E FEITO DOB LOQUEIO DOR ECEPTOR DE

E

FEITO DO

B

LOQUEIO DO

R

ECEPTOR DE

IL-10

NA

R

ESPOSTA

I

MUNE CONTRA

Leishmania amazonensis

AUTORA:JOANA FERREIRA DO AMARAL

ORIENTADOR:Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitoas para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, com área de concentração em Protozoologia parasitária humana.

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Ao Prof. Luís pelas lições de Imunologia,Leishmaniae de Vida.

À Profa. Leda pelo apoio, colaboração e receptividade em seu laborátorio.

Ao Dr. David Sacks, pelo anticorpo cedido e por todas as contribuições feitas ao nosso trabalho.

À profa. Cláudia, por todo o trabalho de análise histopatológica, e pela amizade, carinho e empenho.

Aos técnicos Leandro e Maria Chaves pelo apoio e compreensão. Aos bioteristas, em especial ao Celso, que, mesmo com recursos limitados, empenharam-se com carinho no trato dos nossos animais.

À equipe do CEBIO-UFMG: Gilmar, Elmo e Adelaide pela disposição em atender aos nossos pedidos de animais.

Aos amigos do laboratório, sempre dispostos a ajudar nos experimentos. O nosso convívio com certeza renderia muito mais que uma dissertação de mestrado. Em especial à Tati, Ju, Baiano e Bia.

À Denise pela amizade e boa vontade em todos os momentos. À Profa. Simone, sempre interessada em nosso trabalho.

Ao Prof. Babá pelo carinho, disponibilidade e bom humor, sempre. Aos demais professores do NUPEB, pela disponibilidade a qualquer hora.

Aos colegas de turma, que muito colaboraram em todas as etapas realizadas, seja com a amizade ou com o trabalho. Em especial à Silvana e Baiano.

À Cida, por todo o trabalho e pelos momentos de alegria e descontração.

Aos Profs. Leda, Jaqueline e Ricardo Gazzinelli dos Laboratórios de Nutrição e Gnotobiologia e de Imunoparasitologia do ICB-UFMG pela disponibilidade e paciência. Sempre colhemos lições, mesmo quando nossas tentativas parecem em vão ...

Ao carinho e receptividade de todas as pessoas do LNG e IMPAR. Em especial à Cláudia Beatriz pelo carinho e amizade e ao Helton por tudo o que pode fazer por nosso trabalho.

Ao Sr. Sérgio e D. Marilac, uma segunda família muito especial.

Às irmãs Tati, Dani, Vanessa, Alê, Marcela e Clarissa, pela paciência nos momentos mais difíceis e pela amizade e carinho diários.

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A avaliação do papel da IL-10 na leishmaniose é de extrema importância, pois sendo uma citocina anti-inflamatória, inibe a ação de IFN-γ e NO, que têm papel importante na eliminação do parasita e no controle da lesão. O papel da IL-10 na infecção por L.(L.) amazonensis foi avaliado in vivo neste trabalho tratando-se camundongos C57BL/6, suscetíveis à essa espécie de Leishmania, com anticorpos monoclonais anti-receptor de IL-10 (α−IL-10R) na fase inicial da infecção. Como controle de tratamento inoculamos um grupo de animais com IgG total de rato na mesma dose usada para o anticorpoα−IL-10R (0,5mg/animal/dose) e mantivemos outro grupo sem nenhum tratamento.

Os animais tratados com α-IL-10R, após 3 semanas de infecção, apresentaram perfil histopatológico, produção de TNF e quantificação de parasitas semelhante aos grupos controle, com exceção da produção de IFN-γ produzido por células mononucleares de linfonodo de camundongos tratados com α-IL-10R, que apresentaram quantidades dessa citocina superiores aos animais controles. Em relação aos animais sacrificados 12 semanas após a infecção, o curso da infecção, o parasitismo e a produção de citocinas foram semelhantes para todos os grupos. Em relação à análise histológica, observamos um maior infiltrado inflamatório e um parasitismo tecidual ligeiramente mais acentuado no grupo tratado comα-IL-10R em relação aos controles.

