UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JACQUELINE FÁTIMA MARTINS DE ALMEIDA MORAES
ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS TIREOIDIANAS INFECTADAS PELO
EPSTEIN-BARR VÍRUS
CAMPINAS 2019
JACQUELINE FÁTIMA MARTINS DE ALMEIDA MORAES
ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS TIREOIDIANAS INFECTADAS PELO
EPSTEIN-BARR VÍRUS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na área de Clínica Médica.
ORIENTADOR: Profa. Dra. Laura Sterian
COORIENTADOR: Profa. Dra Clarice Weiss Arns
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA JACQUELINE FÁTIMA MARTINS DE ALMEIDA MORAES, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. LAURA STERIAN
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
JACQUELINE FÁTIMA MARTINS DE ALMEIDA MORAESORIENTADOR: LAURA STERIAN COORIENTADOR: CLARICE WEIS ARNS
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. LAURA STERIAN
2. PROF. DR. JOSÉ BARRETO CAMPELLO CAVALHEIRA
3. PROF. DR. PLÍNIO TRABASSO
4. PROFA. DRA. MARIA TEREZA NUNES
5. PROFA. DRA. FABIANA GRANJA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu filho Guilherme, que me inspira a cada dia com o sorriso mais lindo que já vi, objeto de meu fascínio e ao meu marido Luiz Filipe pela cumplicidade, companheirismo e sobretudo pela compreensão e paciência nos momentos mais difíceis desta jornada, com você tudo fica mais fácil, caminhando juntos sempre chegamos mais longe. Aos meus pais Elizabeth e Carlos Roberto que sempre me proporcionaram tudo. Vocês tornaram este trabalho possível.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho é fruto do envolvimento de muitas pessoas queridas, que sempre estiveram prontas para me ajudar, portanto peço ao leitor que dedique uns poucos minutos para ler esta parte importante do meu trabalho: minhas palavras de agradecimento.
Agradeço primeiramente a Deus, por me dar forças todos os dias, e por sempre cuidar de mim. Porque tudo o que faço procuro sempre fazer o meu melhor e com todo o meu coração, como para o Senhor, conforme a Sua Palavra (Cl 3:23).
Agradeço à minha família por todo o apoio, aos meus pais Elizabeth e Carlos Roberto que sempre me educaram com humildade e sabedoria e me ensinaram os valores que levo para a vida toda, com vocês aprendi que não importa de onde viemos, mas sim para onde queremos e escolhemos ir. Agradeço também a vocês e ao meu querido irmão Carlos Henrique, que cuidaram do meu Gui para que este trabalho fosse finalizado, sem vocês não teria conseguido, amo muito vocês! Aos meus sogros Silvana e Antenor, por também sempre estarem presentes quando precisei, também amo vocês.
Agradeço ao meu marido Luiz Filipe que sempre me incentivou e me faz perceber ou me lembrar de que sou capaz, mesmo nos momentos mais difíceis, quando achei que não daria conta, você sempre me tranquilizou e me fez ver que era possível, e realmente foi, obrigada. Te amo com todo meu coração.
Agradeço à minha querida orientadora Profa. Dra. Laura, que sempre acreditou em mim e me mostrou o valor do conhecimento, e a pensar como uma pesquisadora, buscando o bem para a comunidade, e não apenas a obtenção de um título. Obrigada por sua paciência e compreensão ao longo dessa jornada. Espero que esse não seja o fim, mas sim o começo.
Agradeço em especial a bióloga responsável do Laboratório de Genética Molecular do Câncer (Gemoca): Natássia, que me acolheu em 2010 quando eu ainda era um bebê na ciência e me deu a oportunidade de estágio, isso mudou a minha vida e você fez parte disso, muito obrigada por confiar em mim. Obrigada pelas risadas e por tornar o nosso dia a dia no laboratório tão mais leve e
divertido, por ser nossa guia turística particular e por todas as suas dicas de viagem e pela companhia nos congressos.
Agradeço à toda a equipe do GEMOCA, todos sempre muito unidos e dispostos a me ajudar em especial à Karina Peres, existem pessoas que ajudam sem esperar nada em troca e essas pessoas merecem tudo de melhor nessa vida e você é uma delas, desejo todo sucesso e felicidade do mundo para você. Agradeço em especial também à Elisângela Teixeira que me ajudou na bancada: nas extrações e nas “trocentas” mil placas de real time, muito obrigada por tudo. Agradeço à Larissa Teodoro, que me ajudou quando precisei no cultivo das células e em muitas outras vezes, um exemplo de organização e cuidado. Agradeço também aos demais amigos do laboratório que me ajudaram: Danielle Bueno, Murilo Meneguetti, Matheus Nascimento, Izabela Dal’Bó e Ana Paula Comarella. Agradeço também à equipe do Gemoca “das antigas” que fizeram parte da minha história científica: Elaine Morari, Marjory Marcelo, Mariana Bonjiorno, Lucas Cunha, Angélica Rocha, Janaína Garbim, Fernando Batista, Raquel Barbieri, Laís Amaral e Caroline Torricelli. Obrigada a todos, vocês fizeram e fazem parte da minha história, tenho um imenso carinho por todos. E não posso deixar de citar a Ana Beatriz Marques, carinhosamente apelidada de “pônei”, que me ajudou imensamente no mestrado e que embora minha memória fragilizada tenha me impedido de agradecê-la na minha dissertação, o faço aqui com honras: muito obrigada por todo seu apoio, dedicação, pelas risadas e por sua loucura que nos diverte.
Agradeço à minha coorientadora Profa. Dra. Clarice Arns, do Laboratório de Virologia Animal - IB da UNICAMP, por ter me acolhido como aluna e aberto as portas do seu laboratório para mim, foi uma oportunidade única. Aproveito para agradecer à sua equipe: Raissa Beck e à Ana Paula, o apoio de vocês foi fundamental para a concretização desse trabalho e ao Prof. Dr. José Modena também por compartilhar seu conhecimento, pelo seu tempo, por me deixar usar seu laboratório quando precisei e por suas dicas valiosíssimas, a todos vocês muito obrigada por me apresentarem esse universo maravilhoso da virologia.
Agradeço ao Prof. Dr. Valdemar Máximo do Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade de Porto (IPATIMUP) em Portugal por ter doado gentilmente as células utilizadas nesse trabalho e por ter compartilhado seu conhecimento conosco.
Agradeço aos demais colaboradores de outros laboratórios que sempre estiverem dispostos a nos ajudar, pessoas como vocês, que ajudam uns aos outros, fazem a ciência nesse país possível, muitíssimo obrigada: à Viviane Faiz do Laboratório de Hepatites Virais, à Sandra Brambilla e ao Prof. Dr. José Barreto do Laboratório de Oncologia Molecular por terem cedido seu laboratório quando precisei inúmeras vezes utilizar o fluxo no cultivo celular; à Helen Naemi, vizinha de laboratório, por sempre nos incentivar com seu humor e otimismo inabaláveis, obrigada por fazer parte do nosso dia a dia. Aos colegas, vizinhos de laboratório, do departamento de genética da FCM que sempre compartilharam seu conhecimento conosco: Miriam, Alexandre, Fábio Rossi, André, Luciana, Marilza e Patrícia.
Agradeço ao Programa de Pós Graduação da FCM por todo o suporte aos seus alunos e pelo apoio financeiro para os congressos, e em especial ao secretário Yuri por toda a atenção e prestatividade.
Agradeço pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida (Processo nº 1443334), graças a ela foi possível concluir este trabalho.
Agradeço ainda ao colaborador Prof. Dr. Alfio Tincani, pois através dele tivemos apoio financeiro concedido pela Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX) da Unicamp (Processo nº 519.294). Agradeço também ao serviço de bioestatística prestado pela FCM, em especial à estatística Cleide.
Foram longos quatro anos e meio, com muitas idas e vindas, passos em frente, mas também para trás, mais uma etapa finalizada de um lindo (sim, para mim é lindo!) trabalho que lerão a seguir.
