UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA MONIQUE MICHELS
INTERAÇÃO ENTRE O RECEPTOR DE MEMBRANA CD40 E O SEU LIGANTE CD40L SOBRE MECANISMOS NEUROINFLAMATÓRIOS E
COMPORTAMENTAIS ASSOCIADOS À SEPSE
Tubarão 2014
MONIQUE MICHELS
INTERAÇÃO ENTRE O RECEPTOR DE MEMBRANA CD40 E O SEU LIGANTE CD40L SOBRE MECANISMOS NEUROINFLAMATÓRIOS E
COMPORTAMENTAIS ASSOCIADOS À SEPSE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito para obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde.
Prof. Orientadora: Fabrícia Petronilho, Dra.
Tubarão 2014
MONIQUE MICHELS
INTERAÇÃO ENTRE O RECEPTOR DE MEMBRANA CD40 E O SEU LIGANTE CD40L SOBRE MECANISMOS NEUROINFLAMATÓRIOS E
COMPORTAMENTAIS ASSOCIADOS À SEPSE
Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovado em sua forma final pelo Curso de Mestrado em Ciências da Saúde da Universidade do Sul de Santa Catarina
Tubarão, 7 de julho de 2014
_____________________________________________________________________ Orientadora Fabrícia Petronilho, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
_____________________________________________________________________ Professora Fabiana Schulter Trevisol, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
______________________________________________________________________ Professor Paulo Cesar Lock Silveira, Dr.
Dedico esse trabalho a meu pai, minha mãe e a Miguel que propiciaram todos os meios e a estrutura para realização do mesmo. Sem vocês não teria conseguido!
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela graça da vida e tudo mais. A minha família, pelo apoio, suporte, estrutura e sabedoria; A Miguel, pelo apoio incondicional, pela ajuda mútua, minha base firme.
A Prof. Dra Fabrícia Petronilho, a nossa Fá pelo prazer de trabalhar com ela e por ter me ensinado a dar os primeiros passos na pesquisa, proporcionando grandes oportunidades na minha vida. Ao Prof. Dr Felipe Dal Pizzol que é referencia em pesquisa científica, pelas oportunidades e por tudo o que me ensinou.
A Prof. Dra Jucélia Fortunato, minha inspiradora e segunda orientadora, desde que a conheci sempre me deu força para buscar meus sonhos, eis um aqui!!
A Andriele, eterna amiga, que me instigou sempre a buscar pelos meus sonhos, que me apoiou e que me abrigou em sua casa durante boa parte do mestrado;
A Luci, pelo apoio para entrar no mestrado, por me ensinar ciência, por ceder sua casa durante parte do mestrado. A Drielly, por não medir esforços para me ajudar e aos demais integrantes do grupo de pesquisa FICEXP: André, Luiz Carlos e os demais que sempre estiveram presentes pro que der e vier nos experimentos, nas festas, nos amigos secretos.. Eternos amigos!
Aos integrantes do grupo de pesquisa FISIOPAT da Unesc, em especial a Dhébora, Fran, Larissa e Gi Scaini, pois me ajudaram muito, não só nos trabalhos diários, mas nas conversas e brincadeiras do dia-a-dia... Minha segunda família!! As meninas do NEUROLAB, Amanda, Fran Mina e Bruna pela amizade, pelos desabafos e pelas boas conversas durante os experimentos.
“Se vi mais longe foi por estar de pé sobre ombros de gigantes” Isaac Newton
RESUMO
A sepse e síndrome de disfunção orgânica múltipla representam um problema clínico de alta relevância, principalmente devido a sua grande incidência em pacientes críticos e aos seus altos índices de mortalidade. Apesar de medidas terapêuticas terem sido capazes de diminuir a mortalidade, sabe-se que muitos sobreviventes de sepse não são capazes de retomar suas atividades usuais. A encefalopatia associada à sepse (EAS) é muitas vezes a primeira disfunção orgânica a se manifestar. A presença da EAS está associada a maior mortalidade e pior prognóstico e muitos pacientes apresentam dano cognitivo a médio e longo prazo que pode ser irreversível. Os mecanismos associados estao em torno do aumento de citocinas pró-inflamatórias, alterações na permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), ativação microglial com a potencializacao da liberação de citocinas e o estresse oxidativo resultando no dano neuronal. Por conseguinte, tais eventos podem ser potencializados através da participação de moléculas que, quando ativadas perpetuam a resposta inflamatória e a quebra da BHE. Sendo assim é possível postular que a molécula CD40 possa estar envolvida nesse processo inflamatório. O objetivo deste estudo foi investigar a interação entre as moléculas CD40-CD40L sob parâmetros neuroinflamatórios e comportamentais em ratos submetidos a modelo de sepse. Ratos Wistar machos foram submetidos à ligação e perfuração cecal (CLP) para indução de sepse. Os animais foram divididos em sham, CLP, CLP + 1ug/kg, 10ug/kg e 100ug/kg de anticorpo antiCD40 administrado por via intracerebroventricular. Foram acompanhados por 10 dias para curva de sobrevivência e testes comportamentais. Em outro experimento, animais foram mortos em 12, 24 e 48 horas após CLP para avaliar expressão de CD40 e CD40L por Western Blotting e 24 horas após para avaliação de dano oxidativo em lipídios (TBARS), dano às proteínas por carbonilação protéica, concentração de nitrito/nitrato (ON), mieloperoxidase (MPO), quebra da barreira hematoencefálica (BHE) e níveis de citocinas. Dados foram avaliados por teste t e análise de variância de uma via e teste post hoc Tukey. Teste de Kaplan-Meier e log-rank foram utilizados para sobrevivência e teste de Man Whitney para análise comportamental todos com significância p<0,05. Os resultados mostram que o tratamento com anti-CD40 não é capaz de interferir na sobrevivência de animais submetidos a sepse, por outro lado, apresentam melhoras na memória e aprendizado. Os resultados também apresentam aumento nos níveis de CD40 e CD40L em hipocampo, mostram que a dose de 100 ug/kg foi mais efetiva na redução da permeabilidade da BHE, níveis de citocinas e MPO. A dose de 10 e 100 ug/kg foram efetivas na diminuição de TBARS e doses de 1 e 10 e 100 ug/kg foram efetivas apenas na redução de ON. Carbonil não
mostrou resultado significativo em nenhuma dose. Conclui-se que o tratamento com anti-CD40 é eficaz na redução de dano cognitivo e parâmetros inflamatórios em sobreviventes de sepse.
