Em relação à análise da expressão gênica, os resultados são diferentes quando comparados de acordo com o tempo (p=0,0003; ANOVA) e de acordo com os diferentes tipos celulares (p=0,0223; ANOVA). E de fato, a expressão variou drasticamente nos diferentes tempos analisados na cinética viral, no entanto em todas as linhagens essa diferença não foi significativa na comparação de tempo, linhagem e gene analisado (Tabela 3). No entanto foi observada uma tendência ao aumento da expressão de TP53 e uma diminuição de NRAS tanto na linhagem de células TPC-1 quanto na linhagem de células BCPAP inoculadas pelo EBV, especialmente após 48 horas após a inoculação viral (Figura 14 eFigura 15). Em contraste, na linhagem 8505C foi observado um aumento da expressão de NRAS e KRAS e uma diminuição de TP53 (Figura 16). Além disso, a expressão de KRAS e HRAS variou durante o tempo e de acordo com o tipo celular analisados e não foi observado nenhuma tendência nas células inoculadas.
42
Tabela 3 - Análise da expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS no grupo de células inoculadas pelo EBV versus grupo controle de células não inoculadas. Valores expressos em médias e desvio padrão das unidades de expressão relativa (Fold change).
TP53 NRAS KRAS HRAS
Linhagem Tempo após inoculação Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p T P C -1 T0 1,07±0,17 1,03±0,33 NS 0,85±0,08 1,65±0,27 NS 1,32±0,34 1,28±0,69 NS 1,21±0,76 0,87±0,32 NS T4 1,17±0,4 1,05±0,04 1,42±0,29 1,47±0,15 1,13±0,33 1,27±0,33 1,23±0,82 1,11±0,38 T12 1,32±0,26 1,12±0,13 1,25±0,41 1,43±0,18 1,63±0,42 0,93±0,36 1,34±0,36 1,19±0,22 T24 1,68±0,72 1,23±1,11 1,27±0,62 1,34±0,63 1,95±1,15 1,09±0,99 1,53±1,25 0,75±0,39 T48 2,56±3,73 1,4±1,29 6,03±3,90 0,33±0,34 0,37±0,35 1,83±2,08 0,43±0,06 1,64±0,92 BCPA P T0 1,37±0,35 0,78±0,61 NS 1,71±1,06 1,4±1,12 NS 1,17±0,58 1,25±0,09 NS 1,23±0,39 1,01±0,27 NS T4 0,75±0,34 1,54±1,96 1,84±1,09 2,97±3,23 0,66±0,42 3,79±5,08 1,1±0,87 1,99±2,50 T12 1,24±1,04 0,41±0,34 5,16±6,98 0,86±0,59 2,88±4,10 0,56±0,35 1,49±0,23 0,71±0,20 T24 1,5±0,31 0,36±0,29 2,97±1,59 0,78±0,47 1,45±0,71 0,63±0,13 1,81±1,19 0,90±0,13 T48 1,76±1,15 1,27±1,14 1,53±0,99 1,15±0,37 0,16±0,19 1,54±0,45 0,70±0,37 1,56±0,66 85 05 C T0 0,87±0,55 1,72±1,11 NS 0,22±0,19 2,68±1,09 NS 3,76±3,22 1,38±0,76 NS 3,12±2,29 0,79±0,39 NS T4 0,82±0,76 1,48±0,51 2,84±2,56 0,59±0,15 1,34±0,80 1,07±0,52 0,41±0,33 0,86±0,7 T12 0,27±0,14 1,17±0,92 4,43±3,55 1,22±0,40 3,96±3,55 2,65±2,87 0,67±0,74 1,68±2,22 T24 1,93±2,32 1,04±1,13 5,91±3,28 0,45±0,25 3,11±2,27 0,75±0,67 0,88±0,29 0,97±1,31 T48 0,63±0,76 0,85±0,53 3,54±2,61 0,65±0,48 1,20±0,86 1,02±0,84 1,89±2,08 0,82±0,44 * NS = Resultados não significativos (p<0,05) analisados por Mann-Whitney.
43
Figura 14 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem TPC-1 na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
44
Figura 15 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem BCPAP na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
45
Figura 16 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem 8505C na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
46
5. DISCUSSÃO
Este trabalho foi pioneiro na investigação dos efeitos da presença do EBV nas linhagens de células neoplásicas tireoidianas, tanto na morfologia, quanto na expressão dos oncogenes da família RAS e do gene supressor tumoral TP53. Entretanto dois outros autores já investigaram a relação da presença do vírus EBV e mutações em genes da família RAS em outras neoplasias: Zaravinos e colaboradores na Grécia (88) e Sole e colaboradores da Espanha (89). Zaravinos e colaboradores (88) analisaram a presença do papiloma vírus humano (HPV), cytomegalovirus (CMV), herpes simplex virus (HSV) e Epstein-Barr virus (EBV) em amostras de biópsia de pele pela técnica de PCR convencional e correlacionaram com a presença de mutações do gene RAS. No entanto, não encontraram nenhuma amostra positiva para a presença de EBV. Três amostras, infectadas pelo HPV e CMV, possuíam mutação em HRAS (88). Sole e colaboradores (89) analisaram 37 pacientes portadores de câncer cólon retal, dentre os quais 17 (46%) eram EBV positivos. Entre os pacientes infetados pelo EBV, 5 (29%) possuíam mutação de KRAS. Os autores sugeriram que a detecção do status viral pode auxiliar no estadiamento dos tumores de cólon retal e ainda que haja associação do status viral com a presença de mutações em KRAS (89).
