4 MATERIAL E MÉTODOS
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram avaliados por análise de variância a dois critérios (Two- way ANOVA). As comparações múltiplas foram feitas pelo teste de Bonferroni. Para todos os testes, o nível de significância foi estabelecido em P < 0,05. O programa GraphPad Prism 6.0 foi utilizado para a realização dos cálculos estatísticos.
5 RESULTADOS
Todos os animais foram pesados e a glicemia quantificada imediatamente antes da indução do diabetes ou aplicação do veículo. Durante o experimento foram feitas medidas da glicemia e do peso corporal após um jejum de 8 horas. Conforme demonstrado na Figura 6, os animais diabéticos demonstraram aumento significativo da concentração plasmática de glicose (Figura 6A), assim como uma perda progressiva de peso (Figura 6B) ao longo do tempo, confirmando a indução e manutenção da doença.
Figura 6 - Dosagem de Glicemia (mg/dl) e Peso Corporal (g) em relação ao tempo em animais diabéticos e normoglicêmicos.
(A) Os animais diabéticos apresentaram concentração de glicose plasmática acima de 300 mg/dl 7 dias após a indução do diabetes. Os animais diabéticos apresentaram uma concentração de glicose
T e m p o ( d ia s ) G li c e m ia m g /d L 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * * ( A ) T e m p o ( d ia s ) P e s o ( g ) 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * ( B )
plasmática significativamente maior em relação aos normoglicêmicos em todos os tempos testados (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) Foi observada uma perda significativa (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni) e progressiva do peso dos animais diabéticos 14 dias após a indução do diabetes. O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
As análises comportamentais demonstraram que os animais diabéticos apresentaram hiponocicepção na ATM 7 dias após a indução do diabetes. Esta hiponocicepção foi observada até 42 dias após a indução da doença (Figura 7).
Figura 7 – Avaliação da hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM ratos.
A injeção intra-articular de capsaicina (1,5%) induziu resposta nociceptiva significativamente menor nos animais diabéticos quando comparados aos animais normoglicêmicos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após a indução da doença ou controle (P < 0,05: Two-way ANOVA, teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
Para avaliar se a hiponocicepção induzida pelo diabetes está vinculada a alterações no componente neuronal periférico da ATM foi analisado a liberação do DAG e da Na+/K+ ATPase (Figura 8). Os resultados demonstraram que o diabetes
reduz significativamente a ativação do DAG (Figura 8A) e da Na+/K+ ATPase (Figura
8B) no gânglio trigeminal, quando comparados aos animais normoglicêmicos ao longo do experimento. Estes resultados sugerem que a redução da liberação da Na+/K+ ATPase pode estar alterando o potencial de repouso de membrana dos
neurônios aferentes primários resultando em uma hiperpolarização desta fibras. Considerando que o DAG é um importante sinalizador intracelular envolvido com alterações neurovasculares (Evcimen e King, 2007), é possível hipotetizar que a
T e m p o ( d ia s ) C o m p o rt a m e n to n o c ic e p ti v o ( s ) 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 %
diminuição da liberação da Na+/K+ ATPase está diretamente relacionada com
diminuição do DAG.
Figura 8 – O Diabetes reduz a ativação do diacilglicerol e da Na+/K+ ATPase no gânglio
trigeminal.
(A) O diabetes diminuiu de forma significativa a ativação do DAG no gânglio trigeminal nos tempos
de 7, 14, 21, 28, 35 dias. (B) E também, da Na+/K+ ATPase no gânglio trigeminal nos tempos de 7,
21, 28, 35 e 42 dias quando comparado aos animais normoglicêmicos (P < 0,05: Two-way ANOVA,
Teste de Bonferroni). O símbolo (*, #) indica diferença estatística entre os grupos.