ABSTRACT
Sepsis and multiple organ dysfunction syndrome represent a clinical problem of high relevance, mainly due to its high incidence in critically ill patients and their high mortality rates. Although therapeutic measures have been able to reduce the mortality, it is known that many survivors of sepsis are not able to resume their usual activities. Encephalopathy associated with sepsis (EAS) is often the first organ dysfunction to manifest. The presence of the EAS is associated with higher mortality and worse prognosis, many patients have cognitive impairment in the medium and long term that may be irreversible. Associated mechanisms station around the increase of proinflammatory cytokines, changes in the permeability of the blood brain barrier (BBB), microglial activation with potentiation of the release of cytokines and oxidative stress resulting in neuronal damage. Therefore, such events can be leveraged through the participation of molecules that when activated perpetuate the inflammatory response and breakdown of the BBB. Thus it is possible to postulate that the CD40 molecule may be involved in the inflammatory process. The aim of this study was to investigate the interaction between the CD40 - CD40L molecules in neuroinflammatory and behavioral parameters in rats submitted to sepsis model. Male Wistar rats were subjected to cecal ligation and puncture (CLP) to induce sepsis. The animals were divided into sham, CLP, CLP + 1ug/kg, 10ug/kg and 100ug/kg antibody anti-CD40 administered by intracerebroventricular route. Were followed for 10 days for survival curve and behavioral testing. In another experiment, the animals were killed at 12, 24 and 48 hours after CLP to evaluate expression of CD40 and CD40L by Western blotting, 24 hours for assessment of oxidative damage to lipids (TBARS), damage to proteins by protein carbonylation, concentration of nitrite/nitrate (NO), myeloperoxidase (MPO), breakdown of the blood brain barrier (BBB) and cytokine levels. Data were analyzed by t test and analysis of variance and Tukey post hoc test. Kaplan-Meier and log-rank test were used for survival and Man Whitney test for behavioral analysis with all significant at p< 0.05. The results show that treatment with anti-CD40 antibody is not able to affect the survival of animals with sepsis, on the other hand, show improvements in learning and memory. The results also showed increased levels of CD40 and CD40L in the hippocampus, show that dose of 100 ug/kg was more effective in reducing the permeability of the BBB, levels of cytokines and myeloperoxidase. The dose of 10 and 100 ug/kg were effective in lowering TBARS and doses of 1 and 10 and 100 ug/kg were effective only in the reduction of NO. Carbonyl not showed significant result in any
dose. Thus concluding that treatment with anti-CD40 antibody is effective in reducing cognitive impairment and inflammatory parameters in survivors of sepsis.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP1 – Proteína ativadora-1
APC – Célula Apresentadora de Antígeno
BASES - Brazilian Sepsis Epidemiological Study BHE – Barreira Hematoencefálica
C5a – Quinto Fragmento do Complemento Ativado CD40 - Cluster of Differentiation 40
CD40L - Cluster of Differentiation 40 Ligante CD154 - Cluster of Differentiation 154
CD86 - Cluster of Differentiation 86 CLP – Ligação e Perfuração Cecal DNA – Ácido Desoxirribonucleico
ERK1/2 – Extracellular Signal Regulated Kinases ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio
ERO – Espécies Reativas de Oxigênio ES – Encefalopatia Séptica
GRO-α – Oncogene Relacionada ao Crescimento-α ICAM – Moléculas de Adesão Intracelular
IFN-γ – Interferon-γ IL – Interleucina
iNOS – Óxido Nítrico Sintase Induzível IP-10 – Interferon Induzido da Proteína 10 KC – Quimiocina Derivada de Queratinócitos LCR – Líquido Céfalorraquidiano
LPS - Lipopolissacarídeo LTA – Ácido Lipoteicóico LTB4 – Leucotrieno B4
MAPK – Quinases Ativadoras Mitogênicas MCP-1 – Proteína Quimiotáxica de Monócitos - 1 MIP-1α – Proteína Inflamatória de Macrófagos 1α MIP-1β – Proteína Inflamatória de Macrófagos 1β MIP-2 - Proteína Inflamatória de Macrófagos 2 MMP – Metaloproteinases de Matriz
ON – Óxido Nítrico MPO – Mieloperoxidase
NFĸB – Fator Nuclear Kappa B
PAMPS – Padrões Moleculares Associados ao Patógeno PI3K – Fosfatidilinositol 3 Quinase
PLC-γ – Fosfolipase C-γ PPRS – Padrões de Receptores
RANTES – Regulamentado em Ativação de Células T Normal Expressa e Secretada RNAm – Ácido Ribonucléico Mensageiro
SDF-1 – Fator Derivado do Estroma da Medula Óssea SIRS – Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica SNC – Sistema Nervoso Central
STAT - Signal Transducer and Activator of Transcription TJ – Junções Tight
TLR – Receptor Toll like
TRAF – Fatores Associados ao Receptor TNF TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
UTI – Unidade de Terapia Intensiva VCAM – Moléculas de Adesão Vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 13
1.1 DEFINIÇÃO DE SEPSE E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS... 13
1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE... 14
1.3 ENCEFALOPATIA SÉPTICA... 15
1.4 BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA... 16
1.4.1 Infiltrado de neutrófilos... 16
1.5 RADICAIS LIVRES E NEUROINFLAMAÇÃO NA SEPSE... 18
1.6 CD40-CD40L... 20
1.7 MODELO ANIMAL DE SEPSE... 23
2 OBJETIVOS... 24
2.1 OBJETIVO GERAL... 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 24
3 ETAPAS METODOLÓGICAS... 25
3.1 ANIMAIS... 25
3.2 MODELO ANIMAL DE SEPSE E TRATAMENTO... 25
3.2.1 Grupos experimentais e tratamento farmacológico... 25
3.2.2 Indução de sepse... 26
3.3 ANÁLISES... 27
3.3.1 Níveis de CD40-CD40L... 27
3.3.2 Permeabilidade da barreira hematoencefálica... 27
3.3.3 Níveis de citocinas... 27
3.3.4 Concentração de nitrito e nitrato... 28
3.3.5 Atividade da mieloperoxidase... 28
3.3.6 Dano oxidativo em lipídios e proteínas... 28
3.3.7 Quantificação de proteínas... 28
3.3.8 Acompanhamento da sobrevida... 29
3.3.9 Análise Comportamental... 29
3.3.9.1 Esquiva Inibitória... 29
3.3.9.2 Habituação a Campo Aberto... 30
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 30
4 RESULTADOS... 31
5 DISCUSSÃO... 40
6 CONCLUSÃO... 45
1 INTRODUÇÃO
1.1. DEFINIÇÃO DE SEPSE E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
A sepse é uma doença caracterizada por infecção grave associada a reação inflamatória sistêmica. Diferentemente de outras doenças, pode se apresentar como distintas situações clínicas dentro de um espectro evolutivo da mesma condição fisiopatológica (VINCENT et al, 1996; ALBERTI et al, 2002; ANANNE et al, 2002, 2003; FERREIRA et al, 2002; BRUN-BUISSON et al, 2004; DELLINGER et al, 2004).
Do ponto de vista clínico, a sepse se relaciona às múltiplas possibilidades de interação entre homem e microorganismos (SIQUEIRA-BATISTA et al, 2009) distinguindo-se em situações como infecção, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), distinguindo-sepdistinguindo-se, sepse grave, choque séptico e disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (AMERICAN COLLEGE OF CHEST PHYSICIANS/SOCIETY OF CRITICAL CARE MEDICINE CONSENSUS CONFERENCE, 1992; LEVY et al, 2001; PEREZ, 2009).
Apesar do desenvolvimento tecnológico, a incidência da sepse vem aumentando nos últimos anos e a mortalidade apresentou apenas discreta redução (VINCENT et al, 1996; ALBERTI et al, 2002; ANANNE et al, 2002, 2003; FERREIRA et al, 2002; BRUN-BUISSON et al, 2004; DELLINGER et al, 2004). Por apresentar sintomas muitas vezes considerados leves, o paciente com sepse pode não ser identificado de imediato, sendo o diagnóstico referido pelo foco de infecção (por exemplo, pneumonia, infecção urinária) e, frequentemente, não são observadas as manifestações da sepse (DAVID, 2004).
A sepse tem grande relevância em termos de saúde pública. Um estudo estimou a incidência de sepse grave nos Estados Unidos em 300 casos a cada 100.000 pessoas (MAYR et al, 2012). Aproximadamente, metade desses casos ocorrem fora da UTI e 25% dos pacientes que desenvolvem sepse grave morrem durante a internação. O choque séptico é associado a uma mortalidade mais elevada, aproximando-se de 50%. (MAYR et al, 2012). A epidemiologia da sepse grave nos países em desenvolvimento pode diferir significativamente dos países desenvolvidos, o que justificam uma maior atenção em estudos futuros (MAYR et al, 2012).
No Brasil, estudos epidemiológicos sobre sepse são escassos. O estudo BASES (Estudos Brasileiros Epidemiológicos em Sepse), desenvolvido em cinco UTI’s dos estados de São Paulo e Santa Catarina, mostrou uma incidência de sepse, sepse grave e choque séptico
de 46,9%, 27,3% e 23%, respectivamente. A mortalidade nestes pacientes foi 33,9%, 46,9% e 52,2%, respectivamente (SILVA et al, 2004).
1.2. FISIOPATOLOGIA DA SEPSE
A fisiopatologia da sepse está relacionada com uma interação complexa entre o hospedeiro e o microorganismo infectante. Os mecanismos de reconhecimento específico, componentes da resposta inata, têm sido caracterizados como uma via de controle da imunidade adquirida. Esses mecanismos são deflagrados por receptores de membrana celular que, por sua vez, são ativados com o reconhecimento do microorganismo através de estruturas conservadas, constitutivamente expressas na superfície dos patógenos, denominadas padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) (CINEL E DELLINGER, 2007). Assim, os fatores desencadeadores da ativação celular e da cascata de eventos plasmáticos são principalmente os componentes da parede celular dos microorganismos, como o ácido lipoteicóico (LTA) e peptideoglicanos, derivados de bactérias Gram-positivas (exotoxinas), ou lipopolissacarídeos (LPS), no caso de bactérias Gram-negativas (endotoxinas) (TRIANTAFILOU E TRIANTAFILOU, 2002).
