Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Luiz Marques da Rocha Neto
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO E DA ATIVIDADE DAS
MICRÓGLIAS NO SUBNÚCLEO CAUDAL TRIGEMINAL DE RATOS NA
FASE INICIAL DO DIABETES TIPO 1.
Piracicaba 2016
Luiz Marques da Rocha Neto
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO E DA ATIVIDADE DAS
MICRÓGLIAS NO SUBNÚCLEO CAUDAL TRIGEMINAL DE RATOS NA
FASE INICIAL DO DIABETES TIPO 1.
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Fisiologia Oral.
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Trindade Clemente Napimoga
Piracicaba 2016 ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO LUIZ
MARQUES DA ROCHA NETO E
ORIENTADO PELA PROFA. DRA. JULIANA TRINDADE CLEMENTE NAPIMOGA.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Rocha Neto, Luiz Marques da,
R582a RocAvaliação da expressão e da atividade das micróglias no subnúcleo caudal trigeminal de ratos na fase inicial do diabetes tipo 1 / Luiz Marques da Rocha Neto. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2016.
RocOrientador: Juliana Trindade Clemente Napimoga.
RocDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Roc1. Diabetes Mellitus. 2. Microglia. 3. Nervo trigêmeo. I. Clemente-Napimoga, Juliana Trindade,1978-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of the expression. and activity of rat's trigeminal
subnucleus caudalis microglias in early fase of diabetes type 1
Palavras-chave em inglês:
Diabetes Mellitus Microglia
Trigeminal nerve
Área de concentração: Fisiologia Oral Titulação: Mestre em Odontologia Banca examinadora:
Juliana Trindade Clemente Napimoga [Orientador] Heloísa Helena de Araújo Ferreira
Cínthia Pereira Machado Tabchoury
Data de defesa: 24-02-2016
Programa de Pós-Graduação: Odontologia
A Deus por tudo;
Aos meus pais Humberto e Ana Mary, pelos exemplos que fizeram de mim o homem que sou;
À minha família, especialmente, tia Zélia (in memorian) pelo exemplo e pelo incentivo constante;
À minha orientadora Profa. Dra. Juliana Trindade Clemente Napimoga, pela oportunidade que me foi dada, pela sabedoria e amizade;
Ao Prof. Dr. Leonardo Rigoldi Bonjardim, por me mostrar o caminho e me ajudar nos primeiros passos desta jornada.
Aos meus amigos Cristina, Augusto, Henrique e Ricardo, pelo companheirismo e suporte emocional e principalmente pela alegria;
Aos funcionários e amigos Carlos Alberto A. Feliciano, Eliete Righetto e Maria Eliza dos Santos por tudo que fizeram e fazem para mim e pelos alunos de modo geral;
Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu Excelentíssimo Reitor Prof. Dr. José Tadeu Jorge.
Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu Diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, pela oportunidade oferecida, especialmente, à Coordenadora Profa. Dra.Cínthia Pereira Machado Tabchoury.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro a esta pesquisa.
Aos Professores do Departamento de Fisiologia pelos ensinamentos ministrados e pelo apoio à pesquisa;
A todos os amigos e alunos da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba-UNICAMP, pelo apoio mútuo e coleguismo ético demonstrado;
A todos os Professores que de forma direta ou indireta contribuíram para o nosso melhor aproveitamento;
A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia de Piracicaba pelo profissionalismo demonstrado e dedicação prestada;
A algum amigo que porventura não tenha sido citado, mas que colaborou com seu incentivo e dedicação.
O Diabetes Mellitus (DM), em sua fase inicial, é conhecido por resultar em uma variedade de condições dolorosas causadas por uma modificação na atividade e na transmissão neuronal. Nesse sentido, após lesão periférica tecidual e/ou nervosa, importantes contribuintes para a modificação da transmissão nociceptiva são as células microgliais do sistema nervoso central (SNC). O objetivo deste estudo foi investigar o papel dessas micróglias, localizadas no subnúcleo caudal trigeminal na hiponocicepção induzida na fase inicial do diabetes tipo 1 na articulação temporomandibular (ATM) de ratos. Para isso, ratos Wistar (± 8 semanas, ±150g, n=4 por grupo) foram tratados com uma injeção intraperitoneal de veículo (tampão citrato; animais normoglicêmicos) ou estreptozotocina (75mg/Kg; animais diabéticos). A hiponocicepção induzida pelo diabetes foi avaliada pelo comportamento nociceptivo, provocado por uma injeção intra-articular de capsaicina nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou veículo. Realizada a avaliação comportamental, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia e os gânglios e os subnúcleos caudais trigeminais removidos e processados para quantificação da expressão das micróglias (CD11b/c), da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38MAPK), do receptor CX3CR1 e da Alfa-tubulina (métodos Western Blot) e para a análise da liberação do Diacilglicerol (DAG), da ATPase trocadora de Sódio-Potássio (Na+/K+ ATPase) e dos mediadores
Catepsina S (CatS) e Fractalcina (FNK) (método ELISA). A fase inicial do diabetes tipo 1 induziu hiponocicepção na articulação ATM de ratos, nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução do diabetes (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). O diabetes diminuiu significativamente a ativação de DAG e Na+/K+ ATPase (P <
0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). Não houve diferença entre os grupos na expressão de CD11b, p38MAPK e CX3CR1 (P > 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). Não houve diferença entre os grupos na liberação de FKN ou CatS entre ratos diabéticos e normoglicêmicos (P > 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). Os resultados deste estudo sugerem que a hiponocicepção induzida pelo Diabetes na ATM de ratos é resultado de alterações neuronais periféricas dependentes da sinalização do diacilglicerol (DAG) e da Na+/K+ ATPase e que as
células microgliais do subnúcleos caudal não estão envolvidas neste processo. Palavras-chave: diabetes, micróglia, nervo trigêmeo.
Diabetes in early phase in known to result a variety of painful conditions induced by a modification in the neuronal activation and transmission. Following peripheral nerve/tissue injury, one important contributor to change nociceptive transmission are microglial cells in central nervous system. The aim of this study was to investigate the role of microglial cells of the trigeminal subnucleus caudalis in diabetes-induced hyponociception in the TMJ of rats. Wistar rats (± 8 w, ± 150 g, n=4-6/group) were treated with an intraperitoneal injection of vehicle (normoglycemic – NG) or Streptozotocin 75 mg/kg (diabetic – DB). Diabetes-induced hypornociception was assessed by the animals’ nociceptive behavior induced by an intra-articular injection of capsaicin 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days after the diabetic induction. After behavioral assays, animals were terminally anesthetized and their trigeminal subnucleus caudalis were removed to analyze the release of expression of the CD11b, p38MAPK and CX3CR1 (Western Blot) and Diacylglicerol (DAG), Sodium-Potassium-Exchanging ATPase (Na+/K+ ATPase), Fraktalkine (FKN) and Catepsin S
(CatS) (ELISA). Early phase of diabetes induced hyponociception into TMJ of rats 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days after the diabetic induction (P < 0.05: Two-way ANOVA, Bonferroni’s test). Western Blot analysis demonstrated no statistical difference in the expression of CD11b/c, p38MAPK and CX3CR1 among DB rats and NG rats (P > 0.05: Two-way ANOVA, Bonferroni’s test). ELISA analysis demonstrated no statistical difference in the release of FKN or CatS among DB and NG rats (P > 0.05: Two-way ANOVA, Bonferroni’s test). The results of this study suggest that the diabetes-induced hyponociception in the TMJ of rats is result of dependent diacylglycerol (DAG) and Na+/K+/ATPase peripheral neuronal signaling changes and
that microglial cells seem to have no role in this process.