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The evaluation of the role of IL-10 in leishmaniasis is of extreme importance since this anti-inflammatory cytokine inhibits the action of IFN-γ and NO, which play an important role in the elimination of the parasite and control of lesion development. In this study, the role of IL-10 in the infection byL.(L.) amazonensis was evaluated in vivo by treating infected C57Bl/6 mice with monoclonal antibodies against the IL-10 receptor (α-IL-10R) during the initial phase of the infection. Rat IgG was used as treatment control at the same dose used for the α-IL-10R antibody (0.5 mg/animal/dose). Another group was left untreated.

After three weeks, mice treated with α-IL-10R presented histopathological profile, TNF production and parasite quantification similar to control animals. On the other hand, IFN-γ production by lymph node cells fromα-IL-10R treated animals was higher than in control groups. No differences in course of infection, parasitism and cytokine production were observed between animals treated or not sacrificed at 12 weeks of infection. Histologically, a greater inflammatory infiltrate and an slightly increased tissue parasitism was observed inα-IL-10R treated animals at this time point.

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Inoculação e Tratamentos... 18

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Quantificação de parasitas... 20

Cultura de células... 20

Dosagem de citocinas... 21

Análise histológica... 22

Análise estatística... 23

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Figura 1 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o curso da infecção de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...26 Figura 2 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...27

Figura 3 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados por 3

semanas comL.(L.) amazonensise tratados comα−IL-10R ou IgG total de rato...29 Figura 4 - Análise histológica do processo inflamatório em camundongos C57BL/6 tratados

com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados comLeishmania amazonensise sacrificados após três semanas de infecção. ...30 Figura 5- Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...31

Figura 6 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados com

L.(L.) amazonensise tratados comα−IL-10R ou IgG total de rato ...33

Figura 7 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados com

L.(L.) amazonensise tratados comαIL-10R, IgG total de rato ou não tratados...34

L

S

ABTS – [2,2’-azino-bis(3 ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)] APC – Célula apresentadora de antígeno

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium ELISA – Enzime Linked Immunosorbent Assay gp63 – Glicoproteína de superfície 63

HCl – Ácido clorídrico

HEPES – N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid IFN-γ– Interferon gama

IgG – Imunoglobulina G IL-1 – Interleucina 1 IL-1α– Interleucina 1 alfa IL-10 – Interleucina 10 IL-12 – Interleucina 12 IL-12R – Receptor de IL-12 IL-18 – Interleucina 18 IL-2 – Interleucina 2 IL-4 – Interleucina 4 IL-5 – Interleucina 5 IL-6 – Interleucina 6

iNOS – Óxido nítrico sintase induzível LPG – Lipofosfoglicano

LPS – Lipolissacarídeo

MHC I – Complexo de histocompatibilidade principal I MHC II – Complexo de histocompatibilidade principal II

MTT – (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-dipheniltetrazolium bromide) NK – Células matadoras naturais

PBS – Salina tamponada com fosfato PNA – Fitohemaglutinina de amendoim

rIFN-γm – Interferon gama murino recombinante rIL-12 m - Interleucina 12 murino reconbinante rIL-4 m – Interleucina 4 murino reconbinante

rTGF-βm – Fator de crescimento tumoral murino recombinante rTNF-αm – Fator de necrose tumoral murino recombinante SDS – Lauril sulfato de sódio

TGF-β– Fator de transformação de crescimento beta TNF – Fator de necrose tumoral

A leishmaniose é uma doença causada por protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomastidae e ao gênero Leishmania. Apresentam-se sob duas formas principais no ciclo evolutivo: a forma amastigota, parasita obrigatório de células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados e forma promastigota, encontrada no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado. A forma amastigota é esférica ou oval e não apresenta flagelo livre, com tamanho variando entre as espécies. Já a forma promastigota é alongada com flagelo livre e longo, tendo em média 12 µm, de acordo com a espécie (Molyneux & Killick-Kendrick, 1987).

A leishmaniose é transmitida ao homem ou a outros hospedeiros vertebrados pela picada de insetos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomya no Novo Mundo (Ashford, 2000). Esses insetos têm atividade somente quando a temperatura e claridade são adequadas, preferindo geralmente alimentar-se durante o período da noite, quando essas condições são mais favoráveis (Marzochi, 1992). A maioria das leishmanioses são zoonóticas, e a transmissão ao homem ocorre acidentalmente, quando este é exposto ao ciclo silvestre (Ashford, 2000).