“Pois Dele, por Ele e para Ele são todas as coisas. A Ele seja a glória para sempre! Amém”
RESUMO
O Epstein-Barr Vírus (EBV) é um dos mais frequentes herpesvírus no mundo todo, cerca de 90% da população adulta já foram infectadas. Responsável por 2% de todas as neoplasias malignas no mundo, é considerado um agente carcinógeno humano. O vírus está relacionado com carcinoma de nasofaringe, câncer gástrico, linfomas de Burkitt e de Hodgkin e mais recentemente nosso grupo demonstrou a sua presença em alta carga viral em tumores malignos tireoidianos. O câncer de tireoide, por sua vez, é a neoplasia maligna endócrina mais comum em todo o mundo, sendo a quinta mais frequente entre as mulheres. Aumento da expressão nos oncogenes da família RAS (HRAS, NRAS e KRAS) são encontradas em diversos tumores humanos, e são frequentes no câncer de tireoide, alterações na expressão de TP53 também ocorrem, particularmente em tumores tireoidianos mais agressivos. O EBV é capaz de causar infecção latente e persistente no hospedeiro e interfere no metabolismo da célula hospedeira, desencadeando um processo tumorigênico. Sendo assim o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade do Epstein-Barr Vírus em causar alterações morfológicas e moleculares em células tireoidianas neoplásicas das linhagens TPC-1, BCPAP e 8505C. Para tanto foi realizada a adaptação viral para análise de permissividade e efeito citopático nas linhagens celulares neoplásicas tireodianas, seguindo-se a cinética viral de 48 horas para análise da carga viral e da expressão dos oncogenes KRAS, NRAS, HRAS e de TP53. A comparação das células inoculadas pelo vírus com células controle não inoculadas mostrou que todas as linhagens celulares foram permissivas ao vírus, no entanto o vírus provocou efeito citopático, alterando a morfologia celular nas linhagens de TPC-1 e 8505C. Em relação à análise da expressão gênica observamos uma tendência à maior expressão de TP53 e NRAS nas linhagens TPC-1 e BCPAP inoculadas em relação ao grupo controle, e à maior expressão NRAS com diminuição da expressão de TP53 na linhagem 8505C. No entanto essa diferença não foi significativa (p>0,05). Concluímos que as linhagens células neoplásicas da tireoide são permissivas ao EBV e que o vírus é capaz de causar efeito citopático tanto nas linhagens celulares de carcinoma bem diferenciado como na de indiferenciado da tireoide. Demonstramos ainda que o EBV interfere na expressão gênica em linhagens celulares neoplásicas tireoidianas aumentando a expressão de oncogenes, principalmente KRAS e NRAS. Estes dados sugerem que EBV pode atuar na tumorigênese tireoidiana aumentando a expressão de oncogenes e interferindo na expressão de genes supressores tumorais.
Palavras-chave: Herpesvirus humano 4. EBV. Câncer de Tireoide. Carga Viral. Expressão gênica de RAS. Expressão gênica de TP53.
ABSTRACT
The Epstein-Barr Virus (EBV) is one of the most frequent herpes viruses worldwide, about 90% of the adult population have already been infected. Responsible for 2% of all malignancies in the world, it is a human carcinogen. The virus is related to nasopharyngeal carcinoma, gastric cancer, Burkitt and Hodgkin's lymphomas and more recently our group has demonstrated its presence in high viral load in malignant thyroid tumors. Thyroid cancer, in turn, is one of the most common endocrine malignancies in the world, a fifth most frequent among women. The hyperexpression of RAS family oncogenes (HRAS,
NRAS and KRAS) occurs in several human tumors and it is frequent in thyroid
cancer. Variations in TP53 expression also occur, particularly in more aggressive thyroid tumors. EBV is able to stablish latent and persistent infection in the host cell and does not interfere in its metabolism, triggering a tumorigenic process. Thus, we aimed to evaluate the ability of the virus to cause morphological and molecular changes in neoplastic thyroid cells of the TPC-1, BCPAP and 8505C lines. we aimed to evaluate the ability of the virus to cause morphological and molecular changes in neoplastic thyroid cell lines TPC-1, BCPAP and 8505C. Viral adaptation for the analysis of the cytopathic effect of the neoplastic thyroid cell lines was performed, followed by viral kinetics of 48 hours for viral load and genes expression analysis of KRAS, NRAS, HRAS and TP53. Comparison of the inoculated cells with non-inoculated control cells showed that all tumor cell lines were permissive to the virus; however, the virus caused cytopathic effect, altering the cell morphology only in the TPC-1 and 8505C. Related to gene expression analysis, we observed a tendency to greater expression of TP53 and NRAS in the TPC-1 and BCPAP lines inoculated in relation to the control group, and to the higher NRAS expression with decreased expression of TP53 in 8505C cell line. However, this difference was not significant (p> 0.05). We conclude that neoplastic thyroid cell lines are permissive to EBV and that the virus is capable of causing cytopathic effect in both well-differentiated and undifferentiated thyroid cell lines. We also demonstrated that EBV interferes in gene expression in thyroid neoplastic cell lines producing an increase in the expression of the oncogenes
KRAS, NRAS and TP53 followed by the loss of expression of the tumor
suppressor gene TP53. We suggest that these effects could be related to tumor progression.
Key words: Human herpesvirus 4. EBV. Thyroid Cancer. Viral load. Ras expression.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Causas do câncer em geral ... 16
Figura 2 – Esquema da infecção do EBV e seus diferentes padrões de latência nas células hospedeiras. ... 21
Figura 3 - Distribuição dos cânceres mais incidentes estimados para 2018. Sendo que o câncer de tireoide é o quinto mais frequente ... 22
Figura 4 - Processo de desdiferenciação da célula folicular tireoidiana ... 23
Figura 5 - Ativação de oncogenes na via Ras-ERK e PI3k-Mtor ... 24
Figura 6 – Localização cromossômica dos genes da família RAS ... 25
Figura 7 - Esquema da metodologia utilizada ... 32
Figura 8 – Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem TPC-1 ... 36
Figura 9 - Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem 8505C ... 37
Figura 10 - Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem BCPAP ... 38
Figura 11 – Curva de crescimento de múltiplos passos do EBV na linhagem celular TPC-1 ... 39
Figura 12 – Curva de crescimento do EBV na linhagem celular BCPAP ... 40
Figura 13 - Curva de crescimento do EBV na célula 8505C ... 41
Figura 14 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem TPC-1 na cinética viral ... 43
Figura 15 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem BCPAP na cinética viral ... 44
Figura 16 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem 8505C na cinética viral ... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sondas utilizadas nas reações de quantificação de RNAm ... 33 Tabela 2 - Resumo dos obtidos com as passagens às cegas nas linhagens celulares neoplásicas TPC-1, BCPAP e 8505C. ... 37 Tabela 3 - Análise da expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS no grupo de células inoculadas pelo EBV versus grupo controle de células não inoculadas. Valores expressos em médias e desvio padrão das unidades de expressão relativa (Fold change). ... 42
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTB Gene β-Actina
BKV BK Vírus
CAT Carcinoma Anaplásico de Tireoide cDNA DNA complementar
CDT Câncer Diferenciado da Tireoide CFT Carcinoma Folicular da Tireoide CMV Citomegalovírus
CPD Carcinomas Pouco Diferenciados CPT Carcinoma Papilífero da Tireoide CT Câncer de Tireoide
EBER Sigla do inglês: Epstein-Barr virus (EBV)-encoded RNAs EBNA Sigla do inglês: Epstein-Barr virus nuclear antigen
EBV Epstein-Barr Vírus
FC Fold Change
HHV-4 Herpesvírus Humano-4 HPV Papiloma Vírus Humano HSV Herpes Simplex Virus
IARC Agência Internacional de Pesquisa do Câncer INCA Instituto Nacional de Pesquisa do Câncer ISH Hibridização in situ
LMP Sigla do inglês: Latent membrane protein
MAPK Sigla do inglês: Mitogen Activated Protein Kinases MOI Multiplicidade de Infecção
qPCR Sigla do inglês: quantitative real-time PCR RT-PCR Sigla do inglês Reverse Transcription-qPCR TPV Tanapoxvírus
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1 Vírus e Câncer ... 16
1.2 Taxonomia e patogenia do Epstein-Barr Vírus ... 18
1.3 Câncer de tireoide ... 21
1.4 Processo de carcinogênese na tireoide... 23
1.5 Fatores de risco para o câncer de tireoide ... 26
1.6 Estudos in vitro no câncer de tireoide... 27
2. OBJETIVOS ... 28 3. METODOLOGIA ... 29 4. RESULTADOS ... 36 5. DISCUSSÃO ... 46 6. CONCLUSÃO ... 50 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51 ANEXOS ... 56
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Vírus e Câncer
A primeira evidência de que os vírus poderiam causar câncer foi obtida em 1910, quando Rous descobriu um tipo de sarcoma que podia ser transmitido entre aves (1). Cerca de 40 anos mais tarde, confirmou-se que este sarcoma era transmitido por um tipo de vírus que, quando implantado em ratos saudáveis através de um filtrado livre de células obtido de tumores malignos, promovia o desenvolvimento de câncer (2). Hoje, estima-se que cerca de 25% de todos canceres no mundo são causados por agentes infecciosos como os vírus (3) (Figura 1), sendo que só o Epstein-Barr Vírus (EBV) é considerado responsável por 2% de todas as neoplasias (4).
