Análise estrutural das formulações acrescidas de PR

4.2.4.1. Microscopia de luz polarizada

Colocou-se uma pequena amostra das formulações nas lâminas de vidro as quais foram cobertas por uma lamínula. Em seguida, as formulações foram analisadas no microscópio de luz polarizada (Microscópio de luz polarizada – TYPE 102M – Motic) em temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) nos tempos 24 horas e 30 dias, em estufa (37 ± 2 oC) e geladeira (5 ± 2 oC) após 30 dias de manipulação. Avaliou-se a presença de anisotropia, com o auxílio da polarização, sendo este um indicativo da presença dos cristais líquidos.

4.2.4.2. Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS)

Os estudos de SAXS foram realizados na estação de medidas D11-A SAS do Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS), em Campinas-SP. A linha é equipada com um monocromador do tipo Si (111), com comprimento de onda (λ) de 1.408 Å, uma câmara de ionização, um detector vertical localizado a 858,45 mm da amostra e um analisador multicanal para registrar a intensidade do espalhamento.

O espalhamento por partículas existentes no sistema sem amostra foi subtraído da intensidade total da amostra. As intensidades de todas as amostras foram medidas em unidades relativas, mas para uma comparação quantitativa, as medidas foram normalizadas nas mesmas condições experimentais.

Como o feixe de raios-X incidente pontua no plano de detecção e na faixa de resolução do detector, não foi necessária realização de desconvolução das curvas de intensidade (MEZZALIRA, 2005).

4.2.4.3. Determinação do comportamento reológico

As formulações selecionadas foram analisadas por medidas reológicas utilizando-se reômetro de tensão controlada Carri Med CSL 100 (TA Instruments), modelo CLS 100, com dispositivo placa – placa de 20 mm de diâmetro. A distância entre a placa e o cone foi de 200 µm e a temperatura foi mantida constante a 25 oC com o auxílio de um dispositivo “Peltier”.

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Marlus Chorilli

As propriedades reológicas dos sistemas foram avaliadas por ensaios de escoamento e por ensaios mecânico-dinâmicos ou de oscilação.

4.2.4.3.1. Ensaios de escoamento

No ensaio de escoamento, realizou-se um estudo da tensão de cisalhamento em função da velocidade de cisalhamento na região de 0 a 30 s-1.

4.2.4.3.2. Ensaios mecânico-dinâmicos ou de oscilação

Nos ensaios reológicos por solicitação oscilatória, as medidas foram realizadas em função da freqüência (0,01 – 2 Hz), aplicando uma tensão de 1 Pa.

4.2.5. Controle de qualidade microbiológico

As amostras foram avaliadas levando-se em consideração a Resolução 481/99 (BRASIL, 1999) e o fato de não conterem conservantes. Realizou-se a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios (bactérias e fungos) pela técnica de semeadura em profundidade (pour plate) e a pesquisa de bactérias patogênicas específicas (KONEMAN et al., 2001; PINTO et al., 2003; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).

Desse modo, alíquotas de 10g das formulações selecionadas foram acrescentadas em meios de cultura específicos, determinando-se o número total de microrganismos e a presença de Salmonella sp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Nestas análises, foram utilizadas amostras representativas do conteúdo dos produtos conforme métodos preconizados na United States Pharmacopeia (USP XXVII, 2004) e por CARTURAN (1999) no Guia ABC de Microbiologia, da Associação Brasileira de Cosmetologia (ABC). As análises foram feitas em triplicata para cada uma das formulações. As formulações sujeitas ao controle microbiológico foram armazenadas em recipientes assepticamente limpos, longe de umidade e luz, em locais frescos e arejados, segundo a FARMACOPÉIA BRASILEIRA (1988).