A doença apresenta-se sob diferentes formas clínicas, e grande parte dessa variedade de formas é devida à diversidade de espécies do parasita. A classificação atual destas diferentes espécies depende do seu desenvolvimento no tubo digestivo do inseto vetor. Nesta classificação são consideradas espécies do subgênero Leishmania aquelas que têm seu desenvolvimento suprapilário, e aquelas com desenvolvimento peripilário são pertencentes ao subgênero Viannia (Lainson & Shaw, 1987). Essa diversidade é ilustrada pela quantidade de espécies descritas, nem todas encontradas parasitando o homem. Até 1993, cerca de 20 espécies foram encontradas em humanos (Shaw, 1994).

A forma visceral é a mais grave. Os sintomas são pouco específicos, como febre, anemia e hepatoesplenomegalia, o que dificulta o diagnóstico (Ashford, 2000; Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993). As espécies envolvidas nesta apresentação clínica da doença são a L.(L.) infantum eL.(L.) donovani no Velho Mundo eL.(V.) chagasino Novo Mundo. No entanto, L.(V.) chagasi já foi isolada em pacientes com lesão cutânea, enquanto L.(L.) amazonensis foi encontrada em pacientes com sintomas da doença visceral (Barral e cols., 1991).

A leishmaniose cutânea difusa é normalmente causada pelaL.(L.) aethiopica no Velho Mundo e L.(L.) amazonensis, L.(L.) mexicana e L.(L.) venezuelensis, no Novo Mundo. Sua ocorrência está associada a um estado de anergia do hospedeiro, que apresentam macrófagos intensamente parasitados e pouca resposta linfoproliferativa. As lesões características da doença são nodulares e não ulceradas, com um grande número de lesões devido à disseminação do parasita. Em vários casos, pacientes com esta forma clínica apresentam resistência ao tratamento (Convit e cols., 1972; Barral-Netto e cols., 1998).

Já a forma mucocutânea tem como característica uma resposta imune intensa, do tipo hipersensibilidade retardada. Os pacientes apresentam destruição do tecido mucoso e submucoso das cavidades nasal e oral (Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993). A resposta é intensa, e as células locais pouco parasitadas. As espécies envolvidas com essa forma da doença são a L.(V.) braziliensis, a L.(V.) panamensis e a L.(V.) guyanensis, além de outras espécies, em menor proporção (Ashford, 2000).

são encontradas parasitando o homem. No Velho Mundo, a espécie mais encontrada causando esse tipo de lesão é aL.(L.) major(Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993).

A leishmaniose tem distribuição ampla em toda a superfície terrestre, e a Organização Mundial de Saúde classifica a doença como endêmica em 88 países dos 5 continentes, sendo 72 países em desenvolvimento (World Health Organization, 2000). A maioria destes países possui clima tropical ou sub-tropical, e a transmissão da doença é limitada por aspectos climáticos devido ao fato de os vetores não se adaptarem bem a climas frios (Shaw, 1997). Acredita-se que há cerca de 12 milhões de pessoas afetadas pela doença e cerca de 350 milhões de pessoas encontram-se sob risco de infecção. A maioria dos novos casos são representados pela leishmaniose cutânea, sendo outras formas da doença menos abundantes. Grande parte dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem no Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, Síria, Brasil e Peru. No nosso país há também alta prevalência da leishmaniose visceral, bem como em Bangladesh, Índia e Sudão. A doença, além de relacionada com o clima e a presença do inseto vetor, pode também estar associada ao desenvolvimento econômico dos países afetados e alterações do ambiente causadas pelo homem. Atividades econômicas como extração de madeira, construção de barragens, mineração, construções em áreas de florestas são fatores que aumentam a possibilidade de contato entre o vetor e o homem, facilitando a transmissão (World Health Organization, 2000).

Atualmente, tem ganhado importância epidemiológica a reativação da leishmaniose em pacientes que adquiriram o vírus HIV, e há recomendações para a inclusão da leishmaniose no diagnóstico diferencial das doenças oportunistas que acometem indivíduos com AIDS. Esta reativação ocorre mais freqüentemente quando a contagem de células T CD4+ cai drasticamente (World Health Organization, 2000).

fatores derivados do soro estão implicados nessa internalização (Mosser & Rosenthal, 1993; Rittig & Bogdan, 2000).

