Análise imuno-histoquímica

De acordo com a disponibilidade de material biológico, entre a totalidade dos 30 animais foram selecionados 24 tumores para a realização da imunohistoquímica com os anticorpos para Glicoproteína P, LRP, BCRP e Metalotioneína (Quadro 3). Para o procedimento imunohistoquímico é importante referir que previamente foram necessários estudos preliminares para apuramento da técnica e padronização do anticorpo, para cada marcador individualmente, a fim de otimizar os resultados.

Foram realizados cortes histológicos de 5 µm de espessura nos blocos dos animais selecionados, os quais foram desparafinados, hidratados e submetidos ao desmascaramento antigénico em panela de pressão elétrica durante 20 minutos, utilizando solução tampão (pH 6,0 ou pH 9,0) de acordo com o Quadro 3. Posteriormente, as lâminas foram submetidas ao bloqueio da peroxidase endógena em solução de H2O2 6% por 30 minutos, protegido da luz e de seguida lavagem em água corrente e destilada com posterior colocação destas lâminas em tampão de lavagem TBS. Procedeu-se então ao bloqueio de proteína com Protein Block (reagente Kit Spring – Cod SPD – 125), por 10 minutos, com uma temperatura de 20 a 25ºC. As lâminas foram incubadas com os anticorpos primários diluídos, nos títulos adequados, em diluente de anticorpo (Spring Cod – ADS 125) por um período de 60 minutos, a 20-25ºC em estufa (Quadro 3). Por fim, as lâminas foram lavadas com tampão de lavagem e foi iniciado o sistema de visualização. O primeiro reagente foi o Polimero Reveal HRP (Spring – Cód SPD 125), uma gota do reagente, por 10 minutos, em temperatura de 20 a 25ºC. O segundo reagente HRP Conjugate HRP (Spring – Cód SPD 125), aplicado por 15 minutos em temperatura de 20 a 25ºC. De seguida, foi aplicado o substrato cromógeno DAB Liquido (reagente Kit Spring-Cód SPD 125), por 5 minutos, em temperatura ambiente. Após incubação do DAB, foi retirado o excesso do cromógeno no papel filtro e lavado em água corrente seguido de água destilada. As lâminas foram contra coradas com Hematoxilina de Harris por 25 segundos, em seguida foram lavadas em água corrente e destilada e realizados 2 banhos rápidos em água amoniacal 0,5%. Depois disso, foram realizadas lavagens em água corrente e água destilada e as lâminas foram submetidas à bateria de desidratação. Para montagem, foram utilizadas lamelas e Permount como meio de montagem. Os controlos negativos foram realizados pela omissão dos anticorpos primários e substituídos por PBS.

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Quadro 3) Caracterização dos anticorpos primários utilizados

Marcador Marca Clone Tampão de desmascaramento Condições de desmascaramento Diluições de anticorpo LRP Santa Cruz 1014 EDTA (pH9,0) Panela de pressão elétrica, 125ºC, 20min 1:500

Glicoproteína P Enzo C494 Citrato (pH 6,0) Panela de pressão

elétrica, 125ºC, 20min 1:100 Metalotioneína (MT-1 e MT-2) Dako E9 EDTA (pH 9,0) Panela de pressão elétrica, 125ºC, 20min 1:100 BCRP-1 Santa Cruz BXP-21 Citrato (pH 6,0) Panela de pressão elétrica, 125ºC, 20min 1:200

4.2 Métodos de quantificação da imunoreacção

Todas as lâminas de imunohistoquímica foram classificadas por 3 observadores numa prova cega, em que os mesmos não conheciam previamente o seguimento clínico dos animais. Foi utilizado um microscópio óptico (10 lente x 40objetiva) e foram aleatoriamente escolhidos 10 campos de alta resolução para avaliar a intensidade de expressão dos 4 biomarcadores. Foi realizada uma observação exaustiva das preparações na sua totalidade e, em cada preparação, foi determinada, em termos percentuais, a fracção de células marcadas (%cels), e a intensidade da marcação (IM). As amostras foram classificadas de acordo com os seguintes parâmetros:

No caso da glicoproteína P e da metalotioneína, quando menos de 20% das células, em 10 campos de alta resolução, mostraram marcação membranar ou citoplasmática, considerou- se uma reacção fraca, de acordo com o descrito previamente por Petterino et al. em 2006, em estudos com cancros mamários em humanos.

