As variáveis contínuas foram apresentadas na forma de média ± desvio padrão ou de mediana (intervalo interquartil) e comparadas com o teste t-Student, teste U de Mann- Whitney e análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey quando o F foi significativo ou Kruskal-Willis seguido pelo teste de Mann-Whitney, quando necessário. As diferenças entre treino e teste foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon. Correlações entre as variáveis estudadas foram determinadas pelo teste de Pearson. Todos os testes foram feitos no programa SPSS versão 20. Em todas as análises foi adotado como nível para significância estatística um p-valor < 0,05.
4 RESULTADOS
4.1. Níveis de CD40-CD40L
Os níveis protéicos de CD40 e CD40L foram mensurados através de Western Blotting em animais submetidos a sepse por CLP ou sham em 12, 24 e 48 horas. As figuras 4A, 4B e 4C mostram respectivamente que animais submetidos a CLP apresentam níveis aumentados de CD40 e CD40L em hipocampo em todos os tempos quando comparados ao grupo sham. O aumento dos níveis de CD40 e CD40L indicam que sepse leva a ativação da via CD40-CD40L potencializando o dano cerebral.
Figura 4A: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (12 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
Figura 4B: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (24 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
Figura 4C: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (48 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.2 Permeabilidade da barreira hematoencefálica
A Figura 5 representa os resultados de permeabilidade da BHE pela técnica de extravasamento de azul de evans 24 horas após sepse ou sham. Nossos resultados indicam um aumento da permeabilidade da BHE no hipocampo de animais submetidos a sepse (CLP+salina) quando comparados ao grupo sham. A avaliação após administração de anti-
CD40 nas doses de 10 e 100 ug/kg em ratos submetidos a sepse mostra diminuição da permeabilidade da BHE quando comparado o grupo CLP + salina.
Figura 5: Avaliação de quebra de BHE em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou Não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
4.3 Níveis de citocinas
A avaliação dos níveis de citocinas TNFα, IL-1β e IL-6 pela técnica ELISA revelam aumento dos niveis dessas moléculas no hipocampo 24 horas apos os animais serem submetidos a CLP (Fig 6A, B e C respectivamente). A administração de anti-CD40 na dose de 100 ug/Kg resulta em significante diminuição nos níveis de TNFα, IL-1β e IL-6 em relação a CLP+salina, enquanto a dose de 10 ug/kg foi efetiva apenas na redução dos níveis de TNFα em hipocampo de ratos submetidos a sepse.
Figura 6A: Níveis de TNFα em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
Figura 6B: de IL-1β em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina considerando p<0,05.
Figura 6C: Níveis de IL-6 em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg; $ Significativo em relação a CLP + anti-CD40 10 ug/kg considerando p<0,05.
4.4 Estresse oxidativo: TBARS e Carbonilação de proteínas
A figura 7A apresenta os resultados de TBARS, como um indicativo de dano oxidativo em lipídios. Nossos resultados mostram que animais submetidos a sepse apresentam maior dano em lipídios no hipocampo que animais submetidos a sham, porém, o tratamento com anti-CD40 na dose de 100 ug/kg reduziu a peroxidação lipídica nessa estrutura cerebral.
A figura 7B mostra os resultados de carbonilação de proteínas. No presente estudo verificamos um aumento da carbonilação protéica em animais submetidos a sepse (CLP+salina) em relação a sham e o tratamento com anti-CD40 não apresentou efeito de redução de dano em nenhuma dose testada.
Figura 7A: Dano em lipídeos em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg; $ Significativo em relação a CLP + anti-CD40 10 ug/kg considerando p<0,05.
Figura 7B: Dano em proteínas em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.5 Avaliação da concentração de nitrito/nitrato
A figura 8 apresenta os resultados da concentracao de nitrito/nitrato como indicativo de formação de ON no hipocampo de ratos submetidos ou não a sepse e tratados com anti- CD40. Verificamos que houve um aumento significativo na concentracao de nitrito/nitrato no hipocampo de ratos submetidos a CLP + salina em relação a sham e quando foi administrado
anticorpo anti-CD40, as três doses foram efetivas na redução dos niveis de nitrito/nitrato em relação a CLP+salina.
Figura 8: Concentração de ON em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina considerando p<0,05.