O LPS e as exotoxinas são liberados normalmente durante a replicação da bactéria e/ou como consequência de sua morte, devido a lise da parede celular. Diversos receptores foram encontrados nos últimos anos, capazes de reconhecer essas moléculas e ativar a resposta imune inata (TRIANTAFILOU E TRIANTAFILOU, 2002). Dessa forma os PAMPs são reconhecidos por receptores encontrados em células do sistema imune inato, como neutrófilos polimorfonucleares, macrófagos e células dendríticas. Esses receptores são denominados de receptores de reconhecimento de padrões (PPRs). Entre os membros mais importantes dos PPRs destacam-se os receptores Toll-like (TLRs). Tais receptores são uma família de receptores transmembrana do tipo 1, codificados em linhagem germinativa e não clonais, que são caracterizados por domínios extracelulares repetitivos ricos em leucina e um domínio citoplasmático homólogo ao receptor de interleucina-1 (IL-1) (WEIGHARDT E HOLZMANN, 2007).
De um modo geral, após a interação entre PAMPs-PPRs ocorre ativação da resposta imune inata com a finalidade de coordenar uma resposta defensiva envolvendo componentes humorais e celulares. Nesse contexto, com tal interação, células residentes têm papel chave, liberando uma grande variedade de moléculas sinalizadoras como prostaglandinas, leucotrienos, citocinas e quimiocinas que desencadeiam a resposta
inflamatória, culminando no recrutamento e ativação de leucócitos para o local da infecção, representando uma das funções mais importantes da imunidade inata (JANEWAY, 2001; 2002). No entanto, a interação de vários componentes infecciosos, imunológicos, endócrinos, hemodinâmicos, cardiovasculares e até mesmo genéticos (DE MAIO, 2005; REMICK, 2007), podem levar a uma resposta exacerbada do organismo com produção de vários mediadores
inflamatórios e consequentes alterações fisiológicas (ANNANE; BELLISSANT;
CAVAILLON, 2005; ROCHA; OLIVEIRA; FARIAS- CORRÊA, 2006).
1.3 ENCEFALOPATIA SÉPTICA
Diversos estudos mostram que sobreviventes de UTIs que apresentaram sepse apresentam incapacidade cognitiva a longo prazo, incluindo alterações na memória, atenção e concentração (GORDON et al, 2004; GRANJA et al, 2004; HOPKINS et al, 2005; HOUGH e CURTIS 2005; JACKSON et al, 2004).
Cerca de 71% dos pacientes sépticos desenvolvem irreversíveis disfunções cerebrais agudas (PINE et al, 1983; SPRUNG et al, 1990; WILSON E YOUNG, 2003). Esta encefalopatia induzida pela sepse é causada pela inflamação sistêmica na ausência de infecção cerebral direta e caracterizada clinicamente por desaceleração dos processos mentais, atenção prejudicada, delírios, desorientação ou coma. Encefalopatia séptica (ES) é um sinal precoce da sepse e está associada ao aumento da taxa de morbidade e mortalidade (SPRUNG et al, 1990). Um estudo realizado entre 2008 a 2011 na China mostrou uma incidência de 17,7% de pacientes com sepse que tinham encefalopatia associada (ZHANG et al, 2010).
É improvável que a patogênese da ES esteja relacionada apenas a toxinas patogênicas, pois pode estar relacionada também a SIRS, onde não possuem uma etiologia infecciosa como pancreatite aguda ou queimaduras (WILSON E YOUNG, 2003). Estudos clínicos e experimentais sugerem que um número de fatores, incluindo a geração local de citocinas pró-inflamatórias, microcirculação cerebral comprometida, desequilíbrio de neurotransmissores e falência orgânica periférica contribuem para o desenvolvimento da ES (MACEDO et al., 2013; RITTER et al., 2012; CRUZ et al., 2012). Além disso, uma vez que a inflamação persistir, a excitoxicidade e o estresse oxidativo pode agravar ainda mais a ES e contribuir para disfunção e degeneração neuronal (WILSON E YOUNG, 2003). É notável que pacientes com uma patologia pré-existente no sistema nervoso central (SNC) apresentam maiores riscos de desenvolver ES, uma interação semelhante foi relatada em modelos animais de sepse (PICKERING; CUMISKEY E O'CONNOR, 2005).
1.4 BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA
A barreira hematoencefálica (BHE) é um sistema complexo celular dinâmico que separa o SNC da corrente sanguínea. Ela exibe um fenótipo único, caracterizada pela presença de células endoteliais que são conectados por um complexo de adesão intercelular. Sua principal função é controlar a troca de células e moléculas da corrente sanguínea e SNC (ENGELHARDT, 2008; ABBOTT et al, 2010; PALMER, 2010).
Atualmente sabe-se que perante situações de trauma e/ou infecção o encéfalo é capaz de “preparar” uma resposta inflamatória baseada em ativação microglial, invasão local de células imunitárias circulantes e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), de moduladores inflamatórios e de outros fatores imunológicos (TANSEY; MCCOY E FRANK-CANNON, 2007). Em situações agudas, os mecanismos inflamatórios limitam a lesão e a BHE é capaz de modular a sua estrutura no sentido de aumentar a permeabilidade endotelial mantendo a integridade estrutural, o que permite proteger o encéfalo e manter a homeostase, no entanto, quando a neuroinflamação é sustentada crônicamente a níveis elevados, as junções presentes na BHE dissociam-se entre si, ocorrendo a formação de edema e lesão encefálica (TANSEY; MCCOY E FRANK-CANNON, 2007).
Em patologias neurológicas, como na sepse, onde há presença de componentes inflamatórios, ocorre no local da infecção, a produção e liberação rápida de agentes inflamatórios como citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e metaloproteinases de matriz (MMPs), sob a forma de resposta inflamatória (KUSTOVA et al,1999; BRASNJEVIC et al, 2009; DAL PIZZOL et al, 2013).
1.4.1 Infiltrado de Neutróflios
O recrutamento leucocitário para o local de injúria celular é uma das etapas essenciais da defesa do organismo contra um agente agressor (GALLIN E SNYDERMAN, 1999). Nos estágios iniciais de variados processos infecciosos, incluindo infecções por fungos, vírus e bactérias, o leucócito predominante é o neutrófilo, permanecendo em geral de 12 a 24 horas no local da injúria. Após esse período, o neutrófilo inicia um processo de morte programada sendo em seguida fagocitado por macrófagos (GALLIN E SNYDERMAN, 1999).
A migração de neutrófilos durante a resposta inflamatória resulta principalmente da liberação, por células residentes de fatores quimiotáxicos. A transmigração endotelial de leucócitos resulta de uma sequência de eventos e envolve um conjunto complexo de moléculas de adesão situadas na superfície dos leucócitos e das células vasculares endoteliais. O processo de migração inclui as seguintes fases: rolamento, adesão e transmigração como mostra a Figura 1.
Fig 1: Rolamento, adesão e migração de neutrófilos para o foco infeccioso. Fonte: Adaptado de Ley et al., 2007.
Na fase de rolamento os leucócitos estabelecem uma interação fraca e de baixa afinidade com a parede endotelial através da ação das selectinas e dos seus ligantes (carboidratos presentes nos leucócitos). A baixa afinidade desta interação combinada com a força do fluxo sanguíneo resulta em um rolamento dos leucócitos sobre as células endoteliais. Subsequentemente, os leucócitos produzem citocinas de ação local, como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a IL-1β, que iniciam um feedback positivo na produção de citocinas e induzem um aumento de expressão de moléculas de adesão intercelular (ICAM) e vascular (VCAM) na superfície endotelial (COOK-MILLS, 2002; BARREIRO E SANCHEZ-MADRID, 2009; WITTCHEN, 2009).