Na análise da permissividade das células neoplásicas tireoidianas ao EBV, todas as linhagens permitiram a entrada do vírus, demonstrando que as células tireoidianas são permissivas ao EBV, corroborando os achados anteriores de nosso grupo (24).
A infecção do EBV nas células tireoidianas demonstra que é possível que o vírus infecte outras células as quais normalmente não possui tropismo natural. De fato, o EBV possui tropismo por linfócitos B (19), mas sabemos que ele pode infectar células epiteliais, como é o caso em carcinomas de nasofaringe que possuem alta taxa de infectividade por EBV (16, 19, 90, 91). Alguns autores preconizam que o vírus seja usado até mesmo como marcador para esta neoplasia (19, 92). A literatura sugere que uma cepa específica do EBV, a cepa M81 isolada de um carcinoma de nasofaringe de um paciente chinês (93), possui o chamado tropismo reverso, isto é, tem habilidade viral reduzida em linfócitos B e alta propensão em infectar células epiteliais (31). No entanto, a cepa utilizada em nosso trabalho foi a B95-8, que infecta
47
linfócitos B mas dificilmente infecta células epiteliais (19, 24, 31), demonstrando que também essa cepa é capaz de infectar células epiteliais.
As linhagens neoplásicas tireoidianas não só foram permissivas à entrada do EBV como também o vírus foi capaz de causar efeitos citopáticos nas células da linhagem TPC-1 e 8505C. A linhagem BCPAP permitiu a entrada do vírus, mas não houve nenhuma alteração morfológica na célula, provavelmente pelo baixo número de passagens às cegas, pois como essa célula se desenvolve mais lentamente do que as outras talvez o vírus demore um pouco mais para se adaptar a ela. As alterações causadas pelo EBV nas linhagens TPC-1 e 8505C foram as mesmas: formação de sincícios celulares e perda da adesão celular com perda da monocamada, o que é compatível com as alterações in vitro causada pelo EBV nos linfócitos (15, 94), inclusive compatível com as alterações causadas pelo vírus na linhagem celular de linfócitos imortalizados produtores de EBV, que recebe o mesmo nome da cepa, a B95-8 (15, 94). Essa ação citopática poderia contribuir para a contenção da progressão de alguns tumores tireoidianos. De fato, a TPC1 é uma linhagem derivada do mais comum tipo histológico de CDT encontrado na população, o CPT. Sabemos que uma grande parte dos CPT não progride clinicamente, particularmente os tumores pequenos (95). Sendo assim, a identificação de fatores relacionados à contenção da progressão destes tumores seria de vital importância clinico-epidemiológica.
Em relação à análise da cinética da carga viral, tanto a linhagem BCPAP quanto a 8505C se comportaram de maneira similar, pois o vírus passou por um curto estágio de eclipse, que é quando a carga viral extracelular diminui enquanto o vírus se replica no interior da célula hospedeira, em ambas as células esse período foi de 4 horas no primeiro estágio de eclipse e na célula 8505C o segundo estágio de eclipse foi de 12 horas e na BCPAP foi de cerca de 20 horas produzindo mais de 11 milhões de partículas virais. A literatura mostra que o estágio de eclipse dos herpesvirus pode chegar até 40 horas (15, 81), sendo assim a replicação do EBV nas linhagens tireoidianas foi mais rápida do que em outras células. Em contraste, na linhagem TPC- 1 a carga viral do EBV vai diminuindo com o passar do tempo, demonstrando uma curva de crescimento de múltiplos passos (termo do inglês: multistep virus growth
curve) o que pode indicar que o vírus estabeleceu latência na célula TPC-1 derivada
48
população. Este é o primeiro trabalho a relatar o estabelecimento de latência do EBV nas células tireoidianas in vitro.
Em geral, estudos com o EBV in vitro, realizam experimentos de cinética viral com um maior tempo de análise, com mais pontos como T72 por exemplo (15, 79, 94). No entanto, as linhagens de células neoplásicas que utilizamos, por já conterem alterações genéticas, se multiplicam muito rápido e não suportam ficar muitos dias em experimento. Em contrapartida, observamos que, mesmo com apenas dois dias de experimento (até T48), já houve alterações provocadas pelo vírus, sugerindo que ele realmente desempenha papel importante no processo tumorigenico.