ATM - Articulação temporomandibular ATP - Adenosina trifosfato
CatS - Catepsina S
CD11b - Marcador de micróglia
DAG - Diacilglicerol
DM - Diabetes Mellitus
DTM - Disfunção(ões) temporomandibular(es) ERK - Quinase regulada por sinal extracelular
FKN - Fractalcina
HRP - Horseradish peroxidase
JNK - Quinase c-Jun N-terminal
M - Molar
MAPK - Proteína quinase ativada por mitógeno
mg - Micrograma
mL - Mililitro
mM - Micro molar
Na+/K+ ATPase - ATPase trocadora de Sódio-Potássio
ND - Neuropatia Diabética
NG - Normoglicêmico(s)
NPD - Neuropatia periférica diabética OMS - Organização Mundial de Saúde PBS - Tampão fosfato salina
PKC - Proteína quinase C
PNDD - Polineuropatia diabética dolorosa
PNIDC - Polineuropatia inflamatória desmielinizante crônica SCN - Sistema nervoso central
STZ - estreptozotocina
1 INTRODUÇÃO 12 2 REVISÃO DA LITERATURA 15 3 PROPOSIÇÃO 27 4 MATERIAL E MÉTODOS 28 5 RESULTADOS 35 6 DISCUSSÃO 42 7 CONCLUSÃO 45 REFERÊNCIAS 46 ANEXOS 62 Anexo 1 62 Anexo 2 63 Anexo 3 64
1 INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença metabólica, crônica, caracterizada por aumento anormal dos níveis de glicose no sangue como resultado de alterações na produção de insulina ou na resposta dos tecidos a ela.Os sintomas de hiperglicemia acentuada incluem poliúria, polidipsia, perda de peso, por vezes com polifagia, e visão turva (ADA, 2004).
No ano de 2013, a Federação Internacional do Diabetes declarou que 382 milhões de pessoas no mundo têm a doença e estima-se que, para o ano de 2035, esse número chegue a 592 milhões, com custos da ordem de 548 milhões de dólares.
A maioria dos casos de diabetes enquadra-se nas duas principais categorias etiopatogênicas, o diabetes tipo 1 e o tipo 2. O diabetes tipo 1 está primordialmente relacionado à destruição autoimune das células beta pancreáticas, resultando em absoluta deficiência de insulina; e o diabetes tipo 2, relacionada a resistência e/ou secreção anormal à insulina (ADA, 2004). Os dois tipos de diabetes apresentam complicações similares, dentre elas, anormalidades vasculares e neuropatias periféricas sensoriais (Singleton et al., 2003; Boulton et al., 2004; Tesfaye et al., 2010; Tesfaye & Selvarajah, 2012; Schreiber et al., 2015).
O desenvolvimento das neuropatias sensoriais causadas pelo diabetes está diretamente associado à falta de controle glicêmico, tempo de instalação da doença, fatores microvasculares (microangiopatias), fatores de risco cardiovasculares (hipertensão, hiperlipidemia, obesidade e fumo) (Tesfaye et al., 1996; Boulton et al., 2004; Tesfaye & Selvarajah, 2012). Dentre as complicações do diabetes, as neuropatias periféricas sensoriais são as mais comuns, afetando mais de 50% dos pacientes diabéticos (Boulton et al., 2004; Schreiber et al., 2015). Estima-se que um terço dos pacientes diabéticos têm sintomas de neuropatia dolorosa e 60% daqueles com neuropatia clínica severa evoluem com sintomas de neuropatia dolorosa (Abbott et al., 2011).
As neuropatias diabéticas induzem a uma variedade de alterações na condução nervosa, incluindo dor espontânea, hiperalgesia e alodínia, assim como quadros de hipoalgesia e analgesia (Calcutt, 2004). Uma das principais queixas de pacientes diabéticos, em estágios avançados da doença, é a perda de sensibilidade nas extremidades do corpo (hipoalgesia), cujo agravamento pode levar à ocorrência
de danos teciduais e quadros infecciosos, necessitando da amputação do membro (Calcutt, 2004).
Os quadros hipoalgésicos provocados pelo diabetes estão vinculados, à alterações estruturais nas fibras neuronais, como rompimento das células de Schwann (desmielinização), degeneração, perdas axonais, lesões microvasculares, e alterações nas sinalizações bioquímicas intracelulares (Arezzo & Zotova, 2002). Com a progressão das neuropatias, observa-se a ausência quase total de fibras finas e grossas nos nervos periféricos, resultando em perda de função sensório-motora (Calcutt, 2004), no entanto ainda são pouco compreendidos os mecanismos celulares e moleculares envolvidos com o início e manutenção dessas neuropatias (Daulhac et al., 2006).
Sabe-se que mecanismos periféricos e centrais estão envolvidos na fisiopatogênese da neuropatia diabética dolorosa. As alterações periféricas estão relacionadas com a distribuição dos canais de sódio e distribuição e expressão de canais de cálcio; expressão alterada de neuropeptídios; perda do controle inibitório muscular; alteração no fluxo sanguíneo periférico; atrofia e degeneração axonal; dano em fibras finas e aumento do fluxo glicêmico. Em relação às alterações centrais, considera-se: a sensibilização central, alteração da facilitação e inibição das vias descendentes, o aumento da vascularização talâmica, entre outros (Tesfaye et al., 2010; Tesfaye et al., 2011).
A sensibilização central refere-se ao processo pelo qual um estado de hiperexcitabilidade está estabelecido no sistema nervoso central, levando a um aumento da transformação das mensagens nociceptivas (Woolf, 1983). Inúmeros mecanismos têm sido implicados na sensibilização central, entre ele a interação glial-neuronal. As células gliais, principalmente micróglias e astrócitos, também contribuem para o processo de sensibilização central decorrente de uma lesão periférica. Ao tornarem-se ativas as micróglias liberam uma série de moléculas de sinalização, incluindo citocinas, que aumentam a sensibilização neuronal ao se ligarem a receptores em terminais pré e pós-sinápticos no corno dorsal da medula para modular a transmissão sináptica excitatória e inibitória (Basbaum et al., 2009; Grace et al., 2014), como no caso da neuropatia diabética periférica.
Estudos em humanos têm sugerido que os transtornos sensoriais induzidos pelo diabetes também acometem estruturas inervadas pelo sistema trigeminal (Collin et al., 2000; Arap et al., 2010; Zhu e Nikolajczyk, 2014), resultando
em transtornos sensoriais. Em particular, tem sido sugerido que quadros de hipoalgesia dos tecidos constituintes da ATM podem provocar desordens articulares e deformidades como as articulações de Charcot (Collin et al., 2000). A articulação de Charcot, uma neuroartrite, é consequência da lesão dos nervos, como no caso da neuropatia induzida pelo diabetes, a qual impede a percepção da dor articular, acarretando lesões e fraturas insignificantes e repetidas (de forma despercebida) até a deterioração permanente da articulação (Rogers et al., 2011; Larson e Burns, 2012).
Estudos em animais demonstraram que o diabetes induzido pela estreptozotocina leva a alterações de hipersensibilidade na pata dos animais e esse processo está vinculado a um aumento na expressão e na atividade das micróglias no sistema medular (Xu et al., 2013; Zychowska et al., 2013; Cheng et al., 2014). Sabe-se que o diabetes reduz as conexões nervosas da medula óssea, ligadas a centros simpáticos, e que essa modificação está associada a mudanças na hematopoese, vinculada à formação de micróglias (Hu et al., 2013). Considera-se, ainda, que a ATM tem um importante componente simpático (Kido et al., 2001; Rodrigues et al., 2006; Fávaro-Moreira et al., 2012). É possível, assim, que a hipoalgesia causada pelo diabetes na ATM esteja associada a uma diminuição na expressão e/ou na atividade das células microgliais no subnúcleo caudal.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 DIABETES
2.1.1 Aspectos Gerais
Segundo a Organização Mundial de Saúde, (OMS -- 1999), o termo diabetes mellitus (DM) descreve uma desordem metabólica de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica, com distúrbios do metabolismo de carboidrato, gordura e proteína, resultantes de defeitos da secreção e/ou ação da insulina. O DM apresenta sintomas clínicos característicos como a poliúria, a polifagia, a polidipsia, além de perda de peso e astenia (falta de energia).