A ligação das citocinas aos leucócitos resulta na ativação de integrinas que iniciam a cascata de adesão. A elevada afinidade das integrinas α4β1, αLβ2 e αMβ2 com as moléculas de adesão produzidas pelas células endoteliais resultam em uma adesão firme ao endotélio (COOK-MILLS, 2002; BARREIRO E SANCHEZ-MADRID, 2009; WITTCHEN,
2009). Nesta fase, salientam-se as interações ICAM-1 e VCAM-1 (GREENWOOD et al, 1995; BROCKE et al, 1999; LASCHINGER E ENGELHARDT, 2000; CARMAN et al, 2003; ENGELHARDT, 2008; WEISS et al, 2009).
A adesão ao endotélio, através de mecanismos de transdução intracelular, regula profundamente uma grande variedade de processos bioquímicos ao nível dos leucócitos, incluindo fosforilação de proteínas, modificações do citoesqueleto e regulação genética, que culminarão na transmigração endotelial dos leucócitos (ETIENNE et al, 1998; ETIENNE-MANNEVILLE et al, 2000). Na fase de transmigração destaca-se a ação das moléculas ICAM-1 e αLβ2 (GREENWOOD et al, 1995; BROCKE et al, 1999; LASCHINGER E ENGELHARDT, 2000; CARMAN et al, 2003; ENGELHARDT, 2008; WEISS et al, 2009).
Durante as fases iniciais da disfunção cerebral, alterações da BHE foram encontradas em um modelo animal de sepse (NISHIOKU T et al, 2009), estas alterações potencialmente causam a infiltração de células inflamatórias expondo o cérebro a toxinas. No decurso da sepse, leucócitos são ativados, aderem ao vaso sanguíneo e movem-se para dentro do cérebro (RANSOHOFF; LIU E CARDONA, 2007). Assim, supõe-se que, durante a sepse, a produção exacerbada de citocinas e quimiocinas alteram as estruturas cerebrais e consequentemente aumentam a permeabilidade da BHE levando a um aumento do fluxo de células inflamatórias e mediadores tóxicos para o cérebro contribuindo para a lesão neuronal (COMIM et al, 2011).
1.5 RADICAIS LIVRES E NEUROINFLAMAÇÃO NA SEPSE
O termo radical livre é usado para designar qualquer átomo ou molécula com existência independente, contendo um ou mais elétrons não pareados nos orbitais externos. Isto determina uma atração para um campo magnético podendo torná-lo altamente reativo e capaz de reagir com qualquer composto situado próximo à sua órbita externa, passando a ter uma função oxidante ou redutora de elétrons (SHAMI et al, 2004).
Os radicais livres são produzidos continuamente durante os processos metabólicos e atuam como mediadores para a transferência de elétrons em várias reações bioquímicas, desempenhando funções relevantes no metabolismo. As principais fontes de radicais livres são as organelas citoplasmáticas que metabolizam o oxigênio, o nitrogênio e o cloro, gerando grande quantidade de metabólitos (SHAMI et al, 2004).
A produção de ERO e de nitrogênio (ERN) é parte integrante do metabolismo humano e é observada em diversas condições fisiológicas. ERO e ERN têm importante função
biológica, como na fagocitose, fenômeno em que essas espécies são produzidas para eliminar o agente agressor. Por outro lado, quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio (VASCONCELOS et al, 2007).
A cadeia transportadora de elétrons mitocondrial representa uma das principais
fontes celulares de EROs, tais como o superóxido (O2¯) e o peróxido de hidrogênio (H2O2)
proporcionando uma geração contínua desses agentes tóxicos. Está bem estabelecido que uma
pequena parte do O2 consumido pela cadeia transportadora de elétrons é desviada para gerar
EROs, particularmente nos complexos I (CADENAS et al, 1977; TURRENS et al, 1980) e III (BOVERIS et al, 1976; CADENAS et al, 1977; CADENAS et al, 2000).
O estresse oxidativo é resultante da produção exacerbada de EROs juntamente quando os mecanismos de proteção antioxidante não são suficientes para controlar essa produção levando ao dano a biomoléculas lipídicas, proteínas e DNA. Sabe-se que o estresse oxidativo é um dos vários e mais importantes mecanismos envolvidos na fisiopatologia da sepse (CASSOL et al, 2010) e o SNC está sujeito aos danos causados pelas EROs devido o
alto consumo de O2 e o baixo nível de defesas antioxidantes (FLOYD, 1990).
A geração maciça de ERO durante a sepse compromete as funções, bem como a sobrevivência da célula, especificamente agindo sobre a mitocôndria e alterando a fosforilação oxidativa por meio da inibição dos complexos enzimáticos, gerando mais ERO e tendo como desfecho final a diminuição da produção energética mitocondrial, que por fim culmina com morte celular e dano cerebral (CASSOL et al, 2010).
Para melhor compreender o estresse oxidativo é essencial aprofundar os conhecimentos sobre expressão gênica (MONTERA, 2007). Nas células existem fatores de transcrição gênica sensíveis a sinais extracelulares e/ou modificações no meio interno capazes de regular a expressão dos genes, gerando respostas aos estímulos. Dentre estes fatores estão o NFkB (fator nuclear Kappa B) e a 1 (proteína ativadora 1) (MONTERA, 2007). A AP-1 é importante na regulação da resposta gênica aguda, pois se liga a uma variedade de genes, promovendo, dentre outros efeitos, proliferação celular (MONTERA, 2007). O NFkB tem papel essencial na expressão de genes responsivos a estresse, incluindo aqueles com código para citocinas pró-inflamatórias e os envolvidos na modulação da sensibilidade celular à injúria oxidativa (HADDAD, 2002). Esses fatores de transcrição encontram-se inativos no citoplasma celular. Na presença de estímulos indutores, eles são ativados e translocam-se para o núcleo, onde se ligam a genes específicos que serão ativados. Dentre estes genes encontram-se os responsáveis pela produção de citocinas e fatores de crescimento, receptores de
citocinas, proteínas de estresse, moléculas de adesão e imunomoduladoras (RAUHMAN E MACNEE, 2000; JASSEN-HEINIGER; POYNTER E BAEURLE, 2000).
Os fatores de transcrição podem ser modulados por estresse oxidativo, estados redox e agentes inflamatórios e antiinflamatórios (MONTERA, 2007). O estresse oxidativo, via sinalização dos fatores de transcrição e lesão celular, gera modificações gênicas no núcleo das células, agindo como um potente indutor da resposta inflamatória por alterar a síntese de citocinas, prostaglandinas, leucotrienos, moléculas de adesão e quimiocinas (MONTERA, 2007). Já foi demonstrado que uma gama de antioxidantes capazes de detoxificar EROS e ERN podem bloquear a ativação de NFkB, reforçando a hipótese que os oxidantes apresentam papel chave na regulação de fatores de transcrição (RAUHMAN E MACNEE, 2000; HADDAD, 2002).
Com a ativação do NFkB, as citocinas inflamatórias podem estimular a óxido-nítrico sintetase-indutível (iNOS) e aumentar muito a produção de óxido óxido-nítrico (NO) (MONTERA, 2007).
1.6 Interação CD40-CD40L
CD40 é uma glicoproteína transmembrana tipo I composta por 277 aminoácidos, pesando aproximadamente 48 KDa e é classificada como pertencente a superfamília dos receptores TNF (VAN KOOTEN E BANCHEREAU, 2000; SCHONBECK E LIBBY, 2001). O ligante da molécula CD40, também chamado CD154, é um polipeptídeo de 261 aminoácidos e também faz parte da superfamília TNF, está presente em linfócitos T e B, basófilos, eosinófilos, monócitos/macrófagos, células dendríticas, epiteliais e endoteliais (SCHONBECK E LIBBY, 2001).
O receptor de membrana CD40 foi identificado primeiramente em linfócitos B, como parte de um sistema de co-estimulação da ativação dessas células. Sabe-se também que ele é expresso em monócitos/macrófagos, micróglia, células dendríticas, células endoteliais, células musculares lisas vasculares, fibroblastos e células epiteliais (VAN KOOTEN E BANCHEREAU, 2000; SCHONBECK E LIBBY, 2001).