Figura 1 - Causas do câncer em geral (Adaptado de WHO, 2018) (3).
Determinadas neoplasias malignas, como o câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de útero, leucemias e linfoma de Burkitt (LB), podem ser originadas de infecções virais em tecidos de células-tronco adultas, pois esses vírus, ao inserir seu material genético na célula hospedeira, alteram o metabolismo das células infectadas, modificando suas vias de sinalização e fazendo com que a célula continue proliferando, porém sem se diferenciar (5).
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Vários estudos demonstraram a presença de vírus em cânceres humanos, como o Papiloma Vírus Humano (HPV) em câncer de colo de útero, o Epstein-Barr Vírus (EBV) em carcinoma da nasofaringe e câncer gástrico, o Tanapoxvírus (TPV) em cânceres de ovário, mama, próstata, osteosarcomas, melanomas, gioblastomas e câncer colorretal (6-9) e, ainda, o Citomegalovírus (CMV) em câncer de mama (10).
No que diz respeito ao câncer diferenciado da tireoide (CDT), Jensen e colaboradores encontraram infecção frequente pelo Herpes Simplex Virus tipos 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) (11). Estes autores também relataram que durante a progressão do tumor as células tireoidianas adquiriam um aumento da suscetibilidade ao HSV devido ao aumento da expressão da nectina-1 (uma imunoglobulina de moléculas de adesão presente em células epiteliais, neuronais e fibroblastos, principal mediador de entrada do HSV nas células hospedeiras) e a ativação dos sinais mitóticos (11). Já foi relatado no câncer de tireoide (CT) também, os vírus BK vírus (BKV), parvovirus B19 e o EBV (12, 13).
O EBV, em particular, está associado ao linfoma de Burkitt, pois ao infectar os linfócitos B no seu centro germinativo, os transcritos e proteínas virais aumentam a produção de interleucinas e aumentam a ativação e proliferação dos linfócitos, que aumentam as chances de mutações genéticas, principalmente nos gene MYC, TP53,
ARF e MDM2, contribuindo para o surgimento do linfoma de Burkitt (14). Além disso,
o EBV já foi associado a diversos tumores epiteliais malignos, como o carcinoma hepático, esofágico e na região da cabeça e pescoço está relacionado, principalmente com o carcinoma de nasofaringe com uma alta taxa de incidência, que pode variar com até cerca de 85% dos casos (15-19).
Na região da cabeça e pescoço, além do carcinoma de nasofaringe, o EBV tem sido associado também ao câncer de tireoide. Os primeiros relatos da presença do EBV em amostras de tecido tireoidiano foram em 1993 (20), neste estudo os autores investigaram a presença do vírus em diversos tipos de tecidos humanos de necropsias, sendo que o EBV foi encontrado em 50% (5/10) das amostras de tecido tireoidiano normal analisadas. Os autores então sugeriram a possível associação do EBV com neoplasias, mas somente em 2001, outros autores investigaram a presença desse vírus em diversos tipos de neoplasias humanas, mas não encontraram nenhuma amostra positiva para o EBV (21, 22). Já em 2003 começou-se a sugerir uma possível associação do EBV com o câncer de tireoide, Shimakage e colaboradores analisaram 10 carcinomas papilíferos e 11 carcinomas indiferenciado
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por hibridização in situ e todas as amostras analisadas apresentaram a presença do EBV (23).
Já em 2005, Tsai e colaboradores analisaram a presença de diversos vírus incluindo o EBV em diversas neoplasias humanas incluindo tumores tireoidianos, mas não encontrou nenhuma amostra tumoral tireoidiana EBV positiva (10). Uma década mais tarde voltou-se a investigar a associação do EBV com o câncer de tireoide, Stamatiou e colaboradores analisaram 30 amostras de CT e 90% apresentaram presença do EBV (12).
Mais recentemente, nosso grupo descreveu a presença de sequências genéticas do EBV em nódulos tireoidianos na maior amostragem da literatura (24). De fato, investigamos a presença do HSV-2, EBV, CMV em 191 amostras de tecidos tireoidianos de pacientes portadores de neoplasias da tireoide e analisamos ainda 104 tecidos não neoplásicos provenientes do lobo contralateral do tumor. Foi realizado, além da sorologia, a extração de DNA tumoral e posteriormente analisada a carga viral por PCR em Tempo Real. Encontramos a presença de carga viral do EBV em 16% (29) dos pacientes, sendo que a carga viral foi maior nos tumores do que nos tecidos normais (p=0,0002), principalmente nos tecidos de tumores malignos. Para comprovar a presença do EBV nas células tireoidianas, realizamos análise histológica por ISH na detecção do EBER, e das 21 lâminas analisadas, 11(52%) revelaram a presença do RNA viral (24). Ambos os métodos, imunoistoquímica e hibridização in
situ, são metodologias consagradas que demonstram informações histológicas que
complementam os achados moleculares e ainda são essenciais para melhor compreensão da carcinogênese implicada na relação tireoide versus infecção viral. Estes achados, na época inéditos na literatura, mostraram que o EBV não só infectou as células tireoidianas, mas também se mostrou mais frequente nos casos malignos, sugerindo uma possível relação entre a presença do vírus e os nódulos tireoidianos (24).
1.2 Taxonomia e patogenia do Epstein-Barr Vírus
Existem mais de cem espécies de herpesvírus que fazem parte da família Herpesviridae. No entanto, apenas oito delas infectam os seres humanos. Dentre elas está o Herpesvírus Humano-4 (HHV-4) (25). Pertencente à subfamília Gammaherpesvirinae e do gênero Lymphocryptovirus, este vírus é o causador da
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doença chamada mononucleose infecciosa e infecta mais de 90% da população mundial adulta (26, 27). O HHV-4 também é conhecido como Epstein-Barr Vírus (EBV) devido ao nome dos seus descobridores que o descreveram pela primeira vez em 1964, os pesquisadores Epstein e Barr (18).
O EBV foi isolado pela primeira vez in vitro em células tumorais de biópsia de Linfoma de Burkitt em 1964 (28). Foi o primeiro vírus reconhecido como capaz de causar tumores em humanos (29), e foi rotulado pela Agência Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC) como agente carcinógeno humano (27). De fato, a inoculação do EBV em linfócitos B humanos em cultura transforma as células infectadas conferindo-lhes a capacidade de reprodução ilimitada in vitro (18, 26).
O EBV possui um genoma composto por DNA de dupla fita com extensão de 172kb. Existem dois tipos de EBV, descritos como tipo 1 e tipo 2, e ambos os genomas são bem similares (30). Dentre esses dois tipos, a principal cepa do vírus, que infecta comumente os linfócitos, é a B95-8. Esta cepa é a mais comumente encontrada nos linfomas de Hodgkin e Burkitt e a cepa M81 é mais comum nos carcinomas de nasofaringe (19, 27, 31).
Assim como os demais herpesvírus, o EBV possui a capacidade de causar infecção latente, persistindo por toda a vida do indivíduo. Na infecção latente o DNA viral fica sob a forma epissomal em cromatina com múltiplas cópias no núcleo da célula hospedeira, sem no entanto, se integrar ao cromossomo hospedeiro (32). Neste caso os epissomas virais são replicados em sincronia com a replicação da célula sem danificá-la (32). Apenas as proteínas de manutenção de latência são expressas para garantir a sobrevivência do vírus na célula hospedeira, geralmente sem causar infecção aparente no indivíduo (15, 16).