No último século, mudanças no comportamento e estilo de vida dos seres humanos, como sedentarismo e obesidade, têm resultado em um dramático aumento na incidência do diabetes no mundo (Zimmet et al., 2001). O diabetes afeta mais de 8 % da população mundial (Shi et al., 2014), podendo chegar a 592 milhões casos em 2035 (Tao et al., 2015). Trata-se, assim, de um crescente problema de saúde pública, cujos dados alarmantes preocupam, tendo em vista que as complicações da doença causam um alto índice de morbidade e mortalidade (Libman et al., 1993; Lin et al., 2014).
Atualmente, a classificação do DM é baseada na sua etiologia e não mais no tipo de tratamento, como era feito no passado. A classificação proposta pela OMS e pela Associação Americana de Diabetes inclui quatro classes clínicas: DM tipo 1, DM tipo 2, outros tipos específicos de DM e DM gestacional. A maioria dos casos de diabetes divide-se entre as duas principais categorias etiopatogênicas -- o DM tipo 1 e tipo 2 (ADA, 2004).
O DM tipo 1, de 5% a 10% dos casos, é o resultado da destruição de células beta-pancreáticas com consequente deficiência de insulina. Na maioria das vezes, essa destruição de células beta é mediada por autoimunidade, porém há casos em que não há evidências de processo autoimune, sendo, portanto, referidos como forma idiopática de DM tipo 1. O DM tipo 2, de 90% a 95% dos casos, caracteriza-se por defeitos na ação e secreção da insulina, sendo vinculado a sobrepeso ou obesidade (SBD, 2013). Independente da etiologia, o DM apresenta como característica comum um quadro de hiperglicemia.
A hiperglicemia crônica está associada a lesões de longa duração, a disfunções e a falha de vários órgãos, incluindo retinopatias, com potencial perda de
visão; nefropatias, que possibilitam a falha renal; neuropatia periférica, com risco de pé diabético, amputação e articulação de Charcot; neuropatias autonômicas, causadoras de sintomas gastrointestinais, uroginecológicos, cardiovasculares, além de disfunção sexual (ADA, 2004).
2.2 NEUROPATIA DIABÉTICA
As neuropatias diabéticas (ND) envolvem a perda progressiva das fibras nervosas do sistema nervoso periférico somático e autonômico que acarretam sequelas devastadoras entre pacientes com DM (Boulton et al., 2005).
O diagnóstico da ND não deve ser feito com base em um único sintoma, sinal ou teste; sua confirmação deve ser estabelecida com um mínino de duas anomalias a partir de sintomas, sinais, anomalias da condução do nervo, testes sensoriais quantitativos, ou testes autonômicos quantitativos (Boulton et al, 2004, Boulton et al, 2005). Cerca de 10% dos pacientes diabéticos apresentam neuropatias de causas não-diabéticas (Boulton et al, 2004).
Foram propostas algumas classificações para as síndromes que afetam o sistema nervoso periférico no diabetes. Algumas baseadas em etiologia, características topográficas ou patológicas, porém as mais comumente utilizadas são as classificações baseadas nas manifestações clínicas, como a classificação de Thomas, recomendada pela Associação Americana de Diabetes e pelo Consenso de Toronto (Boulton, 2004; Tesfaye, 2010; Russell e Zilliox, 2014).
Segundo essa classificação, as neuropatias diabéticas são divididas em: (1) Neuropatia da hiperglicemia – rapidamente reversível;
(2) Polineuropatias simétricas generalizadas – irreversíveis - Sensitivo-aguda;
- Sensitivo-motora crônica; - Autonômica;
(3) Focais e multifocais – reversíveis Craniana;
Troncular - toracoabdominal, focal de membros – compressiva e proximal motora (amiotrofia femoral);
(4) Polineuropatia inflamatória desmielinizante crônica - PNIDC coexistente (Pedrosa, 2015).
Essa classificação baseia-se na premissa de que o ND não é uma condição unitária, mas é o resultado de distúrbios no sistema nervoso periférico, como uma consequência da hiperglicemia (Boulton et al, 2004, Boulton et al, 2005). Dentre as mais comuns estão as polineuropatias simétricas distais ou sensitivo-motoras, que ocorrem em cerca de 90% dos casos, e as neuropatias autonômicas (Boulton et al, 2005; Tesfaye et al., 2013).
As complicações envolvidas com a neuropatia periférica induzida pelo diabetes, como também os mecanismos celulares e moleculares envolvidos com o início e manutenção dessas neuropatias ainda são pouco compreendidos (Daulhac et al., 2006; Johnson et al., 2007). A patogênese da neuropatia periférica diabética (NPD) continua sendo um assunto controverso entre os pesquisadores. Muitos trabalhos têm sido publicados nos últimos anos, porém é bastante improvável que haja apenas uma causa, mas sim uma associação de diferentes anormalidades, culminando em um quadro clínico comum de neuropatia (Tesfaye et al. 2010; Singh et al., 2014).
2.2.1 Fisiopatologia da Neuropatia Diabética
A literatura sugere uma relação direta entre o estado hiperglicêmico, mantido cronicamente, e as complicações micro e macrovasculares, dando suporte à hipótese de que a hiperglicemia é o fator determinante na gênese das complicações do diabetes (Boulton et al. 2005; Singh et al., 2014). Vários estudos sugerem que a deficiência da insulina e/ou o peptídeo C contribuem para NPD severa. Em acréscimo, a combinação de lesão axonal direta, devido às consequências de hiperglicemia, a resistência à insulina, a adiposidade tóxica, a lesão endotelial e as disfunções microvasculares levam à isquemia nervosa (Singh et al., 2014).
Vários são os mecanismos bioquímicos propostos para o desenvolvimento de anormalidades estruturais e funcionais relacionadas à exposição prolongada dos tecidos vasculares à hiperglicemia. Dentre eles, podem ser citados: a atividade elevada da via dos polióis, o estresse oxidativo, a formação de produtos finais da glicação avançada, elevação da sinalização do fator nuclear κβ e da p38-MAPK, o aumento da atividade da poli(ADP-ribose) polimerase, atividade
da lipoxigenase e da ação do trocador - 1 Na+/H+ (Cameron et al., 2013; Lupachyk et
al., 2013; Van Dan et al., 2013).
A via dos polióis está presente em vários tecidos, incluindo, vasos sanguíneos e nervos periféricos. Nessa via, a glicose é convertida em sorbitol, pela aldose redutase, e adicionalmente, metabolizado em frutose, catalizado pela sorbitol desidrogenase (Ramasamy et al., 2010). A hiperatividade da via dos poliós relacionada ao esgotamento do mio-inositol, é uma das hipóteses metabólicas para as complicações do diabetes (Singh et al., 0214). O acúmulo excessivo de sorbitol, resulta em diminuição do mio-inositol em nervos periféricos, levando à redução da atividade da Na+/K+ ATPase e alteração da homeostase iônica, via diminuição da
atividade da PKC (Greene et al., 1992)
Em destaque, tem sido demonstrado que a hiperglicemia induz as complicações neurovasculares através da via diacilglicerol/proteína quinase C (DAG/PKC) (Evcimen e King, 2007). O DAG é o principal ativador fisiológico da PKC. O aumento dos níveis de DAG no diabetes pode ocorrer através de múltiplas vias (Evcimen e King, 2007). O DAG pode ser derivado da hidrólise de fosfatidilinositídeos; pelo metabolismo da fosfatidilcolina por ação da fosfolipase C; ou pela síntese através dos intermediários glicolíticos, fosfato de diidroxiacetona e gliceral-3-fosfato; com subsequente ativação da PKC (Evcimen e King, 2007). A via DAG/PKC também pode ser ativada pela hiperglicemia como resultado do aumento do estresse oxidativo, como por exemplo, pelo aumento do oxidante peróxido de hidrogênio, o qual é um conhecido ativador da PKC, seja de forma direta ou indireta pelo aumento da produção do DAG. (Konishi et al., 1997; Nishikawa et al., 2000).