A expressão do BCRP e do LRP foi considerada fraca quando menos de 10% das células tumorais foram marcadas, de acordo com o descrito por outros autores (Diestra et al. 2002, Rudas et al. 2003).

Quanto à intensidade da marcação, esta foi avaliada igualmente em todos os marcadores por comparação com o endotélio (usado como controlo interno positivo). As células que não demonstraram reação foram consideradas negativas, sendo que aquelas que demonstraram uma reação muito fraca comparada com o endotélio foram consideradas de intensidade fraca, as com intensidade de marcação semelhante ao endotélio foram

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classificadas com intensidades moderadas, e as que se destacavam relativamente ao endotélio com intensidade alta.

Recorreu-se a um score semi-quantitativo de imunoreatividade (Score) que mede tanto a intensidade da reação como a percentagem de células marcadas. A percentagem de células marcadas (%cels) foi agrupada em intervalos distintos para cada marcador (Quadro 4, 5, 6 e 7), de acordo com o referido na bibliografia. Quanto à intensidade da marcação (IM), utilizou- se um score previamente descrito por Remmele e Stegner 1987, no qual o grau 1 corresponde a uma marcação fraca, o 2 a uma marcação moderada e o 3 a uma marcação intensa. O produto destas duas categorias (%cels x IM) permite-nos então distinguir entre 3 scores de expressão, sendo que os intervalos variam de acordo com o encontrado na bibliografia para cada marcador.

Para efetuar a análise estatística, as amostras foram agrupadas em três categorias de imunoexpressão: Baixa (que inclui os de expressão negativa), Moderada e Alta.

4.2.1Glicoproteína P (Kim et al. 2012)

Quadro 4) Score semiquantitativo da imunoreacção para a Glicoproteína P

IM- intensidade de marcação

% céls – percentagem de células marcadas

O produto da intensidade da marcação com a percentagem de células marcadas origina os seguintes scores para a glicoproteína P:

Score 1 (< 3) – Expressão Baixa

Score 2 (3 ou 4) – Expressão Moderada Score 3 (6 a 9) – Expressão Alta

Intensidade da reacção IM Percentagem de células positivas % céls

Sem marcação 0 <20% 1

Fraca 1 20–50% 2

Moderada 2 >50% 3

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4.2.2LRP (Rudas et al. 2003)

Quadro 5) Score semiquantitativo da imunoreacção para a LRP

IM- intensidade de marcação

% céls – percentagem de células marcadas

O produto da intensidade da marcação com a percentagem de células marcadas origina os seguintes scores para a LRP:

Score 1 (< 3) – Expressão Baixa

Score 2 (3 ou 4) – Expressão Moderada Score 3 (6 a 12) – Expressão Alta

4.2.3Metalotioneína (Erginsoy et al. 2006)

Quadro 6) Score semiquantitativo da imunoreacção para a metalotioneína

IM- intensidade de marcação

% céls – percentagem de células marcadas

O produto da intensidade da marcação com a percentagem de células marcadas origina os seguintes scores para a metalotioneína:

Score 1 (< 3) – Expressão Baixa

Score 2 (3 ou 4) – Expressão Moderada Score 3 (6 a 12) – Expressão Alta

Intensidade da reacção IM Percentagem de células positivas %cels

Sem marcação 0 < ou = 10% 1

Fraca 1 11 a 30% 2

Moderada 2 31 a 69% 3

Intensa 3 >ou = 70% 4

Intensidade da reacção IM Percentagem de células positivas %cels

Sem marcação 0 <25% 1

Fraca 1 26 a 50% 2

Moderada 2 51 a 75% 3

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4.2.4 BCRP (Nowak, Madej, and Dziegiel 2009)

Quadro 7) Score semiquantitativo da imunoreacção para a BCRP

IM- intensidade de marcação

% céls – percentagem de células marcadas

O produto da intensidade da marcação com a percentagem de células marcadas origina

os seguintes scores:

Score 1 (< 3) – Expressão Baixa

Score 2 (3 ou 4) – Expressão Moderada Score 3 (6 a 12) – Expressão Alta