(L.)
amazonensisapós 3 semanas de infecção
Após 3 semanas de infecção e tratamento comα−IL-10R ou IgG total de rato (Protocolo A), os animais foram sacrificados e as células mononucleares de baço e linfonodo foram isoladas e cultivadas por 72h em presença de 50µg/mL de antígeno de PH8 . As dosagens de IFN–γ foram feitas por ELISA e as de TNF por bioensaio utilizando a linhagem de células WEHI. A e B: dosagem de IFN-γ de dois experimentos semelhantes e independentes; C e D: dosagem de TNF de dois experimentos semelhantes e independentes. n=3 animais por grupo.
A análise histológica dos animais tratados com 4 doses do anticorpoα−IL-10R e avaliados após três semanas de infecção não apontou diferenças siginificativas no perfil do infiltrado inflamatório, que apresentou-se discreto em todos os animais avaliados. Também não observamos diferença no parasitismo tecidual desses animais, sendo este perfil discreto para ambos os grupos (figura 4).
A D C B IF N - γ (n g/ m L ) T N F (p g/ m L ) Baço Linfonodo
IgG de rato Anti IL-10R IgG de rato Anti IL-10R 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 0 5 10 15 20 0 5 10 15
Figura 4 - Análise histológica do processo inflamatório em camundongos C57BL/6 tratados com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados com Leishmania amazonensis e sacrificados após três semanas de infecção.
Para a análise histológica foi coletada uma porção do coxim plantar dos animais. Observa-se processo inflamatório focal, discreto, constituído por células mononucleadas. Na figura B são observados alguns macrófagos parasitados (setas). Hematoxilina-eosina. Ampliação original: 400X.
B
A
Uma vez que não foram observados efeitos na quantificação de parasitas e no perfil de citocinas entre animais tratados com α-IL-10R em comparação aos animais tratados com IgG total de rato após três semanas de infecção, decidimos então avaliar estes mesmos parâmetros no final da infecção.
A avaliação da quantidade de parasitas presente na lesão da pata de camundongos C57BL/6, tratados com os protocolos A ou B ao final de 12 semanas de infecção mostrou que o bloqueio do receptor de IL-10 não alterou o número de parasitas recuperados da lesão. A figura 5A mostra a recuperação de parasitas na lesão de camundongos C57BL/6 após 12 semanas de infecção tratados com o protocolo A e a figura 5B mostra a quantificação de parasitas na lesão da pata dos animais tratados com o protocolo B.
Figura 5- Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais C57BL/6 inoculados com L.(L.) amazonensis após 12 semanas de infecção
Os animais foram inoculados com 1x105formas metacíclicas de L.(L.) amazonensis e o tratamento feito
de acordo com os protocolos A (fig. 5A) ou B (fig. 5B). O sacrifício foi feito após 12 semanas de infecção sendo a lesão da pata coletada, processada em macerador de vidro e plaqueada em 12 diluições (1:10) seriadas. A leitura de todos os poços foi feita após sete dias de incubação do material a 260C. Cada barra representa a média do logarítmo do título de parasitas + desvio padrão. n=três animais por grupo. ST = Sem tratamento. Representativo de dois experimentos. Não houve diferença significativa entre os grupos (p≥0,05).
A produção de citocinas por células de baço e linfonodo de animais C57BL/6 tratados com o protocolo A e avaliados após 12 semanas de infecção é mostrada na figura 6. Foram avaliadas a produção de IFN-γ, IL-4 e TNF no sobrenadante de cultura de células mononucleares de baço e linfonodo de animais C57BL/6 infectados com 1x105 promastigotas metacíclicas de L.(L.) amazonensis, em dois experimentos independentes. P ar as it as na le sã o (l og )
IgG de rato Anti IL-10R IgG de
rato IL-10RAnti Sem tratamento 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Nas figuras 6A e 6B, observamos que a produção de IFN-γ por esplenócitos de animais tratados com quatro doses de α-IL-10R foi semelhante à produção desta citocina por células de animais tratados com IgG total de rato, quando estimuladas com antígeno de PH8 (p>0,05).