2.3 DOR
2.3.1 Aspectos gerais
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) como sendo “uma experiência emocional e sensorial desagradável associada a uma lesão tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal lesão”. A sensação dolorosa tem papel fisiológico e funciona como um sinal de alerta para percepção de algo que ameaça a integridade física.
O componente sensorial da dor corresponde à nocicepção e consiste de três fases: transdução, transmissão e modulação. Transdução é a transformação do estímulo nociceptivo, captado por terminações nervosas periféricas que o transformam em sinais elétricos. Transmissão é a propagação dos impulsos elétricos por fibras sensoriais de dois tipos: A δ e C polimodais. Modulação refere-se à alteração do estímulo no corno dorsal da medula espinhal, por meio de vias opioidérgicas, serotoninérgicas e noradrenérgicas. A combinação dessas três fases de percepção, ou nocicepção, estimula o sistema nervoso central à consciência da dor (Sessle, 2000; Lund et al., 2001).
2.3.2 Dor Neuropática
A IASP define dor neuropática como “dor iniciada ou causada por uma lesão primária ou disfunção do sistema nervoso” (Bogduk, 1994). Certos mecanismos, como a sensibilização periférica de nociceptores ou sensibilização central, que ocorrem nas dores nociceptivas agudas, podem participar da dor neuropática juntamente com os mecanismos que aparecem especificamente após lesão nervosa (Woda e Salter, 2010).
2.3.3 Dor Neuropática Diabética
A definição de dor neuropática diabética, proposta pela IASP, é a “dor que surge como consequência direta de anormalidades no sistema somatossensitivo periférico em pessoas com diabetes” (Treede et al. 2008).
Dentre as neuropatias diabéticas, a prevalência de polineuropatia diabética dolorosa (PNDD) varia entre 10-26% (Tesfaye et al., 2013; Russell e Zilliox, 2014).Os fatores de risco para PNDD não são tão claros quanto os de NPD, mas estudos preliminares, limitados a instrumentos de rastreamento, sugerem que sejam semelhantes àqueles cardiovasculares associados à NPD assintomática como peso, obesidade, circunferência abdominal, doença arterial periférica e triglicérides (Tesfaye et al., 2013).As fibras finas amielínicas (C) e as finamente mielinizadas (A delta), como também as fibras grossas mielínicas (A alfa, A beta), são comprometidas. As fibras finas, que constituem 79,6% a 91,4% das fibras nervosas periféricas, são a base da gênese da PNDD (Malik et al. ,2011; Russell e Zilliox,
2014), enquanto a lesão de fibras grossas desempenha um papel-chave no desenvolvimento da ulceração (Boulton et al., 2005; Tavakoli et al., 2009).
Estudos mostram que as fibras finas são precocemente comprometidas, constatando-se dor e hiperalgesia, quando não são encontrados, déficit sensitivo ou de alteração na velocidade de condução nervosa (VCN), verificada pelo teste de fibras grossas, usado como confirmação diagnóstica e de avaliação da gravidade da NPD por sua fácil quantificação, reprodutibilidade, sensibilidade e especificidade aparentes (Tesfaye et al., 2010; Malik et al., 2011).
2.4 MICRÓGLIAS
Dentre os fatores relacionados com o desencadeamento dos distúrbios sensoriais induzidos pelo diabetes, estão estruturas neurais e não-neurais, como as micróglias (Daulhac et al., 2006; Inoue e Tsuda, 2009; Chiang et al., 2011; Zychowska et a., 2013; Cheng et al., 2014). As micróglias são células fagocitárias, originadas da migração de monócitos da medula óssea, responsáveis pela imunidade inata do sistema nervoso central (SNC) (Ji et al., 2009). Elas existem no parênquima do SNC e em regiões perivasculares. Esses dois tipos apresentam propriedades distintas e ambos pertencem à linhagem mielomonocítica, que também inclui os monócitos e macrófagos. Ao contrário de outras células dessa linhagem, as micróglias, que representam 10% a 20% das células gliais na idade adulta, amadurecem e residem no SNC. As células microgliais têm propriedades morfológicas e funcionais distintas, desenvolvidas sob a influência de neurônios e outras células da glia (Sievers et al., 1994; McMahon e Malcangio, 2009). Em muitos estudos, as células microgliais vêm sendo relacionadas como um fator importante tanto na indução quanto na manutenção de transtornos sensoriais seguidos de injúrias neurais e/ou teciduais periféricos (Daulhac et al., 2006; Xie et al., 2006; McMahon and Malcangio, 2009; Chiang et al., 2011).
Em condições normais a micróglia realiza vigilância imunológica do SNC. Ela apresenta processos ramificados altamente móveis (Nimmerjahn et al., 2005). Seu estado muda dramaticamente não somente após insulto direto ao SNC, mas também, rapidamente, após lesão periférica nervosa ou tecidual. Nessa condição, a morfologia das micróglias muda, aumentando o tamanho dos corpos celulares e
tornando seus processos proximais grossos e suas ramificações menos móveis (McMahon e Malcangio, 2009).
Nesse sentido, tem sido demonstrado na medula espinhal que, frente a uma injúria neural e/ou tecidual periférica, o aumento da concentração extracelular de ATP ativa os receptores purinérgicos P2X7 localizados na micróglia que, por sua vez, ativam a via p38 MAPK, que libera a protease CatS. A CatS cliva a FKN (uma proteína transmembrana presente no neurônio) que libera sua porção solúvel, ativando o seu receptor CX3CR1, na micróglia. Uma vez ativado, o receptor CX3CR1 promove a fosforilação da p38 MAPK, o que leva à liberação d*e
mediadores inflamatórios pela micróglia, resultando em uma sensibilização dos neurônios e consequente manutenção da dor (Figura 1; Clark e Malcangio, 2011).
Figura 1 – Proposta esquemática do mecanismo pró-nociceptivo da CatS.
Fonte: Adaptado de Clark e Malcangio, 2011*
* Clark, A.K., Malcangio, M., Microglial signalling mechanisms: Cathepsin S and Fractalkine, Exp.
2.4.1 Proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38 MAPK)
Atualmente, muitos estudos têm ressaltado a importância da ativação da p38 MAPK no desenvolvimento e manutenção da dor (Xie et al., 2006; Ji e Suter, 2007; Taves et al., 2015). As proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs) constituem uma família de moléculas que desempenham um papel crucial na sinalização celular e na expressão gênica (Widman et al., 1999; Daulhac et al, 2006). Embora sejam caracteristicamente envolvidas com regulação da proliferação, diferenciação e sobrevivência celular, elas têm sido reconhecidas pelo seu grande papel na geração da hipersensibilidade dolorosa (Daulhac et al, 2006).
A família das MAPKs inclui três membros principais: quinase regulada por sinal extracelular (ERK), p38 MAPK e quinase c-Jun N-terminal (JNK), que representam três diferentes cascatas de sinalização. As MAPKs são ativadas por fosforilação (tirosina e treonina) e transduzem uma vasta gama de estímulos extracelulares em diversas respostas intracelulares por regulação transcricional e não-transcricional (Tomlison e Gardiner, 2007). A p38 MAPK é considerada como uma quinase induzida por estresse e desempenha um papel crucial nas respostas inflamatórias (Ji e Suter, 2007). Embora haja duas principais isoformas da p38 - a p38α e p38β - somente a última é expressa nas micróglias (Svensson et al. 2005).