Diversos estudos mostram a importância do LPS como fator desencadeador da sepse e ativador de micróglia com reprodução de alterações hemodinâmicas observadas em pacientes com sepse e em modelos experimentais, sendo provavelmente a estrutura com maior atividade imunoestimulatória entre os componentes de bactérias, incluindo a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, TNF-α, IL-12 e substâncias inflamatórias efetoras
como o ON (SUFRADINI et al, 1989). Benveniste et al (2004) tem demonstrado que em cultura primária de micróglia, CD40 é fortemente induzível por LPS entre 4 a 8 horas, seguido por expressão da proteína CD40 (Figura 2).
Figura 2: Via CD40-CD40L. Adaptado de Chen et al., 2006.
A interação entre a molécula CD40 e seu ligante desencadeia respostas específicas nas células onde esta ocorre, sendo comum exibirem a capacidade de ativar uma sinalização pró-inflamatória (VAN KOOTEN E BANCHEREAU, 2000). A via CD40/CD40L, induz a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, e TNF-α), expressão de quimiocinas, metaloproteinases de matriz extra-celular, óxido nítrico sintase além de marcadores de superfície envolvidos na co-ativação de linfócitos (CD86) (Figura 2). Em células da parede vascular, leva a expressão de moléculas de adesão (VCAM-1, E-selectina e CD54), citocinas e enzimas (VAN KOOTEN E BANCHEREAU, 2000; SCHONBECK E LIBBY, 2001).
A via de sinalização CD40/CD40L é um importante efetor da resposta inflamatória, graças a capacidade de ativação da resposta imune adaptativa, seja estimulando a produção de linfócitos e a produção de anticorpos, seja pela produção aumentada de citocinas pelas APC (OXER, 2008). Embora o CD40 não tenha atividade de quinase, sua
ligação leva a ativação de várias quinases e a produção de segundos mensageiros. Após a ligação, sua porção intracitoplasmática interage com os fatores associados ao receptor de TNF (TRAFs), que atuam como proteínas adaptadoras que promovem o recrutamento de moléculas de sinalização para um complexo (BISHOP E HOSTAGER, 2001; TAN; TOWN E MULLAN, 2002). A família TRAF consiste em 6 membros, dos quais 2, 3, e 6 se ligam diretamente à cauda citoplasmática de CD40 através dos seus domínios C-terminais. TRAF1 e TRAF5 podem interagir com o CD40 indiretamente, através da formação de heterooligômeros com TRAF2 e TRAF3. Estes adaptadores de CD40 ligam-se as múltiplas vias que incluem fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), fosfolipase Cy (PLC-γ), quinases ativadoras mitogênicas (MAPKs), e NF-kB (BISHOP E HOSTAGER, 2001; TAN; TOWN E MULLAN, 2002).
Desta maneira, além da resposta inflamatória causada por LPS, os sinais provenientes da ativação do CD40 são traduzidos na ativação de fatores de transcrição, que promovem a ativação de genes específicos (CHEN et al, 2006). NF-kB induz a ativação de vias inflamatórias, por meio da produção de uma grande variedade de citocinas, moléculas de adesão, metaloproteinases e fatores de crescimento, parecendo ser o fator mais importante da transcrição ativada pela via de sinalização CD40-CD40L (LUTGENS et al, 2007) embora também ocorra a ativação dos fatores STAT-1 (VAN KOOTEN E BANCHEREAU, 2000).
A transdução de sinal mediada por CD40 tem um papel destaque em processos fisiológicos e patológicos (CHEN et al, 2006). A modulação da sinalização do receptor CD40 poderia ser um importante alvo terapêutico em doenças inflamatórias como na sepse, já que inibiria a síntese de proteína ativa e a liberação de citocinas e quimiocinas que culminam na resposta inflamatória agravando o quadro clínico de pacientes sépticos (CHEN et al, 2006).
1.7 MODELO ANIMAL DE SEPSE
Em sepse, sabe-se que em humanos é uma síndrome complexa e terapeuticamente desafiadora, na qual diversos sistemas orgânicos estão interligados e desequilibrados (DEITCH, 2005; HUBBARD et al, 2005; ROCHA et al, 2006; RITTIRSCH et al, 2007).
Vários modelos experimentais têm sido desenvolvidos para os estudos dos aspectos fisiopatológicos e das consequências sistêmicas da sepse, assim como para a investigação de agentes potencialmente terapêuticos e seus mecanismos de ação. Deve-se utilizar um modelo animal que reproduza a vasodilatação, hipotensão, aumento no débito cardíaco, resposta ao tratamento e mortalidade vistos em pacientes sépticos. Tem-se utilizado
o modelo de sepse abdominal, sepse cutânea ou sepse induzida por administração de LPS (DEITCH, 2005; HUBBARD et al, 2005; ROCHA et al, 2006; RITTIRSCH et al, 2007).
O método CLP baseia-se na ligação do ceco logo abaixo da valva íleo cecal, perfuração do ceco com tamanho padronizado e liberação do conteúdo fecal para a cavidade peritoneal (WICHTERMAN et al, 1980).
O método representa vantagens como simplicidade, reprodutibilidade e possibilidade de controlar o grau de contaminação bacteriana na cavidade peritoneal, e consequentemente, a mortalidade, pela mudança do tamanho da agulha e/ou número de perfurações realizadas no ceco (DEITCH, 2005; HUBBARD et al, 2005; ROCHA et al, 2006; RITTIRSCH et al, 2007). A padronização do procedimento de indução de sepse polimicrobiana por CLP tem relevante importância na consistência e reprodutibilidade dos resultados.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a interação entre as moléculas CD40-CD40L sob parâmetros neuroinflamatórios e comportamentais em ratos submetidos a modelo de sepse.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Acompanhar a sobrevida de animais submetidos a sepse sob administração de
anti-CD40.
Quantificar os níveis de CD40 e CD40L no hipocampo 12, 24 e 48 horas após
indução de sepse em ratos;
Avaliar a integridade da BHE no hipocampo 24 horas após indução de sepse
em ratos sob administração de anticorpo anti-CD40;
Avaliar os níveis de TNF-α, IL-6 e IL-1β no hipocampo 24 horas após indução
de sepse em ratos sob administração de anticorpo anti-CD40;
Quantificar a atividade da mieloperoxidase, concentração de nitrito/nitrato e o
dano oxidativo em lipídios e proteínas no hipocampo 24 horas após indução de sepse em ratos sob administração de anticorpo anti-CD40;
Avaliar aprendizado e memória por testes comportamentais 10 dias após a
3 ETAPAS METODOLÓGICAS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos com 60 dias de vida, pesando entre 200-300g, fornecidos pelo Biotério da Universidade do Vale do Itajaí. Os ratos foram mantidos em ciclos de claro-escuro de ±12 horas a uma temperatura de 24±1°C. Os animais tiveram livre acesso à água e alimento. A utilização dos animais seguiu um protocolo experimental aprovado pela Comissão de Ética de Uso em Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina de número 12.025.4.03.IV.
3.2 MODELO ANIMAL DE SEPSE E TRATAMENTO
3.2.1 Grupos experimentais e tratamento farmacológico
Os animais foram divididos na primeira parte do experimento em dois grupos (n=6): sham e CLP onde foram mortos 12, 24 e 48h após a cirurgia de indução de sepse para determinação dos níveis de CD40 e CD40L no hipocampo. A segunda parte do experimento consistiu na divisão dos animais em sham + salina, CLP + salina, CLP + anti-CD40 1ug/kg, CLP + anti-CD40 10ug/kg e CLP + anti-CD40 100ug/kg (n=6), onde salina ou anti-CD40 (ABCAM®) foram administrados por via intracerebroventricular na cisterna magna com o auxílio de um aparato estereotáxico imediatamente após a indução de sepse e foram mortos por decapitação 24 horas apos a sepse sendo retirado o hipocampo para as análises neuroquimicas e de quebra da barreira hematoencefálica. Outra parte experimental foi realizada para avaliação comportamental e para acompanhamento da sobrevida de animais sham + salina, CLP + salina e CLP + 100ug/kg (n=20 por grupo). Esse acompanhamento de estendeu por 10 dias, contando como primeiro dia, 24 h após a cirurgia. Esquema simplificando a metodologia do trabalho proposto:
Fig. 3: Metodologia do estudo proposto. Fonte: do autor, 2014.