A latência, no EBV, é mantida principalmente pelas proteínas EBNAs (sigla do inglês Epstein-Barr virus nuclear antigen): EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3 (com subunidades EBNA-3a, EBNA-3b e EBNA-3c), e ainda a proteína EBNA-LP (sigla do inglês: Epstein-Barr virus nuclear antigen leader protein); pelas proteínas LMP-1 e LMP-2 (com subunidades LMP-2a e LMP-2b), sigla do inglês Latent membrane
protein; além disso o vírus transcreve RNAs que participam da manutenção da
latência como o RNA mensageiro EBER (da sigla em inglês: Epstein-Barr virus
(EBV)-encoded RNAs) e os microRNAs transcritos da região BamHI-A chamados de BARTs
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O vírus é transmitido, principalmente, pela saliva e em indivíduos saudáveis estabelece infecção latente nos linfócitos B de memória. A patogenia do EBV na tumorigênese humana está relacionada principalmente na sua capacidade de causar infecção latente e persistente. Quando ocorre uma infecção, tanto os linfócitos B quanto as células epiteliais infectadas pelo EBV irão produzir novos vírus que irão infectar novas células. As células remanescentes irão morrer por apoptose ou por necrose, caracterizando o ciclo lítico (34). Por outro lado, outras células infectadas pelo vírus em sua forma latente, serão transformadas pelo EBV levando ao processo de transformação celular, ou seja, o vírus irá provocar alterações no metabolismo celular (Figura 2) (34).
O EBV apresenta expressão de diferentes proteínas e RNAs virais dependendo da célula hospedeira infectada, caracterizando diferentes padrões de latência (17, 35). Atualmente são descritos quatro tipos de latência: latência 0, geralmente ocorre nos linfócitos B de memória com expressão apenas de EBER, observada em indivíduos saudáveis, é a menos comum representando 15% das infecções nos linfócitos B; latência tipo I, é a forma mais comum de latência nos linfócitos B (85%), ocorre em indivíduos com Linfoma de Burkitt, com expressão dos RNAs EBER e BARTs, e ainda da proteína EBNA-1; latência tipo II, expressa-se EBERs, BARTs, EBNA-1, e ainda as proteínas virais LMP-1 e LMP-2, esse tipo de latência ocorre geralmente em neoplasias malignas de células epiteliais como carcinomas de nasofaringe e gástrico, e ainda ocorre nos Linfomas de Hodgkin’s e Linfoma de células NK/T; e por fim a latência tipo III, onde ocorre a expressão de todas proteínas e RNAs virais de latência: EBERs, BARTs, EBNA-1, EBNA-LP, EBNA-2, EBNA-3A-C, LMP-1 e LMP-2, esse tipo de latência ocorre nas células de linfócitos B transformados in vitro e em pacientes imunossuprimidos (Figura 2) (17, 35).
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Figura 2 – Esquema da infecção do EBV e seus diferentes padrões de latência nas células hospedeiras. Na orofaringe, o EBV infecta a mucosa e passa pelas células epiteliais até atingir os linfócitos B e expressam todas as proteínas e RNAs virais (latência III), nessa fase se multiplicam ativamente. Assim o vírus pode levar a ativação e proliferação dos linfócitos B infectados. Nesse momento, muitos desses linfoblastos podem ser mortos pela resposta celular dos linfócitos T citotóxicos. No entanto, algumas dessas células podem escapar da resposta imune e seguir para o centro germinativo onde uma quantidade menor de proteínas virais são expressas (latência I/II). Pode ocorrer ainda a reativação do EBV das células B recirculantes na orofaringe, estabelecendo um ciclo lítico de replicação e novos vírus são liberados e passam pela mucosa epitelial e vão para a orofaringe, podendo ser transmitidos novamente a novos hospedeiros através da saliva do indivíduo. Adaptado de Forsman A, 2009(36).
1.3 Câncer de Tireoide
O câncer, de modo geral, é a doença que mais cresce em todo mundo, com incidência de mais de 14 milhões de novos casos e mais de 8 milhões de mortes pela doença a cada ano no mundo todo (37, 38).
Já o CDT é a neoplasia maligna endócrina mais comum em todo o mundo. No Brasil, o Instituto Nacional de Pesquisa do Câncer (INCA) estima que, em 2018, hajam
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9610 novos casos. É a quinta neoplasia mais comum entre as mulheres, representando 4% dos cânceres em geral (Figura 3) (38).
Sua prevalência vem aumentando assustadoramente em todo o mundo, incluindo o Brasil. Embora o rastreamento por métodos sensíveis como a ultrassonografia cervical e outros métodos de imagem, cada vez mais populares e mais ao alcance da população seja o grande responsável por este aumento de incidência, existem vários indícios de que outras causas contribuem para tal (39, 40). Por outro lado, a maior parte dos CDT tem evolução indolente e a mortalidade, apesar do brutal aumento de incidência, tem se mantido proporcionalmente baixa, sugerindo que grande parte dos CDT não evolua clinicamente. De fato, tal observação levou, à semelhança do que ocorre com o câncer de próstata, à recomendação de observação com vigilância ativa sem intervenção em alguns casos de tumores tireoidianos de baixo risco (41, 42).
Figura 3 - Distribuição dos cânceres mais incidentes estimados para 2018. Sendo que o câncer de tireoide é o quinto mais frequente (38).
O câncer de tireoide é originado a partir das células foliculares e pode ser subdividido em: carcinomas bem diferenciados, que representam cerca de 90% de todos os cânceres de tireoide, e compreendem o carcinoma papilífero da tireoide (CPT), o mais comum, com mais 85% de todos os CDT, e o carcinoma folicular da tireoide (CFT), menos frequente, com menos de 5% de todos os CDT (43, 44). Existem ainda os carcinomas pouco diferenciados (CPD), cerca de 5-10% de todos os canceres da tireoide e, por fim, o carcinoma anaplásico da tireoide (CAT), que é o mais raro, com cerca de 1% de todos os canceres da tireoide, também chamado de carcinoma indiferenciado da tireoide (43-45).
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Os CPD e o indiferenciado, o qual se enquadra o carcinoma anaplásico de tireoide (CAT), desenvolvem-se através do processo de desdiferenciação gradual dos carcinomas papilíferos e foliculares ou podem originar-se independentemente deste processo (Figura 4) (46).
Figura 4 - Processo de desdiferenciação da célula folicular tireoidiana (47)
1.4 Processo de carcinogênese na tireoide
Independentemente do tipo histológico do câncer de tireoide, o processo de carcinogênese inicia-se a nível molecular, e diversos genes têm sido implicados nesse processo, em particular os chamados oncogenes e os genes supressores tumorais.
Os oncogenes são genes relacionados ao surgimento de tumores. São oriundos de proto-oncogenes, que, por sua vez, são genes que participam de importantes processos fisiológicos das células normais, estimulando o crescimento e proliferação celular, participando ainda de processos de diferenciação celular. No entanto, uma vez mutados, estes proto-oncogenes podem levar ao surgimento do câncer, passando então a ser denominados de oncogenes (48-50).
As proteínas produzidas pela expressão dos proto-oncogenes participam, em geral, de vias de sinalização celular, como por exemplo a via de sinalização RAS-RAF-MEK-ERK, que é uma importante via celular implicada na biologia de diversos tipos
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de canceres. Essa via faz parte da via de MAPK, a qual participa da regulação de diversos processos celulares como proliferação, diferenciação, sobrevivência celular e também apoptose (Figura 5). Nessa via encontramos dois dos principais grupos de genes envolvidos na carcinogênese tireoidiana: o BRAF e os genes da família RAS (51-55).
Figura 5 - Ativação de oncogenes na via Ras-ERK e PI3k-mTOR (Adaptado de Mendoza, Blenis, 2011) (56)
A família de genes RAS é composta por três genes: HRAS, NRAS e KRAS (Figura 6) codifica um pequeno grupo de proteínas ligantes de guanosina-trifosfato (proteínas Gs), que estimulam uma grande variedade de vias de sinalização subsequentes (downstream). Parte da via MAPK, é ativada por fatores de crescimento como hormônios ou citocinas, que ao se ligarem aos receptores celulares, no caso da célula tireoidiana são os receptores de tirosina quinase, recrutam proteínas intracelulares, como as proteínas Gs codificadas pelos genes RAS, tornando-as ativas. Essas proteínas então ativam BRAF que subsequentemente ativa os demais componentes da via levando à sobrevivência e proliferação celular. E a via de PI3KmTOR é influenciada pela via de MAPK (Figura 5) (56, 57).
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Figura 6 – Localização cromossômica dos genes da família RAS.