No entanto, observamos comportamento diferente na produção de IFN-γ por células de pool de linfonodos estimuladas com antígeno de PH8, de animais tratados com quatro doses deα-IL-10R quando comparados ao grupo tratado com IgG total de rato após 12 semanas de infecção (figuras 6A e 6B). Em dois experimentos independentes, observamos perfis de resposta também diferentes.
Nas figuras 6C e 6D, observamos que a produção de TNF por esplenócitos de animais tratados com seis doses de α-IL-10R não foi diferente da produção desta citocina por células de animais tratados com IgG total de rato, quando estimuladas com antígeno de PH8, em ambos os experimentos (p>0,05).
Já células de pool de linfonodos estimuladas com antígeno de PH8 provenientes de animais tratados comα-IL-10R apresentam produção de TNF também variando entre os dois experimentos (figuras 6C e 6D).
Os perfis de produção de IFN-γ, IL-4 e TNF no sobrenadante de cultura de células mononucleares de baço e linfonodo de animais C57BL/6 infectados com L.(L.) amazonensis foram também avaliados nos animais submetidos ao tratamento com o protocolo B. Nas figuras 7A e 7B, observamos que a produção de IFN-γ por esplenócitos estimulados de animais tratados com seis doses de α-IL-10R foi semelhante à produção desta citocina por células de animais tratados com IgG total de rato ou não tratados, quando estimuladas com antígeno de PH8.
Para a dosagem de citocinas produzidas pelos linfonodos, também fizemos um pool destes órgãos dos animais submetidos ao mesmo tratamento. As células mononucleares, estimuladas com antígeno, dos animais tratados com α-IL-10R mostraram um perfil diferente em cada experimento realizado, como podemos observar nas figuras 7A e 7B.
Figura 6 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 inoculaods com L.(L.)
amazonensis após 12 semanas de infecção e tratados com o protocolo A
Após 12 semanas de infecção e tratamento comα−IL-10R ou IgG total de rato (4 doses, 0,5mg/dose – protocolo A), os animais foram sacrificados e as células mononucleares de baço e linfonodo foram isoladas e cultivadas por 72h em presença de 50µg/mL de antígeno de PH8 . As dosagens de IFN–γforam feitas por ELISA e as de TNF por bioensaio utilizando a linhagem de células WEHI. A e B: dosagem de IFN-γde dois experimentos independentes; C e D: dosagem de TNF de dois experimentos independentes. n=três animais por grupo.
Nas figuras 7C e 7D, observamos que a produção de TNF por esplenócitos de animais tratados com 6 doses deα-IL-10R não foi diferente da produção desta citocina por células de animais tratados com IgG total de rato ou não tratados, quando estimuladas com antígeno de PH8.
Também não observamos diferenças na produção de TNF por células de pool de linfonodos estimuladas com antígeno de PH8, de animais tratados com seis doses deα- IL-10R quando comparados aos grupos tratado com IgG total de rato ou não tratado (figuras 7C e 7D). 0 50 100 150 200 250 0 30 60 90 120 Anti IL-10R 0 10 20 30 40 0 30 60 90 120 150 180 A D C B IF N - γ (n g/ m L ) T N F (p g/ m L ) Baço Linfonodo
As dosagens de IFN-γe TNF dos sobrenadantes de cultura do pool de linfonodos do grupo tratado com IgG total de rato do primeiro experimento não foram feitas porque a cultura de células contaminou.
Figura 7 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 inoculados com L.(L.)
amazonensisapós 12 semanas e tratados comο protocolo B
Após 12 semanas de infecção e tratamento com αIL-10R ou IgG total de rato (6 doses, 0,5mg/dose – protocolo B), ou não tratados os animais foram sacrificados e as células mononucleares de baço e linfonodo foram isoladas e cultivadas por 72h em presença de 50µg/mL de antígeno de PH8 . As dosagens de IFN–γ foram feitas por ELISA e as de TNF por bioensaio utilizando a linhagem de células WEHI. A e B: dosagem de IFN-γde dois experimentos independentes; C e D: dosagem de TNF de dois experimentos independentes. n=três animais por grupo.