T e m p o ( d ia s ) D ia c il g li c e ro l (n g /m l) g â n g li o t ri g e m in a l 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 2 4 6 8 1 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * # * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 % ( A ) T e m p o ( d ia s ) N a + /K + A T P a s e ( n g /m l) g â n g li o t ri g e m in a l 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 % ( B )
Para avaliar se a hiponocicepção induzida pelo diabetes está vinculada a alterações no componente neuronal central do sistema trigeminal foi avaliado a expressão das micróglias, a ativação da p38-MAPK fosforilada (P-p38MAPK), a expressão do receptor da FKN CX3CR1, liberação de CatS e FNK.
O diabetes não alterou a ativação das micróglias localizadas no subnúcleo caudal trigeminal (Figura 9A). Apesar de observar-se em ratos diabéticos uma diminuição significativa pontual na expressão da P-p38MAPK quando comparado com os animais normoglicêmicos (Figura 9B), ao final dos experimentos não é observada diferença entre os grupos.
Figura 9 - Avaliação da expressão e atividade das micróglias no subnúcleo caudal trigeminal em animais diabéticos.
(A) Não houve diferença entre os grupos na expressão das micróglias (CD11b) no subnúcleo caudal trigeminal (P < 0,05: ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) O diabetes reduziu significativamente a expressão da P-p38MAPK nos dias 7, 21, 28 e 35 dias (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
A literatura tem demonstrado que quando a via p38MAPK é ativada nas micróglicas, a protease CatS é liberada. A CatS cliva a FKN que libera sua porção solúves, ativando o seu receptor CX3CR1. O receptor CX3CR1 promove liberação de mediadores inflamatórios pela micróglia resultando em uma sensibilização dos neurônios (Clark and Malcangio, 2011). Sendo assim, para confirmar que a hiponocicepção induzida pelo diabetes é independente do SNC, foi avaliado a liberação de CatS, FKN e expressão do receptor CX3CR1 no subnúcleo caudal trigeminal. Os resultados demonstram que não houve diferença estatisticamente significativa na liberação de CatS entre diabéticos e normoglicêmicos com exceção do tempo de 28 dias (Figura 10).
Figura 10 – Avaliação da liberação da Catepcina S no subnúcleo caudal trigeminal de animais diabéticos.
Não houve diferença estatisticamente significativa na liberação de CatS dos animais diabéticos
quando comparado a animais normoglicêmicos, apenas no tempo de 28 dias (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
Os animais diabéticos apresentaram aumento na liberação da FKN no subnúcleo caudal trigeminal nos tempos 14 e 28 dias quando comparado ao animais
normoglicêmicos. No entanto, os animais normoglicêmicos apresentaram aumentos significativo na liberação da FKN quando comparado aos animais diabéticos (Figura 11A). Quando avaliado a expressão dos receptores da FKN, o CX3CR1, não foi observado diferença entre os grupos testados (Figura 11B). Em conjunto, este dados sugerem que o desenvolvimento da doença diabetes não altera de forma significativa a expressão e atividade das micróglias no subnúcleo caudal trigeminal. Sendo assim, pode ser sugerido que a hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM de ratos é independente de alterações no SNC, fortalecendo a hipótese de que as alterações neurais induzidas pelo diabetes ocorre no Sistema Nervoso Periférico.
Figura 11 – Avaliação da liberação de FKN e expressão do receptor CX3CR1 no subnúcleo
(A) Os animais diabéticos apresentaram aumento significativo na liberação da FKN nos tempos 14 e 21 dias quando comparados aos animais diabéticos. Os animais normoglicêmicos apresentaram
aumento na liberação da FKN no tempo 42 dias. O símbolo (*,#) indica diferença estatística entre os
grupos (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) Não houve diferença estatística entre os grupos na expressão do receptor CXC3R1. O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni).
6 DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou que a indução do diabetes pela STZ, em ratos, resulta em alterações neurais na porção periférica do sistema trigeminal desenvolvendo uma hiponocicepção na ATM.