2.4.2 Catepsina S (CatS), Fractalcina (FKN) e CX3CR1
Nas micróglias, a fosforilação da p38 ativa a CatS, uma enzima lisossomal (cisteína protease) expressa e liberada pelas micróglias, processo que contribui para a manutenção da hiperalgesia e alodínia neuropática pela liberação do domínio pró-nociceptivo da quimiocina neuronal FKN (McMahon e Malcangio, 2009; Clarck e Malcangio, 2014). A CatS pertence à família das cisteínas-proteases relacionadas à papaína (Vasiljeva et al., 2007), encontradas como um zimogênio inativo no compartimento lisossomal após sua síntese inicial no retículo endoplasmático rugoso como pré-pro CatS e translocação através do complexo de Golgi, pela via de manose-6-fosfato (Lecaille et al., 2002). Nos lisossomos, a CatS se torna ativa após a remoção da pro-peptídeo por outras proteases e clivagem autocatalítica facilitada por baixo pH lisossómico (Quraishi e Storer, 2001; Vasiljeva et al., 2005). Após lesão
nervosa periférica, a CatS é regulada para cima em células microgliais da área inervada pelos terminais aferentes primários lesados (Clark et al. 2007; Clark e Malcangio, 2014). Ela é liberada da micróglia de forma dependente do receptor P2X7 (Clark et al., 2010), clivando a FKN, que sinaliza para a micróglia via CX3CR1.
A Fractalcina é uma proteína transmembrana expressa no corpo celular de neurônios sensitivos do gânglio da raiz dorsal e neurônios intrínsecos no corno dorsal da medula, embora não o seja em células endoteliais do SNC (Cardona et al., 2008; McMahon e Malcangio, 2009). O receptor da FKN (CX3CR1) é unicamente expresso pela micróglia no corno dorsal da medula (Verge et al., 2004; Clark e Malcangio, 2014). A FKN é estruturalmente única entre a família de quimiocinas. Ela é o único membro da família CX3C e foi descrito pela primeira vez como um atrator potente de células imunitárias. Ela pode existir em duas formas, cada uma delas responsável por ações biológicas distintas: uma proteína de membrana presa e formas solúveis que contenham o domínio de quimiocina (Bazan et al., 1997; Clark e Malcangio, 2014).
O CX3CR1, receptor acoplado à proteína G, é abundante tanto em leucócitos sanguíneos periféricos como em micróglias no SNC (Clark e Malcangio, 2014), embora, no SNC ele seja exclusivamente expresso nas micróglias (Verge et al., 2004; Lindia et al., 2005; Zhuang et al., 2007; Yang et al., 2012; Clark et al., 2011; Clark e Malcangio, 2014).
Várias evidências indicam que no SNC a dupla FKN/CX3CR1 está perfeitamente localizada para mediar a comunicação neuroimune, tanto durante a homeostase quanto em processos patológicos (Clark e Malcangio, 2014). Além disso, a FKN induz comportamento nociceptivo após ativação do CX3CR1 e fosforilação intracelular da p38 MAPK (Clark et al., 2007; Zhuang et al., 2007; Clark e Malcangio, 2014).
2.5 DIABETES E O SISTEMA ESTOMATOGNÁTICO
A relação entre saúde bucal e diabetes tem sido amplamente descrita na literatura, já que a doença apresenta um amplo espectro de manifestações orais, como a hiposalivação, o paladar alterado, e a sialose (produção excessiva de secreção salivar). Pode, ainda, acelerar a progressão de algumas doenças, como a
cárie dentária, a doença periodontal, as lesões dos tecidos moles e as infecções fúngicas (Leite et al., 2008; Sun et al., 2012;), além da perda de elementos dentais, do aumento significativo da reabsorção óssea durante a movimentação ortodôntica (Braga et al., 2011) e da disfunção temporomandibular (DTM) (Collin et al., 2000; Zhu e Nilolajczyk, 2014). A presença de dor orofacial foi relatada por 55,2% dos pacientes com diabetes tipo 2, dos quais 31% foram diagnosticados com DTM do tipo dor miofascial e 17,2% com ardência bucal (Arap et al., 2010).
Em modelos animais foi verificada uma redução do limiar nociceptivo ao calor na região orofacial de ratos com diabetes induzido por estreptozotocina (Ziegler, 2008). Apesar desses estudos, ainda poucos são aqueles que investigam o impacto do diabetes na dor orofacial tanto em animais quanto em humanos.
2.5.1 Diabetes e DTM
A DTM constitui uma desarmonia no sistema estomatognático, podendo ocorrer envolvimento e prejuízo nos músculos mastigatórios, na ATM propriamente dita ou em ambos (Okeson, 1997; Quinto, 2000; Vazquez-Delgado et al., 2004; Leeuw, 2010). A etiologia da DTM é considerada complexa e multifatorial por envolver fatores de origem anatomo-oclusais, neuromusculares e psicológicos. É caracterizada pela presença de sinais e sintomas como ruídos articulares, redução da amplitude ou alteração dos movimentos mandibulares, limitações funcionais, dores na musculatura mastigatória, na região pré-auricular e/ou na própria articulação (Garcia et al., 2000; Ash et al., 2001; Ozan et al., 2007; Silveira et al., 2007). Na região orofacial, a DTM corresponde à condição de dor crônica de maior prevalência e parece ser até duas vezes mais comum em mulheres que em homens (Lund et al., 2001; Leeuw, 2010).
Collin e colaboradores (2000) têm observado que pacientes com neuropatia diabética apresentam quadros de hipoalgesia, sugerindo que a perda de sensibilidade na ATM pode induzir às desordens articulares e deformidades, como as articulações de Charcot.
Sendo assim, foi realizado um estudo, no qual foi demonstrado que a fase inicial do diabetes induz hiponocicepção na ATM de ratos (Muzilli, 2014). Neste estudo, ratos Wistar tiveram diabetes induzida por uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (75 mg/Kg) e nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução do
diabetes receberam uma injeção do agente nociceptivo formalina (1,5 %, 30 µl/ATM). Os resultados demonstraram que os animais diabéticos apresentaram uma resposta comportamental nociceptiva significativamente menor (P < 0,05: Two-Way ANOVA, Teste de Bonferroni) em relação aos animais normoglicêmicos (Figura 2).
Figura 2 - Fase inicial do diabetes induz hiponocicepção na ATM.
Fonte: Muzilli, 2014*.
A injeção intra-articular do agente nociceptivo formalina (1,5%) induziu resposta nociceptiva significativamente menor nos animais diabéticos, quando comparados aos animais normoglicêmicos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou controle (P < 0,05: Two-way ANOVA, teste de Bonferroni). O símbolo (+) indica diferença estatística entre os grupos.
Com base nesse estudo surgiu a necessidade de verificar se a hipoalgesia induzida pela fase inicial do diabetes na ATM de ratos não seria resultado de uma alteração do sistema nervoso central, em particular da interação neuro-imune na região do subnúcleo caudal trigeminal.1
A ATM é inervada principalmente pelo nervo trigêmeo, cujos corpos celulares dos aferentes primários estão localizados no gânglio trigeminal, que se projetam para o complexo nuclear sensitivo do trigêmeo no tronco encefálico: núcleo sensorial principal e núcleo do trato espinhal do trigêmeo (subnúcleos oral, interpolar e caudal) (Sessle et al., 2000). A maioria das evidências indica que o subnúcleo caudal é o primeiro e principal sítio de retransmissão da informação nociceptiva trigeminal (Sessle et al., 2000).
* Muzilli AJ. Avaliação do desenvolvimento de neuropatia diabética na ATM de ratos e a relação da expressão
das isoformas da proteinoquinase C (PKC) neste processo [dissertação]. Piracicaba. Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, 2014.
