Estudo de irritação das formulações tópicas

O estudo de irritabilidade dérmica primária e análise histológica foram realizados para as formulações F1, F1v, F4 e F4v descritas na Tabela 2. Este estudo teve parecer favorável para

execução pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP (Parecer no 10/2007) – Anexo 1.

4.2.6.1. Irritação dérmica primária

4.2.6.1.1. Animais

O estudo do efeito das formulações nanoestruturadas na pele foi realizado em coelhos. Um dia antes de iniciar os tratamentos, foi realizada a tricotomia de cinco áreas no dorso dos animais, com máquina de tosquear no 0, evitando lesão da epiderme, que poderia alterar as análises realizadas.

Todas as regras básicas de bioterismo e manipulação dos animais foram rigorosamente observadas, principalmente no que se refere às condições ambientais dos animais, desde parâmetros macro, como a sala, temperatura, umidade, ciclo claro/escuro, como parâmetros micro–dimensão das caixas/gaiolas e troca de cama (MARONA, 2003).

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Marlus Chorilli

4.2.6.1.2. Áreas de tratamento

As áreas previamente tricotomizadas do dorso dos animais foram divididas em: 1) Controle;

2) Tratamento com F1;

3) Tratamento com F1v;

4) Tratamento com F4;

5) Tratamento com F4v.

As áreas possuíam 2 cm² e receberam 1,5 g de formulação, exceto a área controle, que não recebeu tratamento.

4.2.6.1.3. Protocolo para verificação de irritação dérmica primária

Os testes de irritação dérmica primária seguiram a metodologia proposta pelo Guia para Avaliação de Segurança de Produtos Cosméticos (2003).

Este teste consiste de uma aplicação única dos tratamentos e oclusão com um filme de PVC por 4 horas. Durante este período, os animais foram mantidos em caixas individuais. Após 4 horas, o produto foi retirado e os animais foram mantidos em gaiolas com livre acesso à água e ração. Realizou-se a graduação de eritema e edema das áreas nos tempos 4 e 72 horas após a aplicação, segundo a escala de Draize.

4.2.6.1.3.1. Método de avaliação

Para a avaliação do edema e eritema empregou-se a escala de Draize, que avalia subjetivamente o eritema e edema presentes na pele, com uma graduação de 0 a 4 graus (HOFFMANN et al., 2005). Realizou-se um estudo cego simples, com as avaliações realizadas por dois pesquisadores diferentes.

Formação de eritema:

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Grau 1 – eritema leve: a pele apresenta-se levemente avermelhada, em toda a área- teste;

Grau 2 – eritema moderado: a pele apresenta-se vermelha, geralmente em toda a área- teste;

Grau 3 – eritema definido: a pele apresenta-se com vermelhidão intenso e difuso em toda a área-teste;

Grau 4 – eritema severo: a pele apresenta-se vermelho-escura, com leve formação de escaras (injúrias em profundidade).

Formação do edema:

Grau 0 – nenhum edema: o valor do edema é igual a 0 (zero);

Grau 1 – edema leve: o valor do edema deve estar compreendido entre 0,25 mm e 0,49 mm;

Grau 2 – edema moderado: o valor do edema deve estar compreendido entre 0,5 mm e 0,74 mm;

Grau 3 – edema definido: o valor do edema deve estar compreendido entre 0,75 mm e 1 mm;

Grau 4 – edema severo: o valor do edema é maior do que 1 mm, podendo às vezes ser maior do que a área de exposição.

4.2.6.2. Análise histológica

4.2.6.2.1. Grupos experimentais

O estudo do efeito das formulações selecionadas na pele foi realizado em coelhos mantidos em gaiolas com livre acesso à água e ração. Foram utilizados 5 animais, conforme o Guia para Avaliação de Segurança de Produtos Cosméticos (2003). Foram realizadas as tricotomias de cinco áreas no dorso de cada animal, as quais receberam os seguintes tratamentos durante 15 dias:

1) Controle;

2) Tratamento com F1;

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4) Tratamento com F4;

5) Tratamento com F4v.

4.2.6.2.2. Contenção dos animais

Os animais permaneceram em caixa de contenção que permitiu o tratamento no dorso, de modo a acomodá-los confortavelmente sem que ficassem estressados durante o tratamento.

A parte frontal da caixa apresentava uma abertura com inclinação de 45o, onde se encaixava a cabeça do animal, para maior conforto do coelho (Figura 25). A parte superior da caixa se apresentou quase que totalmente vazada, para permitir o tratamento na região dorsal do animal (Figura 26).

Figura 25. Caixa de contenção com Figura 26. Caixa de contenção com

inclinação de 45º na parte frontal. parte superior vazada.

4.2.6.2.3. Processamento histológico

Após anestesia dos animais com cloridrato de xilazina/cloridrato de ketamina e sacrifício em câmera de CO2, as áreas tratadas foram removidas e fixadas em solução de

Bouin por 48 horas e tratadas convenientemente para inclusão em Histosec_{. Foram obtidos 5}

cortes histológicos não seriados de 5 µm de profundidade para cada lâmina, sendo três lâminas por área de tratamento. As lâminas foram processadas de forma a obter uma coloração em hematoxilina e eosina (HE) para posterior análise histométrica e histopatológica.

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4.2.6.2.4. Análise histométrica e histopatológica

4.2.6.2.4.1. Análise histométrica

Para essa análise utilizou-se ocular milimetrada de 10x (Zeiss) e objetiva de 40x, com a qual foi medida a espessura da epiderme e da camada córnea em 30 áreas escolhidas aleatoriamente para cada área de tratamento. Para a epiderme, obteve-se medidas em áreas planas, sem muitas papilas dérmicas, através da distância entre a membrana basal até a borda externa da camada córnea. A camada córnea foi mensurada em áreas onde se apresentava bem aderida à epiderme e foi considerada a distância entre a porção superior da camada granulosa até a superfície (POLACOW et al., 2004).

A partir dessas medidas, foi realizada a correção do coeficiente micrométrico, considerando que foi utilizada objetiva de 40x, e obtida a média e o desvio padrão de cada grupo experimental. A análise estatística foi realizada utilizando-se um software (programa GMC, versão 7.0) elaborado por MAIA CAMPOS (1998). O nível de significância considerado nos testes estatísticos foi de 5% (p< 0,05).

4.2.6.2.4.2. Análise histopatológica

Esta análise permitiu a determinação do número de fibroblastos e leucócitos, utilizando-se ocular reticulada da Zeiss e objetiva de 40x em uma área de 250 µm2 (MANDARIM-DE-LACERDA, 1994). Para cada grupo experimental, foram obtidos 5 cortes não seriados por lâmina, sendo obtidas 3 lâminas. Quantificou-se 6 áreas por grupo experimental, sempre na região da derme papilar. Portanto, por animal, em cada tratamento, obteve-se uma área total de 22500 µm2 (250 µm2 x 6 áreas x 15 cortes).

Dos resultados referentes aos estudos histopatológicos, obteve-se a média e o desvio padrão de cada tipo celular para cada tratamento e realizou-se a análise estatística utilizando um software (programa GMC, versão 7.0) elaborado por MAIA CAMPOS (1998). O nível de significância considerado nos testes estatísticos foi de 5% (p< 0,05).

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