A indução do diabetes pela STZ é um modelo experimental comumente utilizado para avaliação das alterações nociceptivas induzidas pelo diabetes (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013). A STZ, uma nitrosamida, é um antibiótico de largo espectro com propriedades antitumorais e com toxicidade que promove como efeito a destruição das células beta-pancreáticas, resultando na deficiência da produção de insulina e, consequentemente, no aumento dos níveis plasmáticos de glicose (Doi, 1975). A indução de diabetes pela STZ em roedores induz quadros de hipernocicepção na pata (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013; Cheng et al., 2014) e redução da condução do nervo caudal (Murakami et al., 2012).
Considerando as estruturas orofaciais, a literatura tem relatado que o diabetes altera a homeostasia desses tecidos (Troger et al., 1999; Colin et al, 2000; Braga et al., 2001; Arap et al., 2011), no entanto o número de estudos é escasso e os resultados contraditórios.
Este estudo demonstrou que a injeção intraperitoneal de STZ induziu o diabetes nos ratos resultando em uma hiponocicepção na ATM. Em contrapartida, Rodella e colaboradores (2000) demonstraram que a fase inicial do diabetes induz hipernocicepção térmica facial, 8 a 12 semanas após a injeção da STZ; enquanto que Nones e colaboradores (2013) não observaram diferença na estimulação térmica e tátil orofacial na fase inicial do diabetes. A diferença entre os resultados desses estudos pode ser explicada pela variabilidade de técnicas e tecidos utilizados para a avaliação.
Os estudos avaliaram regiões distintas: tecido subcutâneos (face e lábio) e tecidos profundos (ATM), predominantemente inervados por diferentes subtipos de neurônios aferentes primários. Devido ao fato de as inervações de tecido profundo induzirem uma maior ativação na excitabilidade de neurônios centrais em relação às inervações de tecidos cutâneos, maiores distúrbios sensoriais podem ocorrer em condições dolorosas, envolvendo tecidos profundos (Imbe et al., 2001). Além do mais, já foi demonstrado que os tecidos da ATM são mais sensíveis a processos
inflamatórios, envolvendo liberação de aminas simpatomiméticas e prostaglandina E2, do que tecidos cutâneos (Rodrigues et al., 2006; Napimoga et al., 2008).
Outro ponto a ser considerado, também, é a diferença de testes utilizados nos dois estudos supracitados. O teste térmico detecta, principalmente, ativação de fibras nociceptivas superficiais, e o teste mecânico, nociceptores subcutâneos, envolvendo diferentes mecanismos na ativação dessas diferentes fibras nociceptivas (Vivancos et al., 2003; Pedrosa, 2011). O presente estudo utilizou o teste químico com aplicação intra-articular de capsaicina. Essa substância é conhecida por ativar receptores vanilóides tipo TRPV1, nas fibras periféricas C-nociceptivas, que aumentam a condutância das correntes de Na+ e Ca2+, resultando em
comportamentos nociceptivos (Tominaga e Tominaga, 2005; Nilius et al., 2007). Nesse sentido, o aumento da concentração de Ca2+ intracelular ativa
cascatas de sinalizações bioquímicas, como a via da fosfolipase C (PLC) / diacilglicerol (DAG) / proteína quinase C, que resultam na sensibilização de fibras aferentes primárias (Costigan e Woof, 2000; Woolf e Salter, 2000). A sensibilização por PKC também parece envolver a entrega exocitótica aumentada de TRPV1 para a membrana plasmática (McHugh et al., 2006). Da mesma forma, a insulina e o fator de crescimento semelhante à insulina - I (IGF-I) aumentam a translocação TRPV1 para a membrana plasmática, por ativação de receptores tirosina-quinases, o que leva um aumento da fosfatidilinositol-3-quinase e da ativação de PKC (Van Buren et al., 2005).