A análise histopatológica da lesão dos camundongos tratados com o protocolo B (6 doses de α−IL-10R/IgG de rato ou não tratados) após 12 semanas de infecção, mostrou que animais dos grupos controle e tratados com IgG total de rato apresentaram infiltrado inflamatório discreto, enquanto que animais tratados com α IL-10R apresentaram um infiltrado que variou de moderado a intenso (figura 8). O tratamento comαIL-10R aumentou ligeiramente o parasitismo tecidual desses animais (figura 9).
0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 A D C B IF N - γ (n g/ m L ) T N F (p g/ m L ) Baço Linfonodo IgG de
rato IL-10RAnti Sem
tratamento IgG de
rato IL-10RAnti Sem
Figura 8 - Análise histológica do processo inflamatório em camundongos C57BL/6 tratados com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados com Leishmania amazonensis e sacrificados após 12 semanas de infecção.
Para a análise histológica foi coletada uma porção do coxim plantar dos animais. Observa-se processo inflamatório discreto (A) e intenso (B), constituído por células mononucleadas. Hematoxilina-eosina. Ampliação original: 400X.
B
A
Figura 9 - Análise histológica do parasitismo em camundongos C57BL/6 tratados com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados com Leishmania amazonensis e sacrificados após 12 semanas de infecção.
Para a análise histológica foi coletada uma porção do coxim plantar dos animais. Observam-se macrófagos vacuolizados, intensamente parasitados. Hematoxilina-eosina. Ampliação original: 400X.
B
A
A avaliação do papel da IL-10 na leishmaniose é de extrema importância, pois sendo uma citocina anti-inflamatória, inibe a ação de IFN-γe NO, que, por sua vez, têm papel importante na eliminação do parasita e no controle da lesão. O papel dessa citocina na infecção por L.(L.) amazonensis in vivo foi avaliado, neste trabalho, tratando-se camundongos C57BL/6, suscetíveis à essa espécie de Leishmania, com anticorpos monoclonais anti-receptor de IL-10 (αIL-10R) na fase inicial da infecção. A importância de se verificar o papel dessa citocina nesta fase da infecção é sugerida por Vieth e cols. (1994). Esses autores mostraram que a ação da IL-10 sobre macrófagos se dá no início da infecção, provavelmente bloqueando a ação do TNF-α.
Buscando esclarecer o papel das diferentes citocinas na resposta à Leishmania, trabalhos iniciais mostraram que camundongos BALB/c infectados com L.(L.) major e tratados com anticorpos anti IL-4 têm sua lesão bastante diminuída, diferentemente de seus controles não tratados. Esses autores observaram também que o bloqueio da IL-4 juntamente com o de IFN-γ, faz com que estes animais desenvolvam lesões semelhantes aos controles (Chatelain e cols., 1992). A IL-4 produzida por esses animais é capaz de inibir a expressão de receptor de IL-12 (IL-12R) (Himmelrich e cols., 1998) devido à sua rápida produção por células Th2 de memória já diferenciadas e estimuladas pelo antígeno LACK de L.(L.) major. Essas células responderiam normalmente a algum componente da flora intestinal dos camundongos BALB/c (Launois e cols., 1997). Entretanto, a participação exclusiva de uma resposta Th2 na suscetibilidade é questionada, pois animais deficientes em IL-4 e infectados com L.(L.) major não foram capazes de controlar a lesão, não apresentando o desenvolvimento de uma resposta Th1 (Noben-Trauth e cols., 1996). Além de aparentemente não ser a única responsável pela suscetibilidade à Leishmania, a IL-4 parece ter um papel importante no desenvolvimento de uma resposta protetora contra o parasita, em pequenas quantidades e nas fases iniciais da infecção por L.(L.) major (Biedermann e cols., 2001).