Em relação à análise da expressão gênica, nossos dados demonstram que a expressão dos genes da família RAS (KRAS, NRAS e HRAS) e do gene supressor tumoral TP53 varia nos diferentes tempos de análise.
A expressão gênica na linhagem TPC-1 foi maior no tempo T24, com hiperexpressão inclusive de TP53, o que já era esperado pois como um gene supressor tumoral estava exercendo seu papel (96) justamente quando os oncogenes também estavam hiperexpressos. Em contrapartida, nas células do grupo controle, no tempo T24 houve hipoexpressão de todos os genes analisado (KRAS, NRAS, HRAS e TP53), demonstrando que de fato o vírus aumentou a expressão dos oncogenes.
Na linhagem celular BCPAP, a expressão gênica nas células inoculadas pelo vírus foi maior 12 horas após a inoculação (T12), com hiperexpressão de todos os genes analisados. Sendo que os genes NRAS e KRAS novamente foram os que estiveram mais expressos em T12 em relação às células do grupo controle. O gene
TP53 também teve sua expressão dobrada justamente no tempo T12, quando os
oncogenes estavam hiperexpressos, novamente cumprindo o papel esperado de gene supressor tumoral. Já nas células do grupo controle também houve hiperexpressão de todos os genes analisados, porém no tempo T4, mostrando que o vírus pareceu retardar a expressão dos oncogenes, que se hiperexpressam apenas 12 horas depois, no entanto essa expressão foi bem maior nas células inoculadas em relação ao grupo controle.
Já na linhagem 8505C, que são células neoplásicas que já carregam mutação de BRAF V600E e TP53 (75), todos os genes começaram a se expressar após 12 horas, que foi justamente o tempo em que houve maior pico da carga viral. O gene
NRAS novamente foi o mais hiperexpresso, com cerca de 10 vezes maior expressão
49
controle o gene NRAS esteve hipoexpresso em todos os tempos analisados. O gene
KRAS também esteve hiperexpresso com cerca de 3 vezes maior expressão do que
o controle. Não esperávamos que o gene TP53 estivesse tão expresso, ao contrário, por já possuir esse gene mutado, a expectativa era de que se mantivesse baixo, pois a expressão de TP53 é diminuída nas células 8505C (97).
Em todas as linhagens celulares o gene KRAS e NRAS foram os mais expressos em determinados tempos. O aumento da expressão desses oncogenes consequentemente aumenta a produção de proteínas Gs e enzimas GTPases que irão desregular o equilíbrio das vias efetoras downstream de RAS-RAF-ERK e de PI3K, e assim conferindo o principal fator para o desenvolvimento do câncer: crescimento desordenado, sobrevivência e diferenciação celular(98). Mutações no gene KRAS são as mais comuns nos cânceres em geral, encontrado em 25 a 30% dos tumores (99). Entretanto, no câncer de tireoide, mutações em NRAS são as mais abundantes (52), representando 67% de todas as mutações da família RAS no câncer de tireoide (100). Estudos sugerem ainda que as detecções de mutações em NRAS, juntamente de BRAF V600E, possam ser utilizadas na diferenciação de malignidade e úteis como marcadores moleculares no auxílio do diagnóstico do câncer de tireoide (101). Sabemos que alterações em NRAS são mais comuns nos carcinomas pouco diferenciados da tireoide in vivo (53), o que também ocorreu em nosso estudo, pois
NRAS foi mais expresso na linhagem BCPAP. A hiperexpressão de KRAS aumenta a
proliferação e sobrevivência celular, e a mutação nesse gene geralmente ocorre nos estágios iniciais do tumor, dando suporte à hipótese de que ele possa estar envolvido na causa da tumorigênese (52). Mutações nesse gene são mais comuns em carcinoma bem diferenciado da tireoide (53), o que também ocorreu in vitro na linhagem TPC-1 em que houve a maior expressão de KRAS. É possível que a infecção por EBV modifique o perfil de expressão dos oncogenes RAS, contribuindo para a progressão tumoral.
50
6. CONCLUSÃO
Concluímos que as linhagens células neoplásicas da tireoide são permissivas ao EBV e que o vírus é capaz de causar efeito citopático nas linhagens celulares de carcinoma bem diferenciado e na de indiferenciado da tireoide. Demonstramos ainda que o EBV interfere na expressão gênica em linhagens celulares neoplásicas tireoidianas aumentando a expressão de oncogenes, principalmente NRAS. Sugerimos que tais ações podem desempenhar um papel relevante na evolução dos tumores tireoidanos, uma vez que pode alterar o microambiente tumoral, merecendo maiores investigações.
51