A fagocitose da Leishmania pelo macrófago é iniciada pelo englobamento, através de pseudópodes, dando origem ao fagosomo. Em sequência, há fusão de vesículas lisosomais a estes fagosomos, dando origem ao vacúolo parasitóforo. As promastigotas rapidamente transformam-se em amastigotas, que sobrevivem neste ambiente e reproduzem-se por divisão binária simples. Além dos macrófagos, outras células podem ser parasitadas, mas não possuem capacidade potencial de eliminar o parasita e podem servir, portanto, de locais de sua sobrevivência (Rittig & Bogdan, 2000).

Posteriormente, o macrófago se rompe, possivelmente, por ação de proteínas formadoras de poros presentes na membrana do parasita (Horta, 1997; Noronha e cols., 1996; Noronha e cols., 2000). Essas amastigotas liberadas podem então infectar novos macrófagos, levando à expansão do parasita, que culmina com a formação da lesão (Noronha e cols., 2000). Quando o mamífero infectado é picado pelo flebótomo, macrófagos infectados são ingeridos e se rompem no trato digestivo do inseto, transformam-se em promastigotas, aderem à membrana do intestino e são protegidos da lise protéica por uma membrana que os envolve, denominada membrana peritrófica. As formas promastigotas passam então por diferentes estágios, e quando tornam-se infectantes e são novamente inoculadas no hospedeiro vertebrado (Bates, 1994).

O sistema imune local consegue eliminar boa parte dos parasitas após a inoculação, mas este é capaz de sobreviver lançando mão de diferentes mecanismos de escape capazes de “burlar” a resposta do hospedeiro. A molécula de superfície do parasita denominada LPG (lipofosfoglicano), por exemplo, impede a deposição dos componentes C5b-C9 do complemento, conferindo uma distância protetora entre o complexo C5b-C9 e sua membrana pelo tamanho de sua molécula. A gp63, outra molécula de superfície do parasita, é capaz de inativar C3b (Nunes e cols., 1997).

pH ácido do fagolisosomo (Solbach & Laskay, 1996). As amastigotas impedem ainda a ativação do macrófago, pela inibição da síntese de IL-12, via proteofosfoglicano (Piedrafita e cols., 1999). Citocinas anti-inflamatórias como IL-10, IL-4 e TGF-β são induzidas por amastigotas, e novamente o parasita garante sua sobrevivência (Solbach & Laskay, 1996), já que essas citocinas inibem a ativação de linfócitos no local. A inibição da produção de óxido nítrico (NO) também é observada, impossibilitando a morte do parasita e o controle da infecção pelo macrófago (Linares e cols., 2000). Além disso, amastigotas de L.(L.) amazonensis são capazes de internalizar e degradar moléculas de MHC II que seriam expressas na superfície da célula hospedeira. Dessa forma, o parasita tem novamente um mecanismo de escape da resposta imune (De Souza e cols., 1995).

Um outro mecanismo de escape da Leishmaniaé através da glutationa presente em sua superfície. A glutationa é um tiol presente em um grande número de células animais, que protege essas células de agentes tóxicos como o NO. No entanto, parasitas do gênero Leishmania também apresentam glutationa, em diferentes concentrações, variando com a espécie. A depleção de glutationa em L.(L.) major aumenta a sua suscetibilidade ao NO, enquanto a depleção deste tiol nos macrófagos, faz com que essas células permitam uma melhor sobrevivência do parasita (Romão e cols., 1999).

Apesar dos diversos mecanismos de escape apresentados pelo parasita, uma resposta contra o mesmo pode ser montada. Essa resposta é dependente de diversos fatores como a espécie de Leishmania e o estado imunológico do hospedeiro. Após a inoculação dos parasitas, as formas promastigotas entram em contato com diferentes componentes do sistema imune local, como eosinófilos, leucócitos polimorfonucleares e componentes do sistema do complemento, que eliminam boa parte das formas infectantes inoculadas pelo vetor. No entanto, a eliminação deste depende basicamente da montagem de uma resposta celular do tipo Th1, que inicia-se logo que o parasita penetra no macrófago local.

células T dos órgãos linfóides periféricos, como linfonodos, e ativar a resposta imune primária celular (Overath & Aebischer, 1999).

Nas horas subsequentes à infecção, observa-se acúmulo de células linfocitárias no local da picada do vetor, que têm como função eliminar o dano ao tecido causado pela picada do inseto e iniciar a resposta contra o parasita (Solbach & Laskay, 1996). Essas células chegam ao local da infecção por atração quimiotática de macrófagos locais infectados capazes de secretar quimiocinas, substâncias capazes de alterar o perfil de moléculas de adesão de células endoteliais e promover a adesão e infiltração de monócitos, eosinófilos e, posteriormente, de linfócitos T ativados que irão responder ao parasita (Rossi & Zlotnik, 2000).