Estudos em animais demonstraram que o diabetes induzido pela estreptozotocina leva a alterações de hipersensibilidade na pata dos animais e esse processo está associado a um aumento na expressão e na atividade das micróglias no sistema medular (Xu et al., 2013; Zychowska et al., 2013; Cheng et al., 2014). Sabendo que o diabetes reduz as conexões nervosas da medula óssea vinculadas a centros simpáticos, e que tal modificação está associada a mudanças na hematopoese, vinculada à formação de micróglias (Hu et al., 2013), e considerando que a ATM tem um importante componente simpático (Kido et al., 2001; Rodrigues et al., 2006; Fávaro-Moreira et al., 2012), é possível que a hipoalgesia induzida pelo diabetes na ATM de ratos esteja associada a uma diminuição na expressão e/ou na atividade das células microgliais localizadas no subnúcleo caudal trigeminal.
A melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento dos transtornos sensoriais induzidos pelo diabetes é de relevância clínica, uma vez que, pode auxiliar no diagnóstico precoce e escolha de condutas terapêuticas mais efetivas, prevenindo lesões e deterioração da articulação temporomandibular.
3 PROPOSIÇÃO
Para testar a hipótese de que a hipoalgesia induzida pelo diabetes na ATM esteja associada a uma diminuição na expressão e/ou na atividade das células microgliais no subnúcleo caudal trigeminal, foi avaliado:
(1) A hipoalgesia induzida pelo diabetes na ATM de ratos por meio de teste comportamental nociceptivo, utilizando o estimulador de fibra C-nociceptiva capsaicina;
(2) A liberação do diacilglicerol (DAG) no gânglio trigeminal de animais diabéticos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou veículo (animais normoglicêmicos), pelo método ELISA;
(3) A atividade da bomba Na+/K+ ATPase no gânglio trigeminal de animais
diabéticos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou veículo (animais normoglicêmicos), pelo método ELISA;
(4) A expressão das micróglias do subnúcleo caudal trigeminal, pelo marcador CD11b, de animais diabéticos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou veículo (animais normoglicêmicos), pelo método Western Blot.
(5) A ativação das células microgliais do subnúcleo caudal trigeminal de animais diabéticos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42, após a indução da doença ou veículo (animais normoglicêmicos), pela expressão da p38MAPK e do receptor CX3CR1 (métodos Western Blot), e também pela da liberação dos mediadores CatS e FKN (método ELISA).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Para a realização deste trabalho, foram utilizados ratos machos Wistar (± 8 semanas, ± 150 g), provenientes do CEMIB (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório) e mantidos no Biotério da FOP – UNICAMP, em grupos de 5 animais em gaiolas plásticas contendo maravalha. Em ambiente com controle de luminosidade (ciclos claro/escuro de 12 h) e temperatura (23oC +/- 1oC), tiveram alimentação e água ad
libitum. Os procedimentos experimentais realizados foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas, protocolo 3415-1 (Anexo I) e estão de acordo com as diretrizes para pesquisas com animais conscientes determinadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e pela Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP) (Zimmermann, 1983).
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Para realização dos experimentos, foram utilizados dois grupos de animais:
GRUPO A: Diabéticos
GRUPO B: Normoglicêmicos
Nos tempos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias, após a indução do diabetes ou aplicação do veículo (grupo controle), os animais foram anestesiados com isofluorano e receberam uma injeção intra-articular (ATM) de capsaicina 1,5% (30 μl). Imediatamente após as análises comportamentais, os animais foram mortos por aprofundamento de anestesia e as amostras do subnúcleo caudal coletadas para realização das análises propostas. Foram utilizados 12 animais por grupo (3 animais para compor um pool de amostra e 4 amostras por grupo); totalizando 144 animais.
GRUPO A: animais diabéticos + injeção intra-articular capsaicina 1,5% (30 μl) + coleta do gânglio e subnúcleo caudal trigeminal (Figura 3).
GRUPO B: animais normoglicêmicos + injeção intra-articular capsaicina 1,5% (30 μl) + coleta do gânglio e subnúcleo caudal trigeminal (Figura 3).
Figura 3 - Sumarização dos experimentos Grupo A e B.
Teste comportamental
4.3 INDUÇÃO DO DIABETES
O diabetes foi induzido nos animais através de uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; Sigma-Aldrich, USA) 75 mg/kg (Courteix et al., 2007), dissolvida em 0,1 M de tampão citrato (pH 4,5). A STZ é uma nitrosamida, sintetizada pela Streptomycetes achromogenes, largamente utilizada para induzir diabetes em animais de experimentação (Szkudelski, 2001). A droga causa destruição das célula beta pancreática pela captação seletiva através do transportador de glicose GLUT2, graças à molécula de glicose presente na estrutura da STZ, levando a destruição da célula beta pancreática por alterações lesivas no seu gene (Elsner, 2000). Já os animais normoglicêmicos (grupo controle) receberam uma injeção intraperitoneal apenas do veículo. Os animais foram submetidos a um jejum de 8 horas antes da injeção de STZ ou veículo, afim de evitar competição da droga com a glicose plasmática. Após uma semana, a indução do diabetes foi confirmada por dosagem do nível de glicose plasmática das amostras de sangue da veia caudal, utilizando o método enzimático glicose-oxidase (Optium Xceed; Abbott). Foram considerados para o estudo apenas os animais que apresentaram concentração plasmática de glicose maior que 300 mg/dl após jejum de 8 horas (Braga et al., 2011). Os animais foram submetidos aos experimentos 7, 14, 21, 28, 35 ou 42 dias, após a injeção de STZ ou veículo. O peso corporal dos animais e a concentração plasmática de glicose foram avaliados no momento da indução do diabetes ou aplicação do veículo e a partir de sete dias, semanalmente, até 42 dias.
Grupo 7 dias Grupo 14 dias Grupo 21 dias Grupo 28 dias Grupo 35 dias Grupo 42 dias Injeção de capsaicina 1,5% na ATM Coleta do gânglio e subnúcleo caudal trigeminal Tempo 0 30 minutos Injeção de STZ ou do veículo
4.4 TESTE COMPORTAMENTAL NOCICEPTIVO NA ATM DE RATOS
As sessões de teste foram realizadas durante a fase clara, entre 9 e 17 horas em sala silenciosa, com temperatura ambiente mantida a 25°C (Rosland, 1991). Durante o teste os animais não tiveram acesso a água ou a comida. Para minimizar o estresse durante as sessões experimentais, os animais foram previamente manipulados pelo pesquisador por um período de sete dias. Na realização das análises comportamentais, usou-se uma caixa de observação medindo 30 x 30 x 30 cm, com a base e três laterais espelhadas e a frente de vidro. Cada animal foi inicialmente colocado e mantido na caixa por dez minutos para habituar-se ao ambiente de experimentação e minimizar o estresse (Abbott et al. 1986).
4.4.1 Injeções na região da ATM
Para administração da capsaicina na região da ATM esquerda, os animais foram brevemente anestesiados por inalação de isoflurano. Em seguida, uma agulha calibre 30G, conectada a uma seringa de microlitro Hamilton (50 µl) por um tubo de polietileno P50, foi inserida na porção inferior da borda posteroinferior do arco zigomático (Figura 4), sendo avançada em direção anterior até contatar a região posterolateral do côndilo.
Figura 4 – Aplicação da injeção na articulação temporomandibular.
4.4.2 Teste comportamental
Imediatamente após a injeção intra-articular, o animal, já consciente, foi recolocado na câmara de observação (Figura 5). As respostas comportamentais, caracterizadas pelo ato de coçar a região injetada com a pata dianteira ou a traseira e pelo ato de levantar reflexamente a cabeça, foram quantificadas durante trinta minutos. O tempo em segundos que o animal permaneceu coçando a região orofacial foi quantificado através da utilização de um cronômetro, e o número de vezes que o animal levantou reflexamente a cabeça foi quantificado por um contador de células (Roveroni et al., 2001). Considerando que o ato de levantar reflexamente a cabeça seguiu um padrão uniforme de um segundo de duração, a intensidade da resposta nociceptiva foi quantificada somando-se esse comportamento ao ato de coçar a região injetada, como previamente padronizado (Roveroni et al., 2001).