Mutações no gene RAS são comuns em tumores humanos da tireoide, e essas mutações causam ganho de função e consequentemente aumento da expressão desses oncogenes, sendo que essa mutação é mais prevalente nas lesões de padrão folicular (CPT variante folicular, CFT e CPD), sendo utilizada até como indicação prognóstica (57). As mutações no gene RAS são identificadas em 40-50% dos CFT (3944), 20-40% dos AF (58, 59), em 10-20% dos CPT (60, 61) e em 33% dos carcinomas anaplásicos (55). Sendo assim, essas alterações são encontradas tanto nos tumores benignos quanto nos malignos da tireoide, sugerindo que tais mutações ocorram em estágio inicial da transformação oncogenética da célula folicular (53, 54). Além das alterações nos oncogenes, outras alterações importantes no processo da carcinogênese são as dos genes supressores tumorais, como o gene
TP53. Ele é responsável pelo controle da proliferação celular e pela sinalização nos
processos de reparo do DNA e na apoptose. Traduz a proteína p53 que age no controle do ciclo celular, essa proteína age como um fator de transcrição, ela se liga ao DNA em uma região promotora e ativa a transcrição de uma série de proteínas da família dos Ps (62, 63). A desregulação de TP53 contribui para o desenvolvimento de diversos tipos de tumores, incluindo os tumores tireoidianos. Mutações nesse gene
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podem exercer um importante papel também na progressão tumoral (53, 54). Alguns estudos demonstram que mutações que inibem a expressão de TP53, ocorridas no estágio inicial do tumor, contribuem para a ocorrência de metástase (64, 65).
Nosso grupo também demonstrou que p53 é mais expresso em tumores malignos do que nos benignos e que mutações no gene TP53 foram mais frequentes no câncer de tireoide, sugerindo que a análise da expressão de p53 pode auxiliar no diagnóstico diferencial de tumores tireoidianos (66).
1.5 Fatores de Risco para o câncer de tireoide
Além do componente genético, fatores ambientais favorecem o processo carcinogênico do câncer de tireoide. Fatores exógenos físicos como a baixa exposição à radiação ionizante são, comprovadamente, suficientes para aumentar o risco de CDT (67). Diversos estudos já mostraram que a radiação provoca danos críticos ao DNA, causando apoptose e instabilidade genômica, originando aneuploidias, deleções, amplificações, etc., e que todas essas mutações dão origem a tumores, inclusive o câncer de tireoide (67, 68).
Agentes químicos, como o iodo, também são fatores de extrema importância para o desenvolvimento de CDT, atuando de diferentes formas de acordo com as concentrações de exposição ou consumo (69). A deficiência de iodo causa hiperplasia da glândula da tireoide, provocando bócio e é associada com o aumento do risco para o desenvolvimento do CFT. No entanto, quem consome iodo em excesso pode aumentar o risco para CPT (70, 71). Outras substâncias químicas parecem ser fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de tireoide, como por exemplo, a exposição aos agentes químicos associados a regiões vulcânicas, como vanádio, selênio, zinco, cádmio e tiocinatos de enxofre, pois a incidência de CDT aumenta de duas a três vezes em áreas vulcânicas (72).
Além dos fatores de risco como radiação e substâncias químicas, existem ainda outros fatores que atualmente têm sido alvo de estudos, como os fatores biológicos, particularmente os vírus.
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1.6 Estudos in vitro no CDT
Um dos modelos experimentais mais utilizados na pesquisa do câncer humano é o estudo in vitro em cultura celular, pois ele pode esclarecer mecanismos essenciais que desempenham papel importante na tumorigênese humana (73, 74). As células provenientes da cultura são puras, geneticamente idênticas, de fácil propagação e são facilmente manipuláveis geneticamente (74, 75).
Para cada tipo de câncer de tireoide, diferentes linhagens celulares foram derivadas. A linhagem BCPAP é derivada de um carcinoma pouco diferenciado da tireoide (CPD) (76), a TPC-1 é uma linhagem derivada de CPT (77) e a 8505C é derivada de CAT (78).
Saiselet e col. demonstraram que as características das linhagens celulares do câncer de tireoide, principalmente as relacionadas com genes alvo para o desenvolvimento do CDT (dentre eles RAS, RET, TERT e TP53), se mostraram semelhantes quando em comparação com o que já foi relatado na literatura em estudos in vivo (75).
A linhagem TPC1 apresenta apenas translocação de RET/PTC1.Tanto a linhagem BCPAP quanto a 8505C possuem mutações em BRAF V600E e TP53 (75). Van Staveren e col. também demonstrou que as linhagens celulares do câncer de tireoide se desenvolvem in vitro de maneira fenotípica muito similar com o perfil de expressão genética dos tumores in vivo (74).
Nossos estudos preliminares e as evidências da literatura nos levaram a investigar mais profundamente a relação entre o EBV e os tumores tireoidianos. Nossa hipótese é que o EBV é capaz de causar alterações morfológicas e moleculares nas células neoplásicas tireoidianas transformadas pelo vírus. Estas alterações poderiam interferir no processo tumorigênico tireoidiano.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Avaliar a capacidade do Epstein-Barr Vírus em causar alterações morfológicas e moleculares em células tireoidianas neoplásicas das linhagens TPC-1, BCPAP e 8505C.
2.2 Objetivos Específicos
- Analisar a permissividade das linhagens celulares neoplásicas de tireoide ao EBV.
- Analisar a expressão diferencial de TP53, NRAS, HRAS e KRAS nas células neoplásicas tireoidianas infectadas e não infectadas pelo EBV.
- Verificar a capacidade do EBV causar efeito citopático nas células neoplásicas tireoidianas.
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3. METODOLOGIA
3.1 Cultura Celular
3.1.1 Linhagens celulares
O cultivo celular foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, no Instituto Biológico da Universidade Estadual de Campinas, sob supervisão da Dra. Clarice Arns, chefe e coordenadora do laboratório. O presente trabalho é um estudo observacional experimental in vitro e está dispensado de apresentação ao Comitê de Ética da Universidade Estadual de Campinas por não envolver, direta ou indiretamente, seres humanos (ANEXO A).
Para a realização do estudo foi utilizada a linhagem TPC-1 de carcinoma papilífero de tireoide clássico, com translocação RET/PTC (74, 75), a linhagem BCPAP, com mutação em BRAF V600E, e a linhagem 8505C, de carcinoma anaplásico de tireoide, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Valdemar Máximo do
Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto
(IPATIMUP), Porto, Portugal (74, 75).
Para obtenção do estoque viral foi utilizada a célula B95-8, adquirida comercialmente (código 0042, BCRJ, Rio de Janeiro, Brasil), célula amplamente utilizada em outros estudos (79-82).
As linhagens de TPC1, BCPAP, 8505 e a linhagem B95-8 foram mantidas com meio RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies, Califórnia, USA) com adição de 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cripion Biotecnologia, Andradina, SP, Brasil). Todas as células foram mantidas a 37º C com 5% de CO2. O meio foi trocado a cada dois dias
aproximadamente e as células foram ressuspendidas quando se alcançou a confluência de 80%. A ressuspensão foi feita com Tripsina a 0.25% EDTA (Sigma– Aldrich)(74, 75, 83).
3.1.2 Preparação do estoque viral
Para obtenção do estoque viral, as células B95-8 foram cultivadas por duas semanas, trocando o meio a cada dois dias. Após esse período, visando obtenção de alta carga viral, as garrafas com as células foram congeladas e descongeladas
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rapidamente por três vezes, seguindo-se a ressuspensão por tripsinização (15, 79, 81). A suspensão obtida foi centrifugada por 20 minutos a 1.200 rpm, o sobrenadante então foi coletado, filtrado em filtro de 0.45µm e foram separadas alíquotas de 1 ml da suspensão viral que, por fim, foram armazenadas em biofreezer à -80ºC (79, 81).
3.1.3 Adaptação do EBV nas células tireoidianas - “Passagens às cegas”
Para infecção das células tireoidianas (TPC-1, BCPAP e 8505C) utilizaram-se as alíquotas do estoque viral obtidas pelos pelo cultivo das células B95-8. Foram realizadas “passagens às cegas” para adaptação do EBV nas linhagens das células tireoidianas. O procedimento consistiu em inocular 1 ml de vírus ativo, proveniente das alíquotas do estoque viral, na monocamada de células tireoidianas previamente preparadas no dia anterior. O mesmo tipo celular foi mantido concomitantemente com 1 ml de meio RPMI a 2% de soro fetal bovino como controle. Para adsorção viral foram testados dois protocolos: o de Miller e colaboradores (15) com 1 hora de adsorção em estufa a 37º C, e o de Shannon-Lowe e colaboradores (79) com 3 horas de adsorção em geladeira a aproximadamente 4º C. Sendo que este último protocolo foi o que obtivemos maior concentração de vírus. Posteriormente, após a adsorção viral, as células foram lavadas com PBS 1X por 3 vezes para remoção dos vírus que aderiram às células e acrescentou-se 10 ml de meio RPMI 2% de soro fetal bovino. As células foram mantidas por uma semana ou até o surgimento de 80% de efeito citopático. As células foram acompanhadas diariamente para análise do crescimento e transformação celular.