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Marlus Chorilli

4.2.5.1. Validação do método de estimativa do número de microrganismos viáveis

Em placas de Petri previamente esterilizadas, foram adicionadas alíquotas de 1 mL das diluições 1:2 ou 1:10 das amostras em solução salina, 0,5 mL de suspensão microbiana (cerca de 102 UFC/mL) de cada microrganismo padrão estudado e 15 mL de TSA. O método foi realizado em duplicata para cada microrganismo e diluição (BOU-CHACRA et al., 2005).

O controle foi determinado simultaneamente, transferindo-se 0,5 mL de cada suspensão microbiana para placas contendo 15 mL de TSA (BOU-CHACRA et al., 2005).

4.2.5.2. Estimativa do número de microrganismos viáveis

Inicialmente, realizou-se a assepsia das embalagens das formulações com etanol 70%, seguindo-se pela pesagem de 10g da amostra em um béquer estéril. Foi realizada a diluição, transferindo-se para erlenmeyer estéril com 90 mL de meio Letheen (diluição 10-1), o qual foi homogeneizado em vórtex. Deste primeiro frasco, transferiram-se 10 mL para o segundo, contendo 90 mL de salina estéril (diluição 10-2), homogeneizando novamente. Prosseguiu-se com a transferência de 1 mL de cada diluição, acrescentando-se 15 a 20 mL de meio ágar soja-caseína (TSA) estéril, resfriado a uma temperatura aproximada de 45°C, em duas placas de cada diluição e ágar Sabouraud (AS) nas outras duas placas. Os ensaios foram conduzidos em triplicata.

A homogeneização foi realizada e, após a solidifcação, as placas contendo o meio TSA foram incubadas por 24 horas a 36 ± 1 °C (crescimento de bactérias) e aquelas com AS, a 27 ± 1 °C por 7 dias (crescimento de bolores e leveduras). Após o período de incubação, fez-se a contagem das colônias crescidas nestes meios de cultura, calculando-se posteriormente o número de microrganismos/g do produto multiplicando-se pela diluição utilizada, os quais foram expressos em UFC/g.

4.2.5.3. Pesquisa de Salmonella sp. e Escherichia coli

Transferiram-se, assepticamente, 10 g de amostra para 90 mL de caldo lactosado para a pesquisa de Salmonella sp. e E. coli.

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Marlus Chorilli

O caldo foi incubado a 36 ± 1 ºC durante 24 horas. Após esse período, o meio foi observado quanto ao crescimento. No segundo dia, transferiu-se 1 mL do caldo lactosado para dois tubos contendo caldo tetrationato e caldo selenito cistina, que foram incubados a 36 ± 1 ºC durante 24 horas, para a pesquisa de Salmonella sp. Após esse período semeou-se, com uma alça de platina, amostra do caldo tetrationato para um tubo contendo ágar inclinado verde brilhante e três placas de Petri contendo ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) e ágar bismuto sulfito. Procedeu-se da mesma forma com a amostra inoculada no caldo selenito cistina e transferiu-se para os três meios, que foram incubados a 36 ± 1 ºC durante 24 horas. Observou- se o crescimento e as características das colônias. As colônias suspeitas foram semeadas com alça reta em tubo contendo ágar inclinado ferro-três açúcares (TSI) e incubadas a 37 ºC durante 24 horas.

Para a pesquisa de E. coli, transferiu-se 1 mL do caldo lactosado para a placa de Petri contendo ágar MacConkey. Incubou-se a 36 ± 1 ºC durante 24 horas. Observou-se o crescimento e as características das colônias. As colônias suspeitas foram semeadas com alça de platina em placas de Petri contendo ágar eosina azul de metileno (EMB). Incubou-se a 36 ± 1 ºC durante 24 horas.

4.2.5.4. Pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa

Transferiram-se assepticamente 10 g de amostra para 90 mL de caldo soja-caseína, para a pesquisa de S. aureus e P. aeruginosa. O caldo foi incubado a 36 ± 1 ºC durante 24 a 48 horas. Após este período, o meio foi observado quanto ao crescimento. Semeou-se em placas de Petri contendo ágar Vogel Johnson para a pesquisa de S. aureus, e em placas de ágar cetrimida para a pesquisa de P. aeruginosa. Incubou-se a 36 ± 1 ºC durante 24 horas. Depois, observou-se o crescimento e as características das colônias.