4.6 Atividade da mieloperoxidase
A resposta inflamatória pode ser avaliada pela quantidade de infiltrado de neutrófilos e para isso utiliza-se a técnica de atividade da MPO. No presente estudo foi observado um aumento do infiltrado de neutrófilos no hipocampo de animais submetidos a sepse (CLP+salina) e o tratamento com anti-CD40 nas doses de 10 e 100 ug/kg foi capaz de reverter esses níveis (Fig 9).
Figura 9: Atividade da MPO em hipocampo de ratos submetidos a sham e CLP tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
4.7 Avaliação da sobrevida
Conforme figura 10, a sobrevida dos animais submetidos a sham, CLP e CLP+anti- CD40 (100 ug/kg) foi acompanhada por 10 dias consecutivos. Animais sham sobreviveram pelos 10 dias, não houve mortalidade para esse grupo. Animais submetidos a sepse sem tratamento apresentaram mortalidade de 55,55%, enquanto que animais submetidos a sepse e tratados com anti-CD40(100 ug/kg) apresentaram mortalidade de 38,88%. Estatisticamente, CLP e CLP + anti-CD40 não apresentaram diferenças significativas, porém, em relação a sham, ambos grupos mostraram diminuição da sobrevida (p=0,01).
Figura 10: Acompanhamento da sobrevida de animais submetidos a sham, CLP e CLP+anti- CD40 (100 ug/kg). Curva de Kaplan-Meier analizados por log-rank. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.8 Testes comportamentais
No presente estudo foram realizados dois testes comportamentais para avaliar o efeito de anti-CD40 na dose de 100 ug/Kg. A figura 11A mostra o resultado de habituação a
campo aberto, onde os animais são submetidos a um treino e 24 horas após a um teste. Podemos observar que animais CLP tiveram atividade locomotora dimuida e portanto, prejudicada, enquanto que animais tratados assemelham-se aos sham (controle). A figura 11B apresenta o resultado de Esquiva Inibitória, teste que avalia a retenção de memória. Nossos resultados mostraram que animais submetidos a CLP possuiram retenção de memória prejudicada, enquanto que animais tratados assemelham-se a animais sham.
Figura 11A: Habituação a campo aberto. Dados são apresentados como media e erro da média. *Diferença significativa em comparação ao treino considerando p<0.05.
Figura 11B: Esquiva Inibitória. Dados são apresentados como média e intervalos interquatis. *Diferença significativa em relação ao treino considerando p<0.05.
5. DISCUSSÃO
Na amplitude das manifestações clínicas da sepse, a encefalopatia séptica é uma das mais comuns, embora pouco diagnosticada, além de ser a causa de maior taxa de mortalidade. Além disso, sobreviventes de UTIs, incluindo pacientes sépticos, podem ter morbidade associada ao cérebro incluindo déficit cognitivo e desenvolvimento de distúrbios psiquiátricos. Em modelo animal de sepse polimicrobiana, ocorre encefalopatia aguda e os sobreviventes apresentam danos cognitivos no SNC (DAL PIZZOL et al, 2010).
Muitos estudos têm mostrado que CD40L e seu receptor CD40 participam em numerosas vias inflamatórias que regulam uma variedade de doenças. É comum encontrar resultados exibindo a interação entre CD40-CD40L com doenças como Alzheimer, lúpus (TAKAYA et al, 2003), aterosclerose (SCHAFER E BAUERSACHS, 2008) e diabetes (METWALLEY et al, 2013), mas estudos envolvendo sepse são raros e não são encontrados dados relativos ao SNC.
As primeira observação obtida nesse estudo foi o aumento dos níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de ratos em 12, 24 e 48 horas após indução de sepse. A via CD40- CD40L parece estar envolvida na mediação da resposta inflamatória implicada na
fisiopatologia e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunes
(CHATZIGEORGIOU et al, 2009) uma vez que a expressão de CD40 é rapidamente regulada quando células são expostas a mediadores pró-inflamatórios (SALEMI et al, 2011). Dessa forma a neuroinflamação encontrada na sepse é capaz de induzir a ativação dessa via de sinalização, potencializando o dano já verificado em outros estudos no hipocampo (DAL- PIZZOL, 2013; MINA et al, 2014).