Para confirmar a transformação celular pelo EBV, o DNA foi extraído das células cultivadas por meio da técnica de TRIzol® e realizada a análise da carga viral por quantitative real-time PCR (qPCR). O gene utilizado para detecção do vírus foi o
EBNA-1, já utilizado para detecção do vírus em estudo anterior do nosso grupo
também realizada por carga viral (24). Essa técnica consiste na utilização de um controle positivo comercial contendo carga viral conhecida (Advanced
Biotechnologies, Maryland, USA), com esse controle então é realizada uma diluição
seriada que gerará uma curva padrão, o resultado da carga viral da cada amostra é obtida então pela comparação à curva padrão.
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3.1.4 Cinética Viral
Para análise da expressão gênica diferencial e da carga viral do EBV nas células transformadas e não-transformadas, foi realizado o cultivo das diferentes linhagens celulares (TPC-1, BCPAP e 8505C) em placas de cultura de 6 poços. Inicialmente, as células foram cultivadas em garrafa média até obtermos cerca de 90% de confluência; as células então foram ressuspendidas por tripsinização e contadas em câmara de Newbauer.
A concentração celular foi ajustada para 2,5 x 105 para todas as células, foi
adicionado meio RPMI 1640 a 10% de SFB para adesão celular e formação da monocamada. No dia seguinte o meio foi removido e foi realizada a inoculação, para tanto ajustou-se a concentração da alíquota viral utilizada para uma multiplicidade de infecção de 100 (MOI=100). O controle foi mantido a RPMI 1640 a 2% de SFB. A adsorção foi realizada em geladeira a 4˚C por 3 horas, homogeneizando suavemente a cada 1 hora. Após o período de adsorção os poços foram lavados por 3 vezes com tampão PBS 1X e as células foram mantidas em meio RPMI 1640 a 2% de SFB de acordo com os seguintes períodos: logo após a inoculação (T0), por 4 horas (T4), 24 horas (T24) e 48 horas (T48); após esse período, o sobrenadante e as células foram coletadas para posterior extração de DNA, RNA e proteínas (Figura 7).
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Figura 7 - Esquema da metodologia utilizada
3.2 Extração de ácidos nucleicos
3.2.1 Extração de ácidos nucleicos das células tireoidianas por TRIzol®
O DNA e o RNA total das células transformadas e não-transformadas (não-infectadas) foram extraídos com TRizol ® (Invitrogen, USA).
Após o cultivo das células em monocamada, foi adicionado 500µl de TRizol® nos poços da placa de cultura para lisar as células. Para tanto, homogeneizou-se o lisado por pipetagem repetitiva. O lisado foi armazenado em biofreezer a -80ºC para posterior extração do DNA e RNA, de acordo com o protocolo do fabricante.
3.2.2 Extração de DNA viral do sobrenadante da cultura celular.
Para estimar a carga viral e realizar a cinética, foi extraído o DNA viral do sobrenadante da cultura celular nos tempos T0, T4, T12, T24 e T48. Foi utilizado
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BioPur® Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA, código BP122-50 (Biometrix, Brasil) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, otimizado para 200µl de sobrenadante de cultura celular.
3.3 Expressão gênica diferencial
Após a extração do RNA total das células, foi realizada a análise da expressão gênica por RT-PCR (sigla do inglês Reverse Transcription-qPCR), técnica já realizada anteriormente por nosso grupo (84). As amostras de RNA foram quantificadas por espectrofotometria Picodrop (Picodrop, Hinxton, Reino Unido), e posteriormente foi sintetizado o DNA complementar (cDNA) por transcrição reversa utilizando o kit
High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA, USA)
conforme instruções do fabricante.
Foi realizada a análise da expressão do RNAm de NRAS, KRAS, NRAS e TP53 entre as diferentes linhagens celulares TPC1, BCPAP e 8505C infectadas e não infectadas pelo EBV (grupo controle) em diferentes momentos: logo após a adsorção viral (T0), após 4 horas da adsorção viral (T4), após 12 horas (T12), após 24h (T24) e após 48h (T48). Todos os experimentos foram realizados e analisados em triplicata biológica e técnica.
Foram utilizadas sondas marcadas por TaqMan (Applied Biosystems, Lincoln
Centre Drive Foster City, CA, USA). Todas as sondas utilizadas eram inventoriadas,
ou seja, possuem padrão de qualidade já testado e garantido pela Applied Biosystems (Tabela 1).
Tabela 1 - Sondas utilizadas nas reações de quantificação de RNAm.
Gene Código de identificação da sonda na Applied Biosystems NRAS Hs00364284_g1 HRAS Hs00978050_g1 KRAS Hs00364284_g1 TP53 Hs01034249_m1 ACTB Hs99999903_m1 GAPDH Hs02758991_g1
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Uma vez que a quantificação relativa do RNAm descreve a diferença de expressão do gene alvo na célula tireoidiana infectada com o EBV em relação à célula não infectada, o gene ACTB e o gene GAPDH foram utilizados como controles endógenos, para validação do sistema; as células tireoidianas não infectadas pelo vírus foram utilizadas como controle (85, 86).
Foram utilizados para cada amostra: 2μl de Buffer RT 10X, 0,8μl de dNTP Mix 25X (100mM), 2,0μl de Randon Primers RT, 1 μl de MultiScribe™ Reverse Transcriptase (50 U/μL), 1-2μg do RNA (volume variável de RNA conforme quantificação) e água para um volume final de 20μl. As amostras foram amplificadas em termociclador (Applied Biosystems™) com ciclos de 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. As amostras de cDNA foram diluídas para uma concentração final de 10ng/µl.
As reações foram feitas em triplicata, utilizando para cada reação: 6,0μl de TaqMan Gene Expression PCR Master Mix (concentração final de 2x), 0,3μl do ensaio (sonda e primers), 1,7μl de água milli-Q e 4μl de cDNA, totalizando volume final de 12,0 μl. Os seguintes ciclos foram utilizados na PCR: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, 45 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto.
Os dados obtidos no programa 7500 System SDS Software (Applied
Biosystems, Foster City, EUA) foram exportados em planilha Microsoft Office Excel,
versão 2017 e analisados pelo método do 2-ΔΔCt (87). Foram analisados os valores de fold-change, que refletem a expressão do gene alvo nas células cultivadas inoculadas pelo EBV em relação aos controles pareados em seus respectivos tempos (T0, T4, T12, T24 e T48), das células não inoculadas, e esses valores foram representados como uma variável quantitativa, medida em Unidades Arbitrárias (UA). Foram comparados os valores de fold-change (FC) das células inoculadas versus as células controle em triplicata.
3.4 Análise Estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada através do programa Statistical
Package for the Social Sciences (SPSS)® software, versão 13.0. Para avaliar se os
dados possuíam distribuição normal foi realizado o teste de Shapiro-Wilk; uma vez confirmada a distribuição normal da amostra, a mesma foi assumida como
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paramétrica; caso não passasse no teste de normalidade, foi considerada não paramétrica.
Para análise da comparação das médias dos valores de fold change de expressão gênica das células inoculadas versus não inoculadas foi utilizado teste de análise para variáveis independentes para cada tempo (T0, T4, T12, T24 e T48), para amostras paramétricas foi utilizado o Teste T e para amostras não paramétricas o teste de Mann-Whitney.
Para analisar se os resultados obtidos com análise da carga viral e da expressão gênica se correlacionavam, utilizou-se o Teste de Wilcoxon, não paramétrico. Em todos as análises foi utilizado um nível de significância de p<0,05.