3.2.2. Indução de sepse
Sepse intra-abdominal foi produzida usando a técnica CLP (FINK E HEARD, 1990). Os ratos foram anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg), e submetidos à laparotomia com incisão mediana abdominal. O ceco foi ligado abaixo da junção íleo-cecal com fio seda 3-0 e perfurado com uma agulha número 14, gentilmente comprimido até a extrusão de conteúdo fecal. Os planos cirúrgicos foram fechados e os ratos observados por 2 horas. Todos os grupos receberam suporte básico (salina 50 mL/kg imediatamente e 12 horas após CLP e ceftriaxona (30 mg/kg) e clindamicina (25 mg/kg) a cada 6 horas). Como controle utilizamos animais submetidos a laparotomia, sem ligação ou perfuração (sham). variando com o experimento, os animais foram, mortos por decapitação com guilhotina 12, 24, 48h e 10 dias após a cirurgia. A caixa craniana foi aberta e o seu conteúdo retirado e, a partir de então, mantido sobre uma placa de vidro a aproximadamente 0ºC. O bulbo olfatório e o tronco cerebral foram desprezados. O hipocampo foi limpo para posteriores análises, sendo retirado o excesso de sangue dos vasos externos e a substância branca das vias descendentes.
Metodologia
Sham CLP Sham + salina CLP + salina CLP + 1 ug/kg CLP + 10 ug/kg CLP + 100 ug/kg Sham + salina CLP + salina CLP + 100ug/kg Sham + salina CLP + salina CLP + 100ug/kg Testes comportamentais (10 dias) Avaliação da sobrevida (10 dias) Avaliação de EO; Citocinas, Quebra da BHE, MPO e nitrito nitrato (24h) Níveis proteícos de CD40 e CD40L por Western Blotting (12, 24 e 48 h)3.3 ANÁLISES
3.3.1. Níveis de CD40-CD40L
Os níveis protéicos de CD40 e CD40L foram mensurados por Western blotting utilizando anticorpos específicos (ABCAM®). Para executá-lo as amostras foram homogeneizadas em tampão Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1% (w/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10% (v/v) de glicerol) e quantidades iguais de proteína (100 ug/poço) foram fracionados por eletroforese em gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose. A eficiência da eletrotransferência foi verificada por meio de coloração Ponceau S, e a membrana foi bloqueada em Tampão Tween-Tris salina (TTBS: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 contendo 0,9% de NaCl e 0,1% de Tween 20) com 5% de albumina. As membranas foram incubadas
overnight a 4°C com anticorpo policlonal de coelho anti-CD40 (1:1000) e anti-CD40L
(1:1000). Anticorpo secundário Anti-IgG de coelho foi incubado com as membranas durante 2 horas (1:10000), a membrana foi lavada novamente com TTBS, e a imunorreatividade foi detectada por quimioluminescência amplificada utilizando ECL. A análise densitométrica dos filmes foi realizada com o software Image J® v.1.34. Todos os resultados foram expressos como uma razão relativa entre CD40, CD40L e o imunoconteúdo de proteína β-actina.
3.3.2. Permeabilidade da barreira hematoencefálica
A avaliação quantitativa da ruptura da BHE foi avaliada 24h após a cirurgia e seguiu a técnica de extravasamento de azul de evans descrita por Uyama et al. (1988). Uma solução de azul de evans (2%) foi administrada via intravenosa em ratos sépticos, foram aguardados 45 minutos para a solução percorrer todos os microvasos e após foi removido o corante intravascular por perfusão cardíaca com solução salina durante 20 minutos. Após a reperfusão o hipocampo foi removido. A unidade de medida utilizada foi de ng/mg/tecido.
3.3.3. Níveis de citocinas
As concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram determinadas através da técnica de ELISA em leitor de microplacas com a utilização de kit comercial (Peprotech). A unidade de medida utilizada foi de pg/ml.
3.3.4. Concentração de nitrito/nitrato
A concentração de nitrito/nitrato é um indicativo da quantidade de ON presente nas amostras. A concentração foi mensurada pela reação de Griess, lendo em absorbância de 550 nm usando leitor de microplaca. Resultados foram expressos como nmol/mg proteína (GREEN et al, 1982)
3.3.5. Atividade da mieloperoxidase
A atividade da mieloperoxidase (MPO) é um indicativo do infiltrado de neutrofilos tecidual. Nesse sentido, o tecido foi homogeneizado (50 mg/ml) em 0.5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio e centrifugado. A suspensão foi sonicada e alíquota do
sobrenadante foi misturada com solução de 1.6 mM TMB e 1 mM H2O2. A atividade da
MPO foi mensurada espectrofotometricamente em 650nm a 37oC. Os resultados foram
expressos como mU/mg proteína (DE YOUNG et al., 1989).
3.3.6. Dano oxidativo em lipídios e proteínas
A formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) durante uma reação ácido-aquecimento é amplamente adotado como um método sensível para a medição da peroxidação lipídica. Resumidamente, as amostras foram misturadas com 1 ml de ácido tricloroacético a 10% e 1 ml de 0,67% TBA. Posteriormente, estes foram aquecidos em banho de água fervente durante 30 min. Equivalentes ao malondialdeído (MDA) foram determinados por absorbância a 532 nm, utilizando 1,1,3,3-tetrametoxipropano como padrão externo. Os resultados foram expressos em equivalentes de MDA (nmol / mg de proteína) (DRAPER E HADLEY, 1990).
O dano oxidativo as proteínas foi avaliado por meio da determinação de grupamentos carbonil do conteúdo da amostra, com base na reação com dinitrofenilhidrazina (DNPH). Resumidamente, as proteínas foram precipitadas por adição de ácido tricloroacético a 20% e dissolveu-se novamente em DNPH. A unidade de medida foi nmol/mg protein e a absorbância foi 370 nm (LEVINE et al, 1990).
A quantidade total de proteínas de cada técnica foi medido usando o ensaio de proteína de Lowry. Reagente fenol de Folin foi adicionado a amostras de tecido, sua principal função é ligar-se a proteínas, onde ele é posteriormente reduzido. A alteração de cor resultante a partir de amarelo para azul pode ser seguido através da medição da absorbância a 700 nm. Albumina de soro bovino foi utilizada como padrão de proteinas (LOWRY et al, 1951).
3.3.8. Avaliação da sobrevida
Na avaliação da sobrevida, 10 animais de cada grupo foram observados diariamente durante 10 dias após indução de sepse para verificar a taxa de mortalidade.
3.3.9. Análise comportamental
O aprendizado e a memória foram avaliados em tarefa específica de esquiva inibitória e a memória de habituação testado em Habituação ao Campo Aberto (Open-Field) 10 dias após indução de sepse. O procedimento de teste comportamental foi conduzido entre 13:00 e 16:00 horas em sala isolada de som, utilizando animais diferentes para cada teste comportamental. Todos os testes foram realizados por pessoas que desconheciam o experimento e/ou grupo experimental.
3.3.9.1. Esquiva Inibitória
O equipamento para realização desse teste consiste em uma caixa de acrílico na qual o piso é formado por barras paralelas de metal (1mm de diâmetro). Os espaços entre as barras medem 1 cm. Uma plataforma com 7 cm de largura e 2,5 cm de comprimento é colocada junto à parede esquerda do aparelho (ROESLER et al, 1999). Na sessão de treino, os animais foram colocados sobre a plataforma e mediu-se o tempo que o animal levou para descer com as quatro patas da plataforma. Imediatamente após descer da plataforma (com as 4 patas), o animal recebeu um choque de 0,4 mA durante 2 segundos. Na sessão de teste, o animal foi novamente colocado na plataforma e medido o tempo que ele levou para descer, porém não foi administrado choque. A latência é um parâmetro clássico de retenção de memória. Os intervalos entre o treino e o teste foram 1,5 horas para medir memória de curta duração (QUEVEDO et al, 1997) e 24 horas para memória de longa duração (IZQUIERDO et al, 1998).