Outro achado nesse estudo foi que o tratamento com anticorpo anti-CD40 diminui a permeabilidade da BHE na sepse. Sabe-se que a interação entre a BHE, neurônios e microglia formam um complexo chamado unidade neurovascular mostrando que existe interação entre estas células e que elas podem afetar o funcionamento normal do SNC, que era dito como imune privilegiado (GINHOUX et al, 2010). Atualmente a BHE não pode mais ser vista como uma barreira imutável e não responsiva aos diferentes estímulos orgânicos (AGOSTINHO et al, 2010), uma vez que se sabe que esta é suscetível a mudanças que podem afetar também o ambiente interno (ABBOTT et al, 2010; KACIMI et al, 2011). Dessa forma na disfunção da BHE sugere o envolvimento de fatores periféricos, incluindo as toxinas e os elementos da imunidade adaptativa, que pode desempenhar um papel na patogênese como
também na progressão das doenças neurodegenerativas (ABBOTT, 2006; AGOSTINHO et al, 2010; ABBOTT et al, 2010; MELO et al, 2011; KACIMI et al, 2011).
A disfunção da BHE se torna importante uma vez que permite que as substâncias que não atingiriam o encéfalo, passam a fazê-lo, como moléculas complemento, toxinas e metais, além de contribuir para a alteração do equilíbrio de íons, perturbação dos sistemas de transporte e, potencialmente, alterar os constituintes da barreira enzimática, tornando-os ineficazes (CARVEY et al, 2010). Em resposta a isso as células que compõe a BHE podem secretar prostaglandinas, óxido nítrico, e citocinas que afetam o funcionamento do SNC (CARVEY et al, 2010). Dessa forma, microglia e macrófagos perivasculares entre outras células são capazes de interagir com ela (KACIMI et al, 2011). Ainda leucócitos são capazes de cruzar a BHE por diapedese através das junções endoteliais (ABBOTT et al, 2010).
Existe evidência do comprometimento da BHE tanto em pacientes, como em modelo animal de sepse (NISHIOKUC et al, 2010). Um estudo tem relacionado à ruptura da BHE como peça chave para a causa do delirium associado à sepse (HUGHES et al., 2013). Além do dano vascular e ativação entodelial, lesões na BHE podem facilitar a entrada de neurotoxinas e células inflamatórias, bem como mediadores inflamatórios para o parênquima cerebral (SHARSHAR et al, 2005). Nesse sentido, sabe-se que a encefalopatia associada a sepse pode levar ao rompimento da BHE e a formação de edema cerebral (PAPADOPOULOS et al, 2000; DAVIES, 2002).
Nosso resultado aponta para maior permeabilidade da BHE em animais com sepse não tratados e a avaliação após a administração de anti-CD40 mostrou diminuição da
permeabilidade para as doses de 10 e 100 g/mL de anticorpo no tempo de 24 horas após a
indução de sepse. Esse resultado demonstra que a inibição de CD40 diminuiu a permeabilidade da BHE, por mecanismo possivelmente associado à sinalização exercida pela ativação das vias relacionadas a esta molécula. Nesse sentido a inflamação sistêmica provocada pelo modelo CLP afeta a permeabilidade da BHE e a via CD40-CD40L está possivelmente relacionada a este evento e a progressão da neuroinflamação em encefalopatia associada a sepse.
O sistema CD40-CD40L organiza o processo de inflamação através de mensageiros secundários. Essa interação provoca liberação de várias citocinas e quimiocinas e ativação de vários fatores de transcrição (MACH et al, 1997). Na sepse, mediadores pró- inflamatórios, tais como citocinas têm papel importante na inflamação do SNC (LUO S, WEHR, 2009). Foi de fato demonstrado que a liberação de citocinas é aumentada em
pacientes criticamente doentes na forma precoce, incluindo o TNF-α, IL-1β, e IL-10 (DALLE-DONNE et al, 2003).
Na sepse, o TNF-α como um fator pró - inflamatório, é a primeira citocina multifuncional produzida a partir de monócitos e macrófagos estimuladas por LPS, que induz a cascata inflamatória e contribui para a severidade da lesão de tecidos (KACIMI et al, 2011). Após a infiltração de células fagocíticas no tecido, além da liberação de TNF- α, ocorre
ativação de uma cascata de mediadores pró-inflamatórios não controlados
fisiopatologicamente, entre eles IL-6 e IL-1β (O’KEEFE et al, 2002), agravando a inflamação e causando falência múltipla de órgãos em modelos experimentais de sepse e na clínica (ALOISI et al, 1998). No presente estudo, TNF-α, IL-1β e IL-6 foram avaliados em diferentes doses de anti-CD40 (1, 10 e 100 ug/kg), sendo que as doses de 10 e 100ug/kg inibiram significativamente os niveis de TNF-α, no entanto, IL-6 e IL-1β foi apenas inibido em 100 ng/kg de anti-CD40.