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4. RESULTADOS
4.1 Adaptação do EBV nas células tireoidianas - “Passagens às cegas”
Após o primeiro teste de passagem às cegas na célula TPC-1, foi confirmada a inserção do vírus na célula tireoidiana, pois as mesmas apresentaram carga viral de aproximadamente 7000 cópias virais/µl. Foram realizadas ao todo 6 passagens do EBV na célula TPC-1, sendo que foi observado efeito citopático na 4ª passagem, com formação de sincícios e perda da adesão celular com desprendimento da monocamada (Figura 8) (Tabela 2).
Figura 8 – Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem TPC-1. A: Célula TPC-1 controle, aumento de 40 x; B: Célula TPC-1 controle, aumento de 200 x; C: Célula TPC-1 inoculada pelo EBV, formação de sincícios e perda da monocamada celular, aumento de 40 x; D: Célula TPC-1 inoculada, aglomerados celulares e perda da monocamada celular, aumento de 200 x.
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Tabela 2 - Resumo dos resultados obtidos com as passagens às cegas nas linhagens celulares neoplásicas TPC-1, BCPAP e 8505C.
Linhagem Celular
Derivada de: Permissividade ao vírus (cópias virais/µl) Nº de passagens Presença de efeito citopático TPC-1 Carcinoma papilífero 7.000 6 Sim (4ª passagem)
BCPAP Carcinoma pouco
diferenciado 4.720 2 Não 8505C Carcinoma anaplásico 13.540 2 Sim (1ª passagem)
Em relação às passagens às cegas na célula 8505C, a célula permitiu a inserção de cerca de 13 mil cópias virais/µl. Foram realizadas duas passagens pois logo na 1ª passagem já foi observado efeito citopático (Figura 9).
Figura 9 - Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem 8505C. A: Célula 8505C controle, aumento de 40 x; B: Célula 8505C controle, aumento de 200 x; C: Célula 8505C inoculada pelo EBV com aglomerados celulares, aumento de 40 x; D: Célula 8505C inoculada pelo EBV, borda da garrafa com perda da monocamada, aumento de 200 x.
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Em relação às passagens às cegas na célula BCPAP, a célula permitiu a entrada de cerca de 4700 cópias virais/µl. Foram realizadas ao todo duas passagens nessa linhagem celular, pois na segunda passagem já não havia mais carga viral detectável pela PCRq e também não foi observado efeito citopático (Figura 10).
Figura 10 - Análise microscópica das alterações celulares morfológicas na linhagem BCPAP. A: Célula BCPAP controle, aumento de 40 x; B: Célula BCPAP controle, aumento de 200 x; C: Célula BCPAP inoculada, aumento de 40 x; D: Célula BCPAP inoculada, aumento de 200 x.
4.2 Cinética viral
4.2.1 Análise da carga viral
Ao analisarmos a carga viral do sobrenadante (extracelular) nos tempos T0, T4, T12, T24 e T48 na cinética da célula TPC-1 observamos que a curva foi decrescente. A carga viral inicial no momento da inoculação foi de 109.400 cópias virais/µl, com queda de 30% da carga viral nas primeiras quatro horas; após 8 horas (T12) houve queda de mais 16% em relação à carga viral anterior; após mais 12 horas (T24)
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permaneceu a queda de 16% e por fim, após mais 24h (T48), não houve mais vírus detectável intracelular ou extracelular (Figura 11).
Figura 11 – Curva de crescimento de múltiplos passos do EBV na linhagem celular TPC-1.
Em ambas as células, BCPAP e 8505C, a curva de crescimento na cinética viral foi similar. Ambas apresentaram dois estágios de eclipse (momento em que a carga viral extracelular diminui enquanto o vírus se repica no interior da célula). Na célula BCPAP, observamos que houve um grande aumento nas primeiras quatro horas: a carga viral foi de 372.000 cópias virais/µl inicialmente em T0, evoluindo para 6.188.500 cópias virais/µl em T4, um aumento de 16,6 vezes. Nas 8 horas seguintes houve um decréscimo de 29% (em T12). Após mais 12 horas, a curva continuou a cair com diminuição de 52% em T24 em relação à carga viral anterior. No entanto, nas 24 horas seguintes, em T48, houve um grande aumento de 5 vezes da carga viral, que subiu para 11.168.500 cópias virais/µl. Enquanto que a carga viral intracelular manteve-se sempre abaixo da carga viral extracelular (Figura 12).
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Figura 12 – Curva de crescimento do EBV na linhagem celular BCPAP.
Já em relação à análise da célula 8505C, houve uma drástica diminuição da carga viral inicial, que foi de 3.184.000 cópias virais/µl em T0 para 456.000 cópias virais/µl em T4, uma queda de 86%. No entanto, nas 8 horas seguintes, em T12, houve um significativo aumento (15 vezes), subindo para 6.791.000 cópias virais/µl. Nas 12 horas seguintes, em T24, a carga viral voltou a diminuir com queda de 78%, e por fim voltou a subir de 1.520.000 cópias virais/µl em T24 para 2.498.000 cópias virais/µl em T48. Semelhantemente à BCPAP, na linhagem 8505C a carga viral intracelular manteve-se linear e abaixo da carga viral extracelular (Figura 13).
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Figura 13 - Curva de crescimento do EBV na célula 8505C.
4.3 Análise da Expressão Gênica Diferencial
Em relação à análise da expressão gênica, os resultados são diferentes quando comparados de acordo com o tempo (p=0,0003; ANOVA) e de acordo com os diferentes tipos celulares (p=0,0223; ANOVA). E de fato, a expressão variou drasticamente nos diferentes tempos analisados na cinética viral, no entanto em todas as linhagens essa diferença não foi significativa na comparação de tempo, linhagem e gene analisado (Tabela 3). No entanto foi observada uma tendência ao aumento da expressão de TP53 e uma diminuição de NRAS tanto na linhagem de células TPC-1 quanto na linhagem de células BCPAP inoculadas pelo EBV, especialmente após 48 horas após a inoculação viral (Figura 14 eFigura 15). Em contraste, na linhagem 8505C foi observado um aumento da expressão de NRAS e KRAS e uma diminuição de TP53 (Figura 16). Além disso, a expressão de KRAS e HRAS variou durante o tempo e de acordo com o tipo celular analisados e não foi observado nenhuma tendência nas células inoculadas.
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Tabela 3 - Análise da expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS no grupo de células inoculadas pelo EBV versus grupo controle de células não inoculadas. Valores expressos em médias e desvio padrão das unidades de expressão relativa (Fold change).
TP53 NRAS KRAS HRAS
Linhagem Tempo após inoculação Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p Inoculada (M±DP) Controle (M±DP) Valor de p T P C -1 T0 1,07±0,17 1,03±0,33 NS 0,85±0,08 1,65±0,27 NS 1,32±0,34 1,28±0,69 NS 1,21±0,76 0,87±0,32 NS T4 1,17±0,4 1,05±0,04 1,42±0,29 1,47±0,15 1,13±0,33 1,27±0,33 1,23±0,82 1,11±0,38 T12 1,32±0,26 1,12±0,13 1,25±0,41 1,43±0,18 1,63±0,42 0,93±0,36 1,34±0,36 1,19±0,22 T24 1,68±0,72 1,23±1,11 1,27±0,62 1,34±0,63 1,95±1,15 1,09±0,99 1,53±1,25 0,75±0,39 T48 2,56±3,73 1,4±1,29 6,03±3,90 0,33±0,34 0,37±0,35 1,83±2,08 0,43±0,06 1,64±0,92 BCPA P T0 1,37±0,35 0,78±0,61 NS 1,71±1,06 1,4±1,12 NS 1,17±0,58 1,25±0,09 NS 1,23±0,39 1,01±0,27 NS T4 0,75±0,34 1,54±1,96 1,84±1,09 2,97±3,23 0,66±0,42 3,79±5,08 1,1±0,87 1,99±2,50 T12 1,24±1,04 0,41±0,34 5,16±6,98 0,86±0,59 2,88±4,10 0,56±0,35 1,49±0,23 0,71±0,20 T24 1,5±0,31 0,36±0,29 2,97±1,59 0,78±0,47 1,45±0,71 0,63±0,13 1,81±1,19 0,90±0,13 T48 1,76±1,15 1,27±1,14 1,53±0,99 1,15±0,37 0,16±0,19 1,54±0,45 0,70±0,37 1,56±0,66 85 05 C T0 0,87±0,55 1,72±1,11 NS 0,22±0,19 2,68±1,09 NS 3,76±3,22 1,38±0,76 NS 3,12±2,29 0,79±0,39 NS T4 0,82±0,76 1,48±0,51 2,84±2,56 0,59±0,15 1,34±0,80 1,07±0,52 0,41±0,33 0,86±0,7 T12 0,27±0,14 1,17±0,92 4,43±3,55 1,22±0,40 3,96±3,55 2,65±2,87 0,67±0,74 1,68±2,22 T24 1,93±2,32 1,04±1,13 5,91±3,28 0,45±0,25 3,11±2,27 0,75±0,67 0,88±0,29 0,97±1,31 T48 0,63±0,76 0,85±0,53 3,54±2,61 0,65±0,48 1,20±0,86 1,02±0,84 1,89±2,08 0,82±0,44 * NS = Resultados não significativos (p<0,05) analisados por Mann-Whitney.