4.2.5.5. Avaliação da eficácia das formulações nanoestruturadas como sistema conservante

Com a finalidade de se avaliar a eficácia das formulações como sistema conservante, efetuou-se o teste de desafio e cálculo do valor D.

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Marlus Chorilli

Para a realização destes experimentos, foi necessário inicialmente realizar ensaios preliminares para padronização do inóculo dos diferentes microrganismos usados, de modo a se quantificar o número de células em torno de 106 -107/microrganismos/g nas formulações.

4.2.5.5.1. Teste de desafio

Foram inoculados 106 células/g da amostra de cada um dos microrganismos-teste (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans e A. niger) cultivados previamente em caldo soja caseína (TSB) por 6 horas a 36 ± 1 oC (bactérias) e caldo Sabouraud a 27 ± 1 oC (fungos), individualmente, em 10g de cada uma das amostras (F1, F1v, F4 e F4v). Imediatamente após a

inoculação, retirou-se amostras de 1g de cada uma das formulações nanoestruturadas contaminadas (tempo 0), diluindo-se em caldo Letheen e a seguir em tubos com solução salina até atingir a concentração necessária para a contagem de colônias, sendo posteriormente semeados 100 µL na superfície de placas contendo TSA e AS (PINTO et al., 2003; USP XXVII, 2004).

Após incubação a 36 ± 1 o_{C e 27 ± 1} o_{C, respectivamente, para bactérias e fungos,}

retirou-se amostras nos tempos de 7, 14 e 28 dias de incubação, realizando-se a contagem de colônias, sendo os valores expressos em UFC/g (PINTO et al., 2003; USP XXVII, 2004).

Os ensaios foram realizados em duplicata, utilizando-se como controle negativo creme Lanette _{sem conservante e como controle positivo, creme Lanette} _{com os conservantes}

nipagin (0,18%), nipazol (0,02%) e imidazolidinil uréia (0,5%).

4.2.5.5.2. Cálculo do valor D

Foram inoculados 106 células/g da amostra de cada um dos microrganismos-teste (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans e A. niger) cultivados previamente em caldo soja caseína (TSB) por 6 horas a 36 ± 1 oC (bactérias) e caldo Sabouraud a 27 ± 1 oC (fungos), individualmente, em 10g de cada uma das amostras (F1, F1v, F4 e F4v). Imediatamente após a

inoculação, retirou-se amostras de 1g de cada uma das formulações nanoestruturadas contaminadas (tempo 0), diluindo-se em caldo Letheen e a seguir em tubos com solução salina até atingir a concentração necessária para a contagem de colônias, sendo

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Marlus Chorilli

posteriormente semeados 100 µL na superfície de placas contendo TSA e AS (PINTO et al., 2003; USP XXVII, 2004).

Após incubação a 36 ± 1 oC e 27 ± 1 oC, respectivamente, para bactérias e fungos, realizou-se a contagem de colônias, sendo os valores expressos em UFC/g. As contagens foram realizadas nos tempos de incubação de 2, 24 e 48 horas para bactérias e 4, 24, 48 horas e 7 dias para fungos, na temperatura ambiente. As modificações realizadas em relação ao protocolo publicado pela USP XXVII é que não foram feitas contagens nos tempos de 4 horas (bactérias) e 8 horas (fungos) (PINTO et al.., 2003; USP XXVII, 2004).

Os ensaios foram realizados em duplicata, utilizando-se como controle negativo, creme Lanette _{sem conservante e como controle positivo, creme Lanette} _{com os}

conservantes nipagin (0,18%), nipazol (0,02%) e imidazolidinil uréia (0,5%).