A atividade da enzima MPO é um marcador indireto de ativação de leucócitos e está relacionada a migração celular (BRADLEY et al, 1982). Concentrações aumentadas de MPO já foram encontradas em modelos animais de sepse (UYANIK et al, 2012) e nesse estudo foi encontrado níveis elevados dessa enzima no grupo CLP, enquanto que nos grupos tratados (doses de 10 e 100ng/kg) estes níveis estão diminuídos sendo um indicativo da dimunuição do infiltrado de neutrofilos para o hipocampo.
Outra importante achado no presente estudo foi que anti-CD40 diminui a concentração de nitrito/nitrato como um indicativo da formação de ON no hipocampo de ratos submetidos a sepse. O ON é produzido de forma exacerbada em condições de sepse, principalmente pela ativação da óxido nítrico sintase (iNOS), que pode ser ativada por lipopolissacarideo e citocinas (IRKEBOEN E TRAND, 1999). No cérebro o ON pode atuar como mediador inflamatório, e também na formação de ERN. Conjugando-se com o radical superóxido, pode formar o peroxinitrito, que é uma espécie de nitrogênio altamente reativa e
prejudicial a célula (GANDHI E ABRAMOV, 2012). Verificamos em nosso estudo que as
diferentes doses de anti-CD40 foram efetivas na diminuição da formação de nitrito/nitrato quando comparado ao controle que não recebeu anticorpo, mas que foi submetido ao modelo CLP.
Chen et al, (2006) forneceram evidências diretas da presença de estresse oxidativo induzido por sCD40L e geração de EROs em doença de Alzheimer. No presente estudo foi demonstrado que administração do anticorpo anti-CD40 diminui a lipoperoxidação, mas não a carbonilação protéica no hipocampo de ratos submetidos à CLP.
Aproximadamente 20% do total do O2 se destinam a consumo das células
neuronais, além de elevadas concentrações de glicose, o que torna este órgão especialmente
susceptível a toxicidade exercida pelo O2 (GANDHI et al, 2012). Entre as diferentes regiões
afetadas pelo estresse oxidativo durante a sepse experimental, um estudo avaliando a apoptose e a vulnerabilidade das diferentes regiões cerebrais induzida pela inflamação sistêmica concluiu que o hipocampo é a região mais vulnerável durante a sepse experimental (SEMMLER et al, 2005, DAL-PIZZOL et al., 2010).
Nossos resultados mostram que o tratamento com anticorpo anti-CD40 diminuiu a lipoperoxidação no hipocampo, ou seja, supostamente impediu a ativação do receptor CD40 resultando em proteção do hipocampo ao dano oxidativo. Em modelo de sepse abdominal polimicrobiana induzido por CLP há indução de dano oxidativo no hipocampo dos animais causado pelo aumento da produção de radicais livres de 0 a 96 horas após a indução de sepse
(RITTER et al, 2003) indicando que a toxicidade exercida pelo O2 esta relacionada à
fisiopatologia de sepse.
Outro evento relacionado ao dano oxidativo irreversível é a carbonilação de proteínas, que leva muitas vezes a perda de função da proteína, sendo que o nivel de proteína carbonilada é o biomarcador mais usado para avaliar dano oxidativo em proteínas (LUO E WEHR, 2009; DALLE-DONE et al, 2003). Resultados apontam que o início do dano oxidativo no hipocampo de animais submetidos a sepse inicia precocemente em 6 horas no decurso da doença (BARICHELLO et al, 2006). Sendo que o pico máximo de carbonilação protéica no hipocampo em 12 e 24 horas após o procedimento de CLP (PETRONILHO et al, 2012). Em nosso trabalho não verificamos resultado significativo com a administração das diferentes doses de anticorpo anti-CD40 24 horas após a indução de sepse polimicrobiana no hipocampo de ratos. Isso deve-se ao fato de que outros grupamentos protéicos podem estar sendo afetados e não necessariamente o grupamento carbonila.
Os resultados de avaliação de sobrevida não mostraram diferença estatisticamente significativa entre animais submetidos a CLP e CLP + anti-CD40 (100 ug/kg). Em ambos os grupos, os resultados foram significativos em relação a sham que não apresentou mortalidade. Esse resultado nos mostra que tratamento com anti-CD40 não é capaz de interferir na mortalidade dos animais submetidos a sepse, mas interfere na diminuição de dano cognitivo em animais sobreviventes. Nossos resultados demonstraram que os animais sépticos 10 dias após a cirurgia apresentaram déficits de memória e aprendizagem. Alguns estudos demonstraram que os sobreviventes de unidades de terapia intensiva (UTI) apresentam déficit cognitivo em período de longo prazo, incluindo alterações na memória, atenção, concentração
e / ou a perda global de função cognitiva e prejuízo na qualidade de vida (ANGUS et al, 2001; ROTHENHAUSLER, 2001; GRANJA et al, 2004; HOPKINS et al, 2005).