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Figura 14 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem TPC-1 na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
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Figura 15 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem BCPAP na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
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Figura 16 - Expressão gênica de TP53, NRAS, KRAS e HRAS na linhagem 8505C na cinética viral. Comparação entre as células inoculadas versus grupo controle, nos diferentes tempos após a inoculação viral.
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5. DISCUSSÃO
Este trabalho foi pioneiro na investigação dos efeitos da presença do EBV nas linhagens de células neoplásicas tireoidianas, tanto na morfologia, quanto na expressão dos oncogenes da família RAS e do gene supressor tumoral TP53. Entretanto dois outros autores já investigaram a relação da presença do vírus EBV e mutações em genes da família RAS em outras neoplasias: Zaravinos e colaboradores na Grécia (88) e Sole e colaboradores da Espanha (89). Zaravinos e colaboradores (88) analisaram a presença do papiloma vírus humano (HPV), cytomegalovirus (CMV), herpes simplex virus (HSV) e Epstein-Barr virus (EBV) em amostras de biópsia de pele pela técnica de PCR convencional e correlacionaram com a presença de mutações do gene RAS. No entanto, não encontraram nenhuma amostra positiva para a presença de EBV. Três amostras, infectadas pelo HPV e CMV, possuíam mutação em HRAS (88). Sole e colaboradores (89) analisaram 37 pacientes portadores de câncer cólon retal, dentre os quais 17 (46%) eram EBV positivos. Entre os pacientes infetados pelo EBV, 5 (29%) possuíam mutação de KRAS. Os autores sugeriram que a detecção do status viral pode auxiliar no estadiamento dos tumores de cólon retal e ainda que haja associação do status viral com a presença de mutações em KRAS (89).
Na análise da permissividade das células neoplásicas tireoidianas ao EBV, todas as linhagens permitiram a entrada do vírus, demonstrando que as células tireoidianas são permissivas ao EBV, corroborando os achados anteriores de nosso grupo (24).
A infecção do EBV nas células tireoidianas demonstra que é possível que o vírus infecte outras células as quais normalmente não possui tropismo natural. De fato, o EBV possui tropismo por linfócitos B (19), mas sabemos que ele pode infectar células epiteliais, como é o caso em carcinomas de nasofaringe que possuem alta taxa de infectividade por EBV (16, 19, 90, 91). Alguns autores preconizam que o vírus seja usado até mesmo como marcador para esta neoplasia (19, 92). A literatura sugere que uma cepa específica do EBV, a cepa M81 isolada de um carcinoma de nasofaringe de um paciente chinês (93), possui o chamado tropismo reverso, isto é, tem habilidade viral reduzida em linfócitos B e alta propensão em infectar células epiteliais (31). No entanto, a cepa utilizada em nosso trabalho foi a B95-8, que infecta
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linfócitos B mas dificilmente infecta células epiteliais (19, 24, 31), demonstrando que também essa cepa é capaz de infectar células epiteliais.
As linhagens neoplásicas tireoidianas não só foram permissivas à entrada do EBV como também o vírus foi capaz de causar efeitos citopáticos nas células da linhagem TPC-1 e 8505C. A linhagem BCPAP permitiu a entrada do vírus, mas não houve nenhuma alteração morfológica na célula, provavelmente pelo baixo número de passagens às cegas, pois como essa célula se desenvolve mais lentamente do que as outras talvez o vírus demore um pouco mais para se adaptar a ela. As alterações causadas pelo EBV nas linhagens TPC-1 e 8505C foram as mesmas: formação de sincícios celulares e perda da adesão celular com perda da monocamada, o que é compatível com as alterações in vitro causada pelo EBV nos linfócitos (15, 94), inclusive compatível com as alterações causadas pelo vírus na linhagem celular de linfócitos imortalizados produtores de EBV, que recebe o mesmo nome da cepa, a B95-8 (15, 94). Essa ação citopática poderia contribuir para a contenção da progressão de alguns tumores tireoidianos. De fato, a TPC1 é uma linhagem derivada do mais comum tipo histológico de CDT encontrado na população, o CPT. Sabemos que uma grande parte dos CPT não progride clinicamente, particularmente os tumores pequenos (95). Sendo assim, a identificação de fatores relacionados à contenção da progressão destes tumores seria de vital importância clinico-epidemiológica.
Em relação à análise da cinética da carga viral, tanto a linhagem BCPAP quanto a 8505C se comportaram de maneira similar, pois o vírus passou por um curto estágio de eclipse, que é quando a carga viral extracelular diminui enquanto o vírus se replica no interior da célula hospedeira, em ambas as células esse período foi de 4 horas no primeiro estágio de eclipse e na célula 8505C o segundo estágio de eclipse foi de 12 horas e na BCPAP foi de cerca de 20 horas produzindo mais de 11 milhões de partículas virais. A literatura mostra que o estágio de eclipse dos herpesvirus pode chegar até 40 horas (15, 81), sendo assim a replicação do EBV nas linhagens tireoidianas foi mais rápida do que em outras células. Em contraste, na linhagem TPC-1 a carga viral do EBV vai diminuindo com o passar do tempo, demonstrando uma curva de crescimento de múltiplos passos (termo do inglês: multistep virus growth
curve) o que pode indicar que o vírus estabeleceu latência na célula TPC-1 derivada
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população. Este é o primeiro trabalho a relatar o estabelecimento de latência do EBV nas células tireoidianas in vitro.
Em geral, estudos com o EBV in vitro, realizam experimentos de cinética viral com um maior tempo de análise, com mais pontos como T72 por exemplo (15, 79, 94). No entanto, as linhagens de células neoplásicas que utilizamos, por já conterem alterações genéticas, se multiplicam muito rápido e não suportam ficar muitos dias em experimento. Em contrapartida, observamos que, mesmo com apenas dois dias de experimento (até T48), já houve alterações provocadas pelo vírus, sugerindo que ele realmente desempenha papel importante no processo tumorigenico.
Em relação à análise da expressão gênica, nossos dados demonstram que a expressão dos genes da família RAS (KRAS, NRAS e HRAS) e do gene supressor tumoral TP53 varia nos diferentes tempos de análise.
A expressão gênica na linhagem TPC-1 foi maior no tempo T24, com hiperexpressão inclusive de TP53, o que já era esperado pois como um gene supressor tumoral estava exercendo seu papel (96) justamente quando os oncogenes também estavam hiperexpressos. Em contrapartida, nas células do grupo controle, no tempo T24 houve hipoexpressão de todos os genes analisado (KRAS, NRAS, HRAS e TP53), demonstrando que de fato o vírus aumentou a expressão dos oncogenes.
Na linhagem celular BCPAP, a expressão gênica nas células inoculadas pelo vírus foi maior 12 horas após a inoculação (T12), com hiperexpressão de todos os genes analisados. Sendo que os genes NRAS e KRAS novamente foram os que estiveram mais expressos em T12 em relação às células do grupo controle. O gene
TP53 também teve sua expressão dobrada justamente no tempo T12, quando os
oncogenes estavam hiperexpressos, novamente cumprindo o papel esperado de gene supressor tumoral. Já nas células do grupo controle também houve hiperexpressão de todos os genes analisados, porém no tempo T4, mostrando que o vírus pareceu retardar a expressão dos oncogenes, que se hiperexpressam apenas 12 horas depois, no entanto essa expressão foi bem maior nas células inoculadas em relação ao grupo controle.
Já na linhagem 8505C, que são células neoplásicas que já carregam mutação de BRAF V600E e TP53 (75), todos os genes começaram a se expressar após 12 horas, que foi justamente o tempo em que houve maior pico da carga viral. O gene
NRAS novamente foi o mais hiperexpresso, com cerca de 10 vezes maior expressão