Em relação à suscetibilidade de camundongos da linhagem C57BL/10 à L.(L.) amazonensis, trabalhos anteriores mostraram que células de linfonodo de C57BL/10 infectados com L.(L.) amazonensis produzem baixos níveis de IL-4. Além disso, o tratamento desses animais com anticorpos monoclonais anti IL-4 (11B11) apenas diminui o tamanho da lesão em relação ao grupo de animais não tratados, não
promovendo total regressão da mesma. Esses resultados indicam que a indução de uma resposta Th2 não está necessariamente relacionada à suscetibilidade à leishmaniose neste modelo (Afonso & Scott, 1993). No entanto, outros autores mostraram que camundongos da linhagem CBA infectados com L.(L.) amazonensis desenvolvem um aumento na produção de IL-4 e IL-10 (De Souza e cols., 2000). Assim, cabe investigar mais detalhadamente que mecanismos estão envolvidos na determinação de uma resposta ineficaz contra a L.(L.) amazonensis.
A IL-10 é uma citocina conhecida por sua ação anti-inflamatória, e inibe a produção de outras citocinas por células TCD4+, como IL-2, TNF e IL-5. Inibe também células apresentadoras de antígeno, como os macrófagos e células dendríticas. Em diferentes modelos experimentais como em infecções por Listeria monocytogenes, Candida albicans e Toxoplasma gondii, a IL-10 inibe diferentes passos da resposta contra esses patógenos, podendo levar a uma intensa redução na capacidade de eliminação dos mesmos (Moore e cols., 2001).
Fiorentino e cols. (1991a) mostraram que a IL-10 tem papel importante na inibição da produção de citocinas como IL-1, IL-6 e TNF-α por macrófagos estimulados com LPS ou LPS/ IFN-γ. Na infecção experimental por L.(L.) major, camundongos suscetíveis (BALB/c) ou resistentes (C3H/HeN) tratados com anticorpos monoclonais anti IL-10 (JES5-2A5 ou SXC-1) na fase aguda não apresentam mudanças em seus perfis de infecção. A produção de IL-4 nos camundongos BALB/c é mantida, e essa produção é dependente de células T CD4+. Outros autores, entretanto, mostraram que animais transgênicos para a IL-10 humana apresentam suscetibilidade aumentada para infecção por L.(L.) major e Listeria monocytogenes (Groux e cols., 1999). Trabalhando com camundongos deficientes no gene para IL-10, também infectados com L.(L.) major, Kane & Mosser (2001) mostraram que estes animais controlavam a lesão, diferentemente dos animais BALB/c controles. Eles também apresentavam menor número de parasitas recuperados na lesão que seus controles.
Nossos resultados, após o tratamento de animais C57BL/6 nas três primeiras semanas de infecção mostraram que a ausência da ação dessa citocina não é capaz de alterar o curso da infecção em relação aos animais não tratados (figura 1). Em relação ao parasitismo, obsevamos que este não se alterou entre os grupos após três ou 12
semanas de infecção (figuras 2 e 5). Na infecção de camundongos BALB/c com L.(L.) major, o perfil encontrado na ausência de IL-10 é controverso. Kane & Mosser (2001), trabalhando com camundongos BALB/c deficientes no gene para IL-10, mostraram que esses animais são capazes de controlar a lesão causada pela infecção com L.(L.) major, com redução significante do parasitismo da pata. No entanto, Chatelain e cols. (1999) mostraram que o tratamento com anticorpos anti IL-10 não interferem na suscetibilidade do camundongo BALB/c a essa espécie do parasita. Na fase crônica da infeção, em um modelo de resistência à L.(L.) major, Belkaid e cols. (2001) indicam que o bloqueio do receptor de IL-10 em camundongos C57BL/6 infectados com L.(L.) major após 24 semanas de infecção apresentam cura parasitológica da lesão. Esses dados mostram que, embora camundongos desta linhagem sejam capazes de controlar a lesão, a produção de IL-10 em uma fase tardia é importante para o controle da inflamação e garante, desta forma, a sobrevivência do parasita em pequenos números. Assim, em relação à L.(L.)