3.3.9.2 Habituação a Campo Aberto
O procedimento foi realizado em um campo aberto de 40 x 60 cm delimitado por 4 paredes com 50 cm de altura, sendo três de madeira e uma de vidro transparente. O piso do campo aberto é dividido em 12 quadrados iguais marcados por linhas pretas. Na sessão de treino, os animais foram cuidadosamente colocados no quadrado do canto posterior esquerdo do aparelho, a partir do qual explorou livremente o ambiente por 5 minutos. Imediatamente após, os animais voltaram para a caixa moradia. A sessão de teste foi realizada 24 horas após o treino, na qual se repete o procedimento do treino. Os números de cruzamentos através das linhas pretas e o número de “rearings” foram avaliados em ambas sessões (VIANNA et al, 2000).
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As variáveis contínuas foram apresentadas na forma de média ± desvio padrão ou de mediana (intervalo interquartil) e comparadas com o teste t-Student, teste U de Mann-Whitney e análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey quando o F foi significativo ou Kruskal-Willis seguido pelo teste de Mann-Whitney, quando necessário. As diferenças entre treino e teste foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon. Correlações entre as variáveis estudadas foram determinadas pelo teste de Pearson. Todos os testes foram feitos no programa SPSS versão 20. Em todas as análises foi adotado como nível para significância estatística um p-valor < 0,05.
4 RESULTADOS
4.1. Níveis de CD40-CD40L
Os níveis protéicos de CD40 e CD40L foram mensurados através de Western Blotting em animais submetidos a sepse por CLP ou sham em 12, 24 e 48 horas. As figuras 4A, 4B e 4C mostram respectivamente que animais submetidos a CLP apresentam níveis aumentados de CD40 e CD40L em hipocampo em todos os tempos quando comparados ao grupo sham. O aumento dos níveis de CD40 e CD40L indicam que sepse leva a ativação da via CD40-CD40L potencializando o dano cerebral.
Figura 4A: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (12 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
Figura 4B: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (24 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
Figura 4C: Níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP (48 horas). n=5. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.2 Permeabilidade da barreira hematoencefálica
A Figura 5 representa os resultados de permeabilidade da BHE pela técnica de extravasamento de azul de evans 24 horas após sepse ou sham. Nossos resultados indicam um aumento da permeabilidade da BHE no hipocampo de animais submetidos a sepse (CLP+salina) quando comparados ao grupo sham. A avaliação após administração de
anti-CD40 nas doses de 10 e 100 ug/kg em ratos submetidos a sepse mostra diminuição da permeabilidade da BHE quando comparado o grupo CLP + salina.
Figura 5: Avaliação de quebra de BHE em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou Não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
4.3 Níveis de citocinas
A avaliação dos níveis de citocinas TNFα, IL-1β e IL-6 pela técnica ELISA revelam aumento dos niveis dessas moléculas no hipocampo 24 horas apos os animais serem submetidos a CLP (Fig 6A, B e C respectivamente). A administração de anti-CD40 na dose de 100 ug/Kg resulta em significante diminuição nos níveis de TNFα, IL-1β e IL-6 em relação a CLP+salina, enquanto a dose de 10 ug/kg foi efetiva apenas na redução dos níveis de TNFα em hipocampo de ratos submetidos a sepse.
Figura 6A: Níveis de TNFα em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
Figura 6B: de IL-1β em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina considerando p<0,05.
Figura 6C: Níveis de IL-6 em hipocampo de animais submetidos a sham ou CLP e tratados ou não com anti-CD40 nas doses de 1, 10 e 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg; $ Significativo em relação a CLP + anti-CD40 10 ug/kg considerando p<0,05.
4.4 Estresse oxidativo: TBARS e Carbonilação de proteínas
A figura 7A apresenta os resultados de TBARS, como um indicativo de dano oxidativo em lipídios. Nossos resultados mostram que animais submetidos a sepse apresentam maior dano em lipídios no hipocampo que animais submetidos a sham, porém, o tratamento com anti-CD40 na dose de 100 ug/kg reduziu a peroxidação lipídica nessa estrutura cerebral.
A figura 7B mostra os resultados de carbonilação de proteínas. No presente estudo verificamos um aumento da carbonilação protéica em animais submetidos a sepse (CLP+salina) em relação a sham e o tratamento com anti-CD40 não apresentou efeito de redução de dano em nenhuma dose testada.
Figura 7A: Dano em lipídeos em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg; $ Significativo em relação a CLP + anti-CD40 10 ug/kg considerando p<0,05.
Figura 7B: Dano em proteínas em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.5 Avaliação da concentração de nitrito/nitrato
A figura 8 apresenta os resultados da concentracao de nitrito/nitrato como indicativo de formação de ON no hipocampo de ratos submetidos ou não a sepse e tratados com anti-CD40. Verificamos que houve um aumento significativo na concentracao de nitrito/nitrato no hipocampo de ratos submetidos a CLP + salina em relação a sham e quando foi administrado
anticorpo anti-CD40, as três doses foram efetivas na redução dos niveis de nitrito/nitrato em relação a CLP+salina.
Figura 8: Concentração de ON em hipocampo de ratos submetidos a sham ou CLP e tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina considerando p<0,05.
4.6 Atividade da mieloperoxidase
A resposta inflamatória pode ser avaliada pela quantidade de infiltrado de neutrófilos e para isso utiliza-se a técnica de atividade da MPO. No presente estudo foi observado um aumento do infiltrado de neutrófilos no hipocampo de animais submetidos a sepse (CLP+salina) e o tratamento com anti-CD40 nas doses de 10 e 100 ug/kg foi capaz de reverter esses níveis (Fig 9).
Figura 9: Atividade da MPO em hipocampo de ratos submetidos a sham e CLP tratados com anti-CD40 nas doses de 1, 10 ou 100 ug/kg. * Significativo em relação a Sham; # Significativo em relação a CLP + salina; & Significativo em relação a 1 ug/kg considerando p<0,05.
4.7 Avaliação da sobrevida
Conforme figura 10, a sobrevida dos animais submetidos a sham, CLP e CLP+anti-CD40 (100 ug/kg) foi acompanhada por 10 dias consecutivos. Animais sham sobreviveram pelos 10 dias, não houve mortalidade para esse grupo. Animais submetidos a sepse sem tratamento apresentaram mortalidade de 55,55%, enquanto que animais submetidos a sepse e tratados com anti-CD40(100 ug/kg) apresentaram mortalidade de 38,88%. Estatisticamente, CLP e CLP + anti-CD40 não apresentaram diferenças significativas, porém, em relação a sham, ambos grupos mostraram diminuição da sobrevida (p=0,01).
Figura 10: Acompanhamento da sobrevida de animais submetidos a sham, CLP e CLP+anti-CD40 (100 ug/kg). Curva de Kaplan-Meier analizados por log-rank. * Significativo em relação a Sham considerando p<0,05.
4.8 Testes comportamentais
No presente estudo foram realizados dois testes comportamentais para avaliar o efeito de anti-CD40 na dose de 100 ug/Kg. A figura 11A mostra o resultado de habituação a
campo aberto, onde os animais são submetidos a um treino e 24 horas após a um teste. Podemos observar que animais CLP tiveram atividade locomotora dimuida e portanto, prejudicada, enquanto que animais tratados assemelham-se aos sham (controle). A figura 11B apresenta o resultado de Esquiva Inibitória, teste que avalia a retenção de memória. Nossos resultados mostraram que animais submetidos a CLP possuiram retenção de memória prejudicada, enquanto que animais tratados assemelham-se a animais sham.
Figura 11A: Habituação a campo aberto. Dados são apresentados como media e erro da média. *Diferença significativa em comparação ao treino considerando p<0.05.
Figura 11B: Esquiva Inibitória. Dados são apresentados como média e intervalos interquatis. *Diferença significativa em relação ao treino considerando p<0.05.