Figura 5 – Caixa de observação de comportamento
Fonte: Autoria própria
4.5 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DO GÂNGLIO E SUBNÚCLEO CAUDAL TRIGEMINAL
Para remoção do subnúcleo caudal trigeminal, os ratos foram anestesiados com uretano (1 g/Kg) e alfa-cloralose (50 mg/Kg) e realizada a perfusão transcardíaca com 200 mL de solução salina (NaCl 0,9%), os encéfalos foram rapidamente removidos e congelados a – 20ºC. Em seguida, com o auxilio de
uma matriz de encéfalo, uma secção de 1 mm era retirada da porção inferior tronco encefálico, o lado esquerdo desta secção foi removido na região correspondente ao subnúcleo caudal trigenimal e congelado para as análises propostas. A descrição da região do encéfalo retirada, seguiu a do atlas de Swanson (Swanson, 2004). O subnúcleo caudal e o gânglio trigeminal uma vez removidos foram homogeneizados separadamente, em solução Tampão Fosfato Salina (PBS) contendo 0,4 M de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,5% de albumina bovina sérica (BSA), 0,1 mM de fenil-metil-sulfonil fluoreto, 0,1 mM de cloreto de benzotônico, 10 mM de EDTA e 20µl/ml de aprotinina (Sigma, USA) com auxílio de um homogeneizador de tecidos portátil (Ultra 80-II, UltraStirrer), e em seguida centrifugados (10.000 rpm/ 10 min/ 4ºC). O total de proteínas extraídas foi avaliado utilizando o kit colorimétrico para dosagem proteica BCA (Thermo Scientifi) e o sobrenadante estocado a - 20ºC para análises posteriores.
4.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS MICRÓGLIAS, p38 MAPK E DO RECEPTOR CX3CR1 (WESTERN BLOT)
As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas "overnight" a 4°C com tampão de bloqueio [PBS 5% (p/v) de leite desnatado e 0,1% Tween 20]. As membranas foram lavadas três vezes com PBS 0,1% Tween 20. Em seguida, foram incubadas em solução de PBS, contendo 5% de leite desnatado e 0,1% Tween 20, contendo anticorpo primário para detecção da expressão de micróglias (CD11b/c; GeneTex, USA; 1:1000), p38 MAPK fosforilada (GeneTex, USA; 1:1000), CX3CR1(GeneTex, USA; 1:3000) e alfa-tubulina (Santa Cruz, USA: 1:1000). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado horseradish peroxidase (HRP) específico e novamente lavadas. As membranas foram então reveladas com kit de quimioluminescência (Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare, Amershan Place, Little Chalfont, U.K.), como descrito no manual de instruções. O software Image J foi utilizado para mensuração das bandas por densidade óptica.
4.7 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DA FRACTALCINA, CATEPCINA S, DIACILGLICEROL E Na+/K+ ATPASE (ELISA)
As análises foram realizadas de acordo com especificações do fabricante dos kits utilizados. Resumidamente, placas de 96 poços foram incubadas “overnight” em temperatura de 4oC com anticorpos anti-Fractalcina (anti-FKN) de rato (0,8
g/ml). No dia seguinte, as placas foram lavadas e incubadas por duas horas com uma solução a 1% de albumina bovina no intuito de evitar ligações inespecíficas. Após esse bloqueio e lavagem das placas, as curvas-padrão em várias diluições ou as amostras (em triplicata) foram adicionadas e incubadas em temperatura ambiente por duas horas. As placas então foram lavadas três vezes com tampão e os anticorpos de detecção anti-FKN de rato biotinilados (150 ng/ml) foram adicionados (100 l/poço). Após incubação em temperatura ambiente por 2 horas, as placas foram lavadas e 100 l de estreptavidina-HRP (diluída 1:5000) foram adicionados. Após vinte minutos, 100 l de reagente colorido (1:1 - H2O2 e Tetrametilbenzidina;
R&D System, USA) foram acrescentados e as placas foram mantidas no escuro, em temperatura ambiente, por mais 20 minutos. A reação enzimática foi interrompida com 2 N H2SO4 (R&D System, USA) e as absorbâncias, determinadas em 490 nm.
Já para a análise da Catepcina S (CatS), foram adicionados 50 µl das amostras em uma placa de 96 poços. Em seguida, foram adicionados 50 µl do tampão de Reação CS em cada poço com amostra e, depois, 2 µl do CS substrato Z-VVR-AFC 10mM (concentração final de 200 µM). A placa foi incubada por uma a duas horas em temperatura de 37ºC e as absorbâncias, determinadas em 400 nm.
Para análise do DAG e da Na+/K+ ATPase, as análises também foram
realizadas de acordo com especificações do fabricante, placas de 96 poços foram sensibilizadas com anticorpos anti-DAG e anti-Na+/K+ ATPase de rato foram
utilizadas. Após a pipetagem das amostras e dos padrões, foi adicionada solução de equilíbrio. Em seguida, foi adicionado o conjugado em cada poço e incubado por uma hora a 37ºC, sob agitação. A placa foi lavada cinco vezes e 100 l de reagente colorido (Tetrametilbenzidina; BlueGene Biotech, China) foram adicionados em cada poço e as placas incubadas por dez a quinze minutos, a 37ºC. A reação enzimática foi interrompida com H2SO4 (BlueGene Biotech, China) e as absorbâncias,
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram avaliados por análise de variância a dois critérios (Two- way ANOVA). As comparações múltiplas foram feitas pelo teste de Bonferroni. Para todos os testes, o nível de significância foi estabelecido em P < 0,05. O programa GraphPad Prism 6.0 foi utilizado para a realização dos cálculos estatísticos.
5 RESULTADOS
Todos os animais foram pesados e a glicemia quantificada imediatamente antes da indução do diabetes ou aplicação do veículo. Durante o experimento foram feitas medidas da glicemia e do peso corporal após um jejum de 8 horas. Conforme demonstrado na Figura 6, os animais diabéticos demonstraram aumento significativo da concentração plasmática de glicose (Figura 6A), assim como uma perda progressiva de peso (Figura 6B) ao longo do tempo, confirmando a indução e manutenção da doença.
Figura 6 - Dosagem de Glicemia (mg/dl) e Peso Corporal (g) em relação ao tempo em animais diabéticos e normoglicêmicos.
(A) Os animais diabéticos apresentaram concentração de glicose plasmática acima de 300 mg/dl 7
dias após a indução do diabetes. Os animais diabéticos apresentaram uma concentração de glicose
T e m p o ( d ia s ) G li c e m ia m g /d L 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * * ( A ) T e m p o ( d ia s ) P e s o ( g ) 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * ( B )
plasmática significativamente maior em relação aos normoglicêmicos em todos os tempos testados (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) Foi observada uma perda significativa (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni) e progressiva do peso dos animais diabéticos 14 dias após a indução do diabetes. O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
As análises comportamentais demonstraram que os animais diabéticos apresentaram hiponocicepção na ATM 7 dias após a indução do diabetes. Esta hiponocicepção foi observada até 42 dias após a indução da doença (Figura 7).
Figura 7 – Avaliação da hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM ratos.