A diferenciação das células T CD4+ é um ponto crucial no estabelecimento da resposta contra Leishmania. As quimiocinas têm ainda papel na diferenciação de linfócitos T em seus subtipos, Th1 ou Th2. Muitas das quimiocinas mostram atividade na promoção da inflamação, com indução da produção de citocinas pro inflamatórias em macrófagos ou em células epiteliais, endoteliais ou fibroblastos (Rossi & Zlotnik, 2000). MIP1-α, por exemplo, quando adicionado a cultura de células T estimuladas com antígeno de ovo deSchistosomaou concanavalina-A, leva à diminuição da produção de IL-4 por essas células (Lukacs e cols., 1997). Essa quimiocina tem sua expressão aumentada em macrófagos com expressão significativa de IL-12 (Zou e cols., 2000). No entanto, RANTES tem importância tanto no desenvolvimento de uma resposta Th1 como Th2. Sua expressão está aumentada tanto em animais infectados com Mycobacterium bovis, infecção granulomatosa pulmonar de resposta característica Th1, quanto em animais infectados com Schistosoma mansoni, infecção de resposta típica Th2 (Chensue e cols., 1999).

A imunidade inata tem papel importante na resistência ao parasita, pois a ação de células como macrófagos, células de Langerhans e NK determinam o perfil de resposta celular específica adotada pelo indivíduo e, consequentemente, estabelece uma resposta que poderá ou não ser efetiva contra o parasita.

que age sobre células matadoras naturais (NK). Essa ação culmina na produção de IFN-γpor células NK, citocina indispensável, juntamente com IL-12, na diferenciação de células CD4+ Th0 para o fenótipo Th1 (Kemp, 1997). As células Th1, por sua vez, intensificam a produção de IFN-γ, que estimula a secreção de TNF-α pelos macrófagos infectados. TNF-αe IFN-γagem então, em conjunto, sobre estes macrófagos infectados estimulando a produção de óxido nítrico e outros reativos derivados do oxigênio com o objetivo de eliminação do parasita. A IL-12 produzida por macrófagos no local da infecção é importante para manter uma ativação permanente dessas células, juntamente com o IFN-γ produzido por células NK e células T que migraram para o local (Trinchieri, 1995). No entanto, a IL-12 produzida por macrófagos não age na diferenciação das células TCD4+, pois sua ação é restrita ao sítio da infecção. A diferenciação de células T CD4+ no linfonodo é relacionada, então, com a produção de IL-12 por células dendríticas que expressam antígenos de superfície e migram do local da infecção para órgãos linfóides. Assim, essas células apresentam os antígenos de Leishmania a células T virgens e secretam IL-12, o que culmina com a ativação da célula T e sua diferenciação para o tipo Th1 (Bottomly, 1999). Essa secreção de IL-12 está diretamente relacionada com o tipo de célula dendrítica envolvida. A tipo 1 (DC 1) secreta IL-12, mas a tipo 2 (DC 2) secreta TGF-βe IL-10, e induzem uma resposta tipo Th2 (Rissoan e cols., 1999). Quando em sinergia com IL-18, a IL-12 induz a ativação da molécula de sinalização STAT4 e promove o aumento da transcrição de IFN-γ. Assim, a presença de IL-18, juntamente com IL-12, reforça esse mecanismo (Nakahira e cols., 2002).

Modelos experimentais animais têm sido de grande ajuda na compreensão dos mecanismos de resposta contra a infecção por Leishmania. O modelo murino é sem dúvida o mais extensamente estudado, e resultados de infecção experimental porL.(L.) major mostram que grande parte do espectro de respostas encontradas no homem pode ser nele reproduzidas. Enquanto algumas linhagens de camundongos são resistentes à infecção, apresentando lesões que curam espontaneamente, outras espécies são suscetíveis a essa espécie do parasita. Entre as linhagens resistentes àL.(L.) majorestão C3H/He, CBA e C57BL/6 e, entre as suscetíveis, podemos citar BALB/c, DBA/2 e A/Jax (Launois e cols., 1996). No entanto, animais resistentes à L.(L.) major podem apresentar-se suscetíveis para outras espécies do parasita. A linhagem C57BL/6, por exemplo, é resistente àL.(L.) major, mas apresenta um perfil de suscetibilidade frente a infecção por L.(L.) amazonensis (Scott e cols., 1987), assim como a linhagem de camundongos CBA. No entanto, a suscetibilidade do camundongo CBA à L.(L.) amazonensis está relacionada a um aumento na produção de IL-4 (De Souza e cols., 2000), diferentemente de animais C57BL/6, que não apresentam produção aumentada de citocinas do tipo Th2 quando infectados com essa espécie (Afonso & Scott, 1993).