Até o momento, consequências da encefalopatia séptica a longo prazo, são pouco compreendidas. Um estudo demonstrou em modelo animal que o comprometimento comportamental é independente dos níveis de glicose cerebral, mas depende do gene iNOS, sugerindo uma relação com a ativação microglial (WEBERPALS et al., 2009). Além disso, sabe-se que a fase inicial da sepse caracteriza-se por aumento na produção de EROs levando ao estresse oxidativo (BARICHELLO et al, 2006). Uma vez que o estresse oxidativo e a inflamação são eventos relacionados em doenças neurodegenerativas e na sepse, é possível que tanto o estresse oxidativo e ativação microglial colaborem para o dano cognitivo a longo prazo, observado em sobreviventes de sepse.
6. CONCLUSÃO
O presente estudo apresenta pela primeira vez o envolvimento da via de sinalização CD40-CD40L na disfunção cerebral associada a potencialização da neuroinflamação, ao estresse oxidativo e o dano cognitivo em um modelo animal de sepse. Em resumo, os animais sépticos apresentaram níveis significativamente mais elevados de proteínas de CD40 e CD40L em 12, 24 e 48 horas após indução de sepse. A inibição de CD40 com anticorpo específico protegeu o hipocampo do estresse oxidativo, prevenindo a peroxidação lípica e reduzindo a formação de ON e infiltrado de neutrófilos. Aliado a isto, verificou-se que a inibição com anticorpo resultou em diminuição da permeabilidade da BHE, que é aumentada em condições de sepse, diminuiu o comprometimento cognitivo em sobreviventes de sepse, no entanto, não foi capaz de reduzir a mortalidade. Em conclusão, a via CD40-CD40L está associada a danos causados pelo estresse oxidativo e aumento da permeabilidade da BHE, e pode estar relacionada a fisiopatologia da encefalopatia séptica e a modulação dos níveis de CD40 e CD40L podem ser um potencial avanço em intervenções farmacológicas em danos neurológicos na sepse.
7. REFERÊNCIAS
Abbott NJ, Patabendige AAK, Dolman DEM, Yusof SR, Begley DJ. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 2010; 37(1):13–25.
Abbott NJ, Rönnbäck L, Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews Neurosci. 2006; 7:41–53.
Adamson P, Etienne S, Couraud PO, Calder V, Greenwood J. Lymphocyte migration through brain endothelial cell monolayers involves signaling through endothelial ICAM-1 via a rho- dependent pathway. J Immunol. 1999; 162(5):2964-2973.
Agostinho P, Cunha RA, Oliveira C. Neuroinflammation, Oxidative Stress and the Pathogenesis of Alzheimer’s Disease. Curr Pharm Des. 2010; 16(5):2766–2778.
Agrawal SM, Lau L, Yong VW. MMPs in the central nervous system: where the good guys go bad. Semin Cell Dev Biol. 2008; 19:42-51.
Alberti C, Brun-Buisson C, Burchardi H, Martin C, Goodman S, Artigas A, et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive Care Med. 2002; 28:108-121.
Aloisi F, Ambrosini E, Columba-Cabezas S, Magliozzi R, Serafini B. Intracerebral regulation of immune responses. Ann. Med. 2001; 33:510–515.
Aloisi F, Ria F, Penna G, Adorini L. Microglia are more efficient than astrocytes in antigen processing and in Th1 but not Th2 cell activation. J Immunol. (Baltimore, Md : 1950). 1998; 160:4671–4680.
American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med. 1992; 20(6):864-874.
Ananne D, Aegerter P, Jars-Guincestre MC, Guidet B. Current epidemiology of septic shock. Am J Resp Crit Care Med. 2003; 168:165-172.
Annane D, Bellissant E, Cavaillon J. Septic shock. The Lancet. 2005; 365:63-78.
Ananne D, Sébille V, Charpentier C, Bollaert PE, François B, Korach JM, et al. Effect of treatment with low doses of hydrocortisone and fludrocortisones on mortality in patients with septic schock. JAMA. 2002; 288:862-871.