A injeção intra-articular de capsaicina (1,5%) induziu resposta nociceptiva significativamente menor nos animais diabéticos quando comparados aos animais normoglicêmicos nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após a indução da doença ou controle (P < 0,05: Two-way ANOVA, teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
Para avaliar se a hiponocicepção induzida pelo diabetes está vinculada a alterações no componente neuronal periférico da ATM foi analisado a liberação do DAG e da Na+/K+ ATPase (Figura 8). Os resultados demonstraram que o diabetes
reduz significativamente a ativação do DAG (Figura 8A) e da Na+/K+ ATPase (Figura
8B) no gânglio trigeminal, quando comparados aos animais normoglicêmicos ao longo do experimento. Estes resultados sugerem que a redução da liberação da Na+/K+ ATPase pode estar alterando o potencial de repouso de membrana dos
neurônios aferentes primários resultando em uma hiperpolarização desta fibras. Considerando que o DAG é um importante sinalizador intracelular envolvido com alterações neurovasculares (Evcimen e King, 2007), é possível hipotetizar que a
T e m p o ( d ia s ) C o m p o rt a m e n to n o c ic e p ti v o ( s ) 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 %
diminuição da liberação da Na+/K+ ATPase está diretamente relacionada com
diminuição do DAG.
Figura 8 – O Diabetes reduz a ativação do diacilglicerol e da Na+/K+ ATPase no gânglio
trigeminal.
(A) O diabetes diminuiu de forma significativa a ativação do DAG no gânglio trigeminal nos tempos
de 7, 14, 21, 28, 35 dias. (B) E também, da Na+/K+ ATPase no gânglio trigeminal nos tempos de 7,
21, 28, 35 e 42 dias quando comparado aos animais normoglicêmicos (P < 0,05: Two-way ANOVA,
Teste de Bonferroni). O símbolo (*, #) indica diferença estatística entre os grupos.
T e m p o ( d ia s ) D ia c il g li c e ro l (n g /m l) g â n g li o t ri g e m in a l 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 2 4 6 8 1 0 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * # * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 % ( A ) T e m p o ( d ia s ) N a + /K + A T P a s e ( n g /m l) g â n g li o t ri g e m in a l 7 1 4 2 1 2 8 3 5 4 2 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 N o r m o g lic ê m ic o s D ia b é tic o s * * * * * c a p s a ic in a 1 ,5 % ( B )
Para avaliar se a hiponocicepção induzida pelo diabetes está vinculada a alterações no componente neuronal central do sistema trigeminal foi avaliado a expressão das micróglias, a ativação da p38-MAPK fosforilada (P-p38MAPK), a expressão do receptor da FKN CX3CR1, liberação de CatS e FNK.
O diabetes não alterou a ativação das micróglias localizadas no subnúcleo caudal trigeminal (Figura 9A). Apesar de observar-se em ratos diabéticos uma diminuição significativa pontual na expressão da P-p38MAPK quando comparado com os animais normoglicêmicos (Figura 9B), ao final dos experimentos não é observada diferença entre os grupos.
Figura 9 - Avaliação da expressão e atividade das micróglias no subnúcleo caudal trigeminal em animais diabéticos.
(A) Não houve diferença entre os grupos na expressão das micróglias (CD11b) no subnúcleo caudal
trigeminal (P < 0,05: ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) O diabetes reduziu significativamente a expressão da P-p38MAPK nos dias 7, 21, 28 e 35 dias (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
A literatura tem demonstrado que quando a via p38MAPK é ativada nas micróglicas, a protease CatS é liberada. A CatS cliva a FKN que libera sua porção solúves, ativando o seu receptor CX3CR1. O receptor CX3CR1 promove liberação de mediadores inflamatórios pela micróglia resultando em uma sensibilização dos neurônios (Clark and Malcangio, 2011). Sendo assim, para confirmar que a hiponocicepção induzida pelo diabetes é independente do SNC, foi avaliado a liberação de CatS, FKN e expressão do receptor CX3CR1 no subnúcleo caudal trigeminal. Os resultados demonstram que não houve diferença estatisticamente significativa na liberação de CatS entre diabéticos e normoglicêmicos com exceção do tempo de 28 dias (Figura 10).
Figura 10 – Avaliação da liberação da Catepcina S no subnúcleo caudal trigeminal de animais diabéticos.
Não houve diferença estatisticamente significativa na liberação de CatS dos animais diabéticos
quando comparado a animais normoglicêmicos, apenas no tempo de 28 dias (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos.
Os animais diabéticos apresentaram aumento na liberação da FKN no subnúcleo caudal trigeminal nos tempos 14 e 28 dias quando comparado ao animais
normoglicêmicos. No entanto, os animais normoglicêmicos apresentaram aumentos significativo na liberação da FKN quando comparado aos animais diabéticos (Figura 11A). Quando avaliado a expressão dos receptores da FKN, o CX3CR1, não foi observado diferença entre os grupos testados (Figura 11B). Em conjunto, este dados sugerem que o desenvolvimento da doença diabetes não altera de forma significativa a expressão e atividade das micróglias no subnúcleo caudal trigeminal. Sendo assim, pode ser sugerido que a hiponocicepção induzida pelo diabetes na ATM de ratos é independente de alterações no SNC, fortalecendo a hipótese de que as alterações neurais induzidas pelo diabetes ocorre no Sistema Nervoso Periférico.
Figura 11 – Avaliação da liberação de FKN e expressão do receptor CX3CR1 no subnúcleo
(A) Os animais diabéticos apresentaram aumento significativo na liberação da FKN nos tempos 14 e
21 dias quando comparados aos animais diabéticos. Os animais normoglicêmicos apresentaram
aumento na liberação da FKN no tempo 42 dias. O símbolo (*,#) indica diferença estatística entre os
grupos (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). (B) Não houve diferença estatística entre os grupos na expressão do receptor CXC3R1. O símbolo (*) indica diferença estatística entre os grupos (P < 0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni).
6 DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou que a indução do diabetes pela STZ, em ratos, resulta em alterações neurais na porção periférica do sistema trigeminal desenvolvendo uma hiponocicepção na ATM.
A indução do diabetes pela STZ é um modelo experimental comumente utilizado para avaliação das alterações nociceptivas induzidas pelo diabetes (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013). A STZ, uma nitrosamida, é um antibiótico de largo espectro com propriedades antitumorais e com toxicidade que promove como efeito a destruição das células beta-pancreáticas, resultando na deficiência da produção de insulina e, consequentemente, no aumento dos níveis plasmáticos de glicose (Doi, 1975). A indução de diabetes pela STZ em roedores induz quadros de hipernocicepção na pata (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013; Cheng et al., 2014) e redução da condução do nervo caudal (Murakami et al., 2012).
Considerando as estruturas orofaciais, a literatura tem relatado que o diabetes altera a homeostasia desses tecidos (Troger et al., 1999; Colin et al, 2000; Braga et al., 2001; Arap et al., 2011), no entanto o número de estudos é escasso e os resultados contraditórios.
Este estudo demonstrou que a injeção intraperitoneal de STZ induziu o diabetes nos ratos resultando em uma hiponocicepção na ATM. Em contrapartida, Rodella e colaboradores (2000) demonstraram que a fase inicial do diabetes induz hipernocicepção térmica facial, 8 a 12 semanas após a injeção da STZ; enquanto que Nones e colaboradores (2013) não observaram diferença na estimulação térmica e tátil orofacial na fase inicial do diabetes. A diferença entre os resultados desses estudos pode ser explicada pela variabilidade de técnicas e tecidos utilizados para a avaliação.
Os estudos avaliaram regiões distintas: tecido subcutâneos (face e lábio) e tecidos profundos (ATM), predominantemente inervados por diferentes subtipos de neurônios aferentes primários. Devido ao fato de as inervações de tecido profundo induzirem uma maior ativação na excitabilidade de neurônios centrais em relação às inervações de tecidos cutâneos, maiores distúrbios sensoriais podem ocorrer em condições dolorosas, envolvendo tecidos profundos (Imbe et al., 2001). Além do mais, já foi demonstrado que os tecidos da ATM são mais sensíveis a processos