O uso de anticorpos monoclonais anti-IFN-γ em camundongos resistentes à infecção por L.(L.) major mostrou que essa citocina tem papel importante durante a imunidade específica (Belosevic e cols., 1989; Scott, 1991), pois esses animais, assim como camundongos resistentes deletados para o gene do receptor de IFN-γ (Wang e cols., 1994) mudaram seu fenótipo de resistência para suscetibilidade. A participação de células TCD8+ é restrita na infecção por Leishmania, mas, quando provenientes de animais resistentes reinfectados, são capazes de produzir altos níveis de IFN-γ(Muller e cols., 1993).

na eliminação do parasita é claramente mostrada quando camundongos resistentes tratados com inibidores de iNOS, ou cujo gene que codifica essa enzima foi deletado, não conseguem controlar a infecção (Wei e cols., 1995).

Em infecções por L.(L.) major, verificou-se que o TNF-α tem participação na proteção contra a doença (Liew e cols., 1990). Sua ação é dependente de IFN-γ, e, na presença dessa citocina, é capaz de induzir a produção de NO necessária para a morte do parasita (Green e cols., 1990). A ação do TNF é dependente de seus dois receptores, TNFRp55 e TNFRp75. Na leishmaniose, foi verificado que animais deficientes no receptor p55 eram capazes de produzir grandes quantidades de IFN-γ, de NO e controlavam o parasitismo, mas a lesão não curava. Assim sugere-se a participação do receptor p55 na regressão da lesão (Vieira e cols., 1996). Já o receptor p75 mostrou-se desnecessário para o controle da lesão, pois animais deficientes neste receptor não tiveram o curso da infecção alterado (Nashleanas e cols., 1998)

No entanto, uma resposta efetiva contra diferentes espécies deLeishmania nem sempre acontece, sendo a suscetibilidade a este parasita relacionada à expansão de células TCD4+ tipo Th2, onde a citocina IL-4 é a principal envolvida na diferenciação desses linfócitos. Esses resultados foram obtidos em infecção por L.(L.) major em camundongos BALB/c (Chatelain e cols., 1992). Além disso, a IL-4 é capaz de inibir a expressão de receptor de IL-12 (IL-12R) devido à sua rápida produção por células T de camundongos BALB/c infectados por L.(L.) major (Himmelrich e cols., 1998). Essa rápida produção de IL-4 é devida principalmente à resposta de células Th2 de memória já diferenciadas, ao antígeno LACK de L.(L.) major. Essas células Th2 de memória responderiam normalmente a algum componente da flora intestinal dos camundongos BALB/c (Launois e cols., 1997).

produção de IL-4 nesses animais, e o bloqueio de IL-12 em animais C3H, resistentes à infecção porL.(L.) major, promoveu o aumento na produção de IL-4.

Outro exemplo do não envolvimento da IL-4 com a suscetibilidade foi demonstrado por Afonso & Scott (1993). Esses autores mostraram que camundongos C57BL/10, resistentes à L.(L.) major mas suscetíveis à L.(L.) amazonensis, não produzem grandes quantidades nem de IL-4 nem de IFN-γ quando infectados com a última espécie. Esses dados sugerem que a ausência de uma resposta Th1, com elevada produção de IFN-γ, esteja mais relacionada à suscetibilidade que a presença de uma resposta do tipo Th2.

Reforçando a idéia de que a ausência de resposta Th1 é mais importante para determinar a suscetibilidade que a presença de uma resposta Th2, foi verificado que a ausência de receptor para IL-12 em células TCD4+ em camundongos C3H infectados com L.(L.) amazonensis estaria diretamente envolvida com a suscetibilidade deste animal, de maneira independente de IL-4 (Jones e cols., 2000).