Os dados apresentados neste estudo demonstraram uma redução do níveis do DAG no gânglio trigeminal de ratos diabéticos. Considerando que o DAG é um sinalizador que resulta na sensibilização de fibras aferentes primárias (Costigan e Woof, 2000; Woolf e Salter, 2000), a redução da liberação do DAG no gânglio trigeminal nos ratos diabéticos pode explicar a hiponocecipção encontrada na ATM.
O papel do DAG na neuropatia diabética não é muito claro. A literatura sugere que a redução do fosfatidilinositol e dos níveis do DAG (Uehara et al., 2004; Evicimen e King, 2007) causam uma diminuição na atividade da PKC em nervos periféricos. A diminuição da atividade da PKC pode reduzir a fosforilação da Na+/K+
ATPase, resultando em uma diminuição da condução e da regeneração nervosa (Evicimen e King, 2007; Croze e Soulage, 2013).
Tem sido demonstrada uma relação diretamente proporcional entre a expressão da PKC tipo e a atividade da bomba Na+/K+ (Yang et al., 2012). Em
acréscimo a esse estudo, foi demonstrado que o diabetes induz a uma inibição da bomba Na+/K+, promovendo uma retenção de Na+, com consequente edema da
bainha mielínica, disjunção axoglial e degeneração nervosa (Gagliardi et al., 2003). A Na+/K+ ATPase é um componente da bomba eletrogênica Na+/K+ responsável pela
hidrólise do ATP em ADP e em fosfato inorgânico com liberação de energia. Considerando que a atividade da Na+/K+ ATPase está reduzida em tecidos
vasculares e neuronais de animais e pacientes diabéticos (Greene et al., 1987; Winegrad, 1987; King et al., 1993; Evcimen e King, 2007) e que na ATM de animais diabéticos houve a redução da Na+/K+ ATPase (estudo atual) e redução da
expressão da PKC- (Muzilli, 2014); pode-se sugerir que o diabetes resulta em alterações neurais periféricas, modificando a dinâmica das membranas neurais (Oka e Kato, 2001; Wang et al., 2014), resultando em uma hiperpolarização das mesmas e a não transmissão de informações sensoriais.
Fortalecendo a hipótese de que o diabetes resulta em uma alteração nervosa periférica, foi avaliado o envolvimento do SNC na hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM. Atualmente tem sido foco das pesquisas a interação do sistema neuroimune na compreensão dos mecanismos envolvidos com as condições dolorosas. Pesquisas que se concentram em modelos de dor neuropática, envolvendo lesão periférica nervosa traumática, neuropatia induzida por quimioterapia e mesmo em modelos de neuropatia diabética, assim como modelos de dor inflamatória crônica, têm evidenciado o papel das micróglias no corno dorsal da medula e sistema trigeminal na indução e manutenção dos quadros dolorosos (Zhang e De Koninck, 2006; Peters et al., 2007; Wodarski et al., 2009; Piao et al., 2006; Xu et al., 2008; Inoue e Tsuda, 2009; Miligan e Watkins, 2009; Gao e Ji, 2010).
As micróglias são ativadas por receptores purinérgicos (P2X7) ativados por altas concentrações de ATP extracelular que resultam na ativação de cascatas de sinalização intracelular, como por exemplo a via da p38MAPK (Chiang et al., 2011). A p38MAPK resulta na liberação de citocinas inflamatórias via CatS e FKN aumentando a hipersensibilidade dolorosa (Clark et al., 2006, 2010).
Em um contexto geral, não houve diferenças expressivas entre os animais diabéticos e normoglicêmicos na expressão e/ou sinalização celular das micróglias localizadas no subnúcleo caudal trigeminal, sugerindo que a hiponocicepção induzida pelo diabetes é independente do SNC.
7 CONCLUSÃO
Este estudo sugere que a hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM de ratos é resultado de alterações neuronais periféricas dependentes da sinalização do diacilglicerol (DAG) e da Na+/K+ ATPase. Os dados sugerem que as micróglias
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