5. DISCUSSÃO
Na amplitude das manifestações clínicas da sepse, a encefalopatia séptica é uma das mais comuns, embora pouco diagnosticada, além de ser a causa de maior taxa de mortalidade. Além disso, sobreviventes de UTIs, incluindo pacientes sépticos, podem ter morbidade associada ao cérebro incluindo déficit cognitivo e desenvolvimento de distúrbios psiquiátricos. Em modelo animal de sepse polimicrobiana, ocorre encefalopatia aguda e os sobreviventes apresentam danos cognitivos no SNC (DAL PIZZOL et al, 2010).
Muitos estudos têm mostrado que CD40L e seu receptor CD40 participam em numerosas vias inflamatórias que regulam uma variedade de doenças. É comum encontrar resultados exibindo a interação entre CD40-CD40L com doenças como Alzheimer, lúpus (TAKAYA et al, 2003), aterosclerose (SCHAFER E BAUERSACHS, 2008) e diabetes (METWALLEY et al, 2013), mas estudos envolvendo sepse são raros e não são encontrados dados relativos ao SNC.
As primeira observação obtida nesse estudo foi o aumento dos níveis de CD40 e CD40L no hipocampo de ratos em 12, 24 e 48 horas após indução de sepse. A via CD40-CD40L parece estar envolvida na mediação da resposta inflamatória implicada na
fisiopatologia e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunes
(CHATZIGEORGIOU et al, 2009) uma vez que a expressão de CD40 é rapidamente regulada quando células são expostas a mediadores pró-inflamatórios (SALEMI et al, 2011). Dessa forma a neuroinflamação encontrada na sepse é capaz de induzir a ativação dessa via de sinalização, potencializando o dano já verificado em outros estudos no hipocampo (DAL-PIZZOL, 2013; MINA et al, 2014).
Outro achado nesse estudo foi que o tratamento com anticorpo anti-CD40 diminui a permeabilidade da BHE na sepse. Sabe-se que a interação entre a BHE, neurônios e microglia formam um complexo chamado unidade neurovascular mostrando que existe interação entre estas células e que elas podem afetar o funcionamento normal do SNC, que era dito como imune privilegiado (GINHOUX et al, 2010). Atualmente a BHE não pode mais ser vista como uma barreira imutável e não responsiva aos diferentes estímulos orgânicos (AGOSTINHO et al, 2010), uma vez que se sabe que esta é suscetível a mudanças que podem afetar também o ambiente interno (ABBOTT et al, 2010; KACIMI et al, 2011). Dessa forma na disfunção da BHE sugere o envolvimento de fatores periféricos, incluindo as toxinas e os elementos da imunidade adaptativa, que pode desempenhar um papel na patogênese como
também na progressão das doenças neurodegenerativas (ABBOTT, 2006; AGOSTINHO et al, 2010; ABBOTT et al, 2010; MELO et al, 2011; KACIMI et al, 2011).
A disfunção da BHE se torna importante uma vez que permite que as substâncias que não atingiriam o encéfalo, passam a fazê-lo, como moléculas complemento, toxinas e metais, além de contribuir para a alteração do equilíbrio de íons, perturbação dos sistemas de transporte e, potencialmente, alterar os constituintes da barreira enzimática, tornando-os ineficazes (CARVEY et al, 2010). Em resposta a isso as células que compõe a BHE podem secretar prostaglandinas, óxido nítrico, e citocinas que afetam o funcionamento do SNC (CARVEY et al, 2010). Dessa forma, microglia e macrófagos perivasculares entre outras células são capazes de interagir com ela (KACIMI et al, 2011). Ainda leucócitos são capazes de cruzar a BHE por diapedese através das junções endoteliais (ABBOTT et al, 2010).
Existe evidência do comprometimento da BHE tanto em pacientes, como em modelo animal de sepse (NISHIOKUC et al, 2010). Um estudo tem relacionado à ruptura da BHE como peça chave para a causa do delirium associado à sepse (HUGHES et al., 2013). Além do dano vascular e ativação entodelial, lesões na BHE podem facilitar a entrada de neurotoxinas e células inflamatórias, bem como mediadores inflamatórios para o parênquima cerebral (SHARSHAR et al, 2005). Nesse sentido, sabe-se que a encefalopatia associada a sepse pode levar ao rompimento da BHE e a formação de edema cerebral (PAPADOPOULOS et al, 2000; DAVIES, 2002).
Nosso resultado aponta para maior permeabilidade da BHE em animais com sepse não tratados e a avaliação após a administração de anti-CD40 mostrou diminuição da
permeabilidade para as doses de 10 e 100 g/mL de anticorpo no tempo de 24 horas após a
indução de sepse. Esse resultado demonstra que a inibição de CD40 diminuiu a permeabilidade da BHE, por mecanismo possivelmente associado à sinalização exercida pela ativação das vias relacionadas a esta molécula. Nesse sentido a inflamação sistêmica provocada pelo modelo CLP afeta a permeabilidade da BHE e a via CD40-CD40L está possivelmente relacionada a este evento e a progressão da neuroinflamação em encefalopatia associada a sepse.
O sistema CD40-CD40L organiza o processo de inflamação através de mensageiros secundários. Essa interação provoca liberação de várias citocinas e quimiocinas e ativação de vários fatores de transcrição (MACH et al, 1997). Na sepse, mediadores pró-inflamatórios, tais como citocinas têm papel importante na inflamação do SNC (LUO S, WEHR, 2009). Foi de fato demonstrado que a liberação de citocinas é aumentada em
pacientes criticamente doentes na forma precoce, incluindo o TNF-α, IL-1β, e IL-10 (DALLE-DONNE et al, 2003).
Na sepse, o TNF-α como um fator pró - inflamatório, é a primeira citocina multifuncional produzida a partir de monócitos e macrófagos estimuladas por LPS, que induz a cascata inflamatória e contribui para a severidade da lesão de tecidos (KACIMI et al, 2011). Após a infiltração de células fagocíticas no tecido, além da liberação de TNF- α, ocorre
ativação de uma cascata de mediadores pró-inflamatórios não controlados
fisiopatologicamente, entre eles IL-6 e IL-1β (O’KEEFE et al, 2002), agravando a inflamação e causando falência múltipla de órgãos em modelos experimentais de sepse e na clínica (ALOISI et al, 1998). No presente estudo, TNF-α, IL-1β e IL-6 foram avaliados em diferentes doses de anti-CD40 (1, 10 e 100 ug/kg), sendo que as doses de 10 e 100ug/kg inibiram significativamente os niveis de TNF-α, no entanto, IL-6 e IL-1β foi apenas inibido em 100 ng/kg de anti-CD40.
A atividade da enzima MPO é um marcador indireto de ativação de leucócitos e está relacionada a migração celular (BRADLEY et al, 1982). Concentrações aumentadas de MPO já foram encontradas em modelos animais de sepse (UYANIK et al, 2012) e nesse estudo foi encontrado níveis elevados dessa enzima no grupo CLP, enquanto que nos grupos tratados (doses de 10 e 100ng/kg) estes níveis estão diminuídos sendo um indicativo da dimunuição do infiltrado de neutrofilos para o hipocampo.
Outra importante achado no presente estudo foi que anti-CD40 diminui a concentração de nitrito/nitrato como um indicativo da formação de ON no hipocampo de ratos submetidos a sepse. O ON é produzido de forma exacerbada em condições de sepse, principalmente pela ativação da óxido nítrico sintase (iNOS), que pode ser ativada por lipopolissacarideo e citocinas (IRKEBOEN E TRAND, 1999). No cérebro o ON pode atuar como mediador inflamatório, e também na formação de ERN. Conjugando-se com o radical superóxido, pode formar o peroxinitrito, que é uma espécie de nitrogênio altamente reativa e
prejudicial a célula (GANDHI E ABRAMOV, 2012). Verificamos em nosso estudo que as
diferentes doses de anti-CD40 foram efetivas na diminuição da formação de nitrito/nitrato quando comparado ao controle que não recebeu anticorpo, mas que foi submetido ao modelo CLP.
Chen et al, (2006) forneceram evidências diretas da presença de estresse oxidativo induzido por sCD40L e geração de EROs em doença de Alzheimer. No presente estudo foi demonstrado que administração do anticorpo anti-CD40 diminui a lipoperoxidação, mas não a carbonilação protéica no hipocampo de ratos submetidos à CLP.