Dessa forma, a participação da IL-4 no desenvolvimento da suscetibilidade de camundongos BALB/c infectados comL.(L.) major é discutida, e seu papel na infecção por outras espécies de Leishmania nem sempre está diretamente relacionado à suscetibilidade .

A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória que impede a produção de outras citocinas e a proliferação de células TCD4+, via inibição de células apresentadoras de antígeno, como os macrófagos e células dendríticas. É capaz de inibir, nestas células, a produção de IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18, entre outras, além da expressão de MHC II. Também inibe a produção de quimiocinas como MCP-1, MCP-5, MIP-1α, MIP-1β, 8, MIP-2, IP-10 e KC. Afeta diretamente as células T, impedindo a produção de IL-2, TNF e IL-5. Essa inibição não pode ser revertida, nem mesmo na presença de IL-2 ou anti CD3 e anti CD28 (Moore e cols., 2001).

Em infecções experimentais por diferentes microorganismos, como Listeria monocytogenes,Candida albicanseToxoplasma gondii, a IL-10 inibe diferentes passos da resposta contra esses patógenos, podendo levar a uma dramática redução na capacidade de eliminação dos mesmos (Moore e cols., 2001).

O receptor de IL-10 é composto de duas subunidades, e pertence à família dos receptores de IFN. O receptor I de IL-10 é expresso em células não hematopoiéticas de modo geral, e sua expressão é muito mais induzível que constitutiva. Já o receptor II tem expressão constitutiva na maioria dos tecidos (Moore e cols., 2001).

Além de seu papel como citocina anti-inflamatória, a IL-10 tem importância no controle no crescimento de tumores. Sua expressão por células T em presença de células tumorais, promoveu a inibição de metástases pela diminuição da expressão de MHC I pelas células do tumor e, consequentemente, o aumento da atividade lítica de células NK (Segal e cols., 2002; Kundu & Fulton, 1997).

Em humanos, a IL-10, quando adicionada à cultura de células mononucleares de sangue periférico de pacientes com leishmaniose, inibe a proliferação desses linfócitos, a produção de IFN-γ e a atividade citotóxica destas células. A neutralização da IL-10 restaura parte da atividade linfocitária, e, em alguns pacientes, a adição de IL-12 é capaz de reestabelecer essa atividade (Barral-Netto e cols., 1998).

de IL-10 promoveu um aumento na secreção de IL-6 por essas células (Fiorentino e cols., 1991a).

Células esplênicas de animais BALB/c ou CBA pré incubadas com IL-10 têm menor produção de IFN-γ quando comparada com células controle. No entanto, quando células apresentadoras de antígeno (APC) são inibidas, ocorre queda na produção de IFN-γ por células Th1. Assim, a IL-10 inibe a resposta Th1 via inibição das APCs (Fiorentino e cols., 1991b).

Células mononucleares do sangue periférico de pacientes com leishmaniose visceral produzem maiores quantidades de IL-10 que de IFN-γ em resposta ao parasita, com grande participação de células TCD8+, indicando que essas células podem ser responsáveis pelo aumento nos níveis da IL-10 secretada por esses pacientes (Holaday, 2000).

Camundongos deficientes no gene da IL-10 apresentam suscetibilidade aumentada frente à infeção por L.(L.) majorou Listeria monocytogenes (Groux e cols., 1999). Em camundongos transgênicos com a produção de IL-10 endógena aumentada, também é observado um aumento da suscetibilidade à L.(L.) major (Belkaid e cols., 2001).

parasitismo na lesão após a cura. Camundongos resistentes à L.(L.) major apresentam, após cura clínica da lesão, níveis baixos de parasitas que são eliminados quando o animal é tratado com anticorpos anti-receptor de IL-10 (α-IL-10R). No local da lesão observa-se pequena população de células TCD4+ produzindo, simultaneamente, IFN-γe IL-10. A IL-10 proveniente dessas células teria o papel de controlar a resposta inflamatória elicitada por IFN-γ, mas permite a persistência do parasita.

Objetivo Geral

Avaliar o papel da IL-10 no curso de infecção e na resposta imune de animais C57BL/6 infectados comL.(L.) amazonensis.

Objetivos Específicos

Acompanhar o desenvolvimento de lesão nas patas de animais C57BL/6 inoculados com L. amazonensis e tratados com anticorpos anti-receptor de IL-10 (α−IL-10R), IgG total de rato ou não tratados;

Quantificar os parasitas na lesão após 3 ou 12 semanas de infecção nos animais tratados comα−IL-10R, IgG total de rato ou não tratados;

Avaliar histopatologicamente as lesões de animais tratados α-IL-10R, IgG total de rato ou não tratados ;

Animais e Parasitas

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 fêmeas, com idade entre 6 e 8 semanas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais – CEBIO-UFMG. Durante os experimentos, os animais foram mantidos no Biotério Central da UFOP.

Os parasitas utilizados foramLeishmania (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), mantidos em cultura a 25ºC em meio de Grace (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) acrescido de 20% de soro fetal bovino (Nutricell - Campinas, SP, BR), 2 mM de L-glutamina (GIBCO BRL) e 20 µg/mL de sulfato de gentamicina (Shering Ploug, Rio de Janeiro, RJ, BR).

Inoculação e Tratamentos

A inoculação dos animais foi feita utilizando-se as formas promastigotas metacíclicas de Leishmania amazonensis, na pata traseira esquerda dos animais, com inóculo de 1x105 parasitas por pata. Para a obtenção das formas metacíclicas foram utilizadas culturas em fase estacionária de crescimento (5 dias).

Foi realizada a contagem e o ajuste da concentração. A quantidade de parasitas necessária para a infecção foi novamente centrifugada a 1540 xgpor 10 minutos a 4ºC e resuspendida em PBS estéril, quando então foi feita a inoculação.

A administração do anticorpo 1B1.3a (anti-receptor de IL-10 - αIL10R -gentilmente cedido pelo Dr. David Sacks, NIH/ EUA) foi feita em dois esquemas: A - 4 doses de 0,5 mg/animal, via intraperitoneal, com a primeira dose no dia anterior ao da inoculação e as doses subsequentes em intervalos de 3 a 4 dias. Como controle um grupo foi tratado com inoculações, pela mesma via e nas mesmas quantidades, de IgG total de rato;

B -6 doses de 0,5 mg/animal, via intraperitoneal, sendo a primeira dose no primeiro dia após a inoculação do parasita e as doses subsequentes em intervalos de 3 a 4 dias. Como controle foi mantido um grupo sem tratamento e outro grupo com inoculações, pela mesma via e nas mesmas quantidades, de IgG total de rato.

Os dois esquemas de tratamento foram feitos com o objetivo de verificar se o aumento na dosagem do anticorpo α-IL-10R alterava o prefil de infecção. Foram feitos dois experimentos semelhantes para cada esquema de tratamento, e em cada experimento fora utilizados 3 camundongos por grupo.

Acompanhamento do desenvolvimento da lesão

Quantificação de parasitas

A pata infectada dos animais foi coletada após 3 ou 12 semanas de infecção e tratada em detergente neutro (Deterbio, BR) diluído 1:100 por 2 minutos seguido de banho em álcool 70% também por 2 minutos, com o objetivo de desinfecção. Em seguida, a pele foi retirada e a lesão pesada, sendo metade da lesão destinada à quantificação de parasitas. Este ensaio foi realizado conforme descrito por Vieira e cols. (1996). Sucintamente, pesou-se e acondicionou-se a lesão em tubos de 1,5mL estéreis em gelo. O pedaço da lesão foi transferido para o homogeneizador de tecidos, juntamente com cerca de 2 mL de meio de Grace, e o tecido macerado. O volume obtido foi transferido para um tubo estéril de 15 mL e o procedimento anterior repetido. Adicionou-se meio de Grace até completar 10 mL. O material foi centrifugado a 150 xg por 1,5 min a 4ºC, para retirada de fragmentos de tecido remanescentes. O sedimento foi descartado, o sobrenadante transferido para outro tubo de 15 mL estéril e centrifugado a 1540 x g por 10 min a 4ºC. O sedimento foi novamente resuspendido em 500 µL de meio de Grace acrescido de 20% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina e 20 µg/mL de sulfato de gentamicina. O material foi distribuído, em duplicatas, em placas de 96 poços estéreis. Fez-se diluição seriada 1:10 por 12 poços subsequentes. A placa foi incubada a 26º_{C por 7 dias, quando foi feita a leitura do crescimento de parasitas, ta}

em microscópio invertido (ZEIZZ). O resultado obtido foi expresso como logaritmo do inverso da maior diluição que apresentou crescimento de parasitas positivo.

Cultura de células