Análise da microsolvatação proteica de acordo com a alteração do estado de protonação de Asp/Glu

A solvatação proteica por água e uréia para uma larga camada de solvatação (distância até 10 Å) foram apresentados nas Figuras 3.6A-C (de acordo com 𝐺𝑠𝑠= (𝑔_{𝑠𝑠(𝑟)}− 1)𝑑𝑉(𝑟), descrito na seção 3.1.2). Estes valores de KBI podem ser correlacionados com a concentração de uréia, fornecendo um parâmetro de interação preferencial (Г),96,97 _{uma estimativa do volume molar de excesso do osmólito, podendo} ser positivo ou negativo, de acordo com a afinidade pela superfície proteica. O cálculo de Гuréia é calculado a partir de Gss e da concentração de uréia:

Г_{𝑢𝑟 é𝑖𝑎} = 𝐶𝑜𝑛𝑐_{𝑢𝑟 é𝑖𝑎} 𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑥 𝐺𝑠𝑠𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ⋯ 𝑢𝑟é𝑖𝑎 ( 𝑐𝑚3 𝑚𝑜𝑙) − 𝐺𝑠𝑠𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ⋯ á𝑔𝑢𝑎 ( 𝑐𝑚3 𝑚𝑜𝑙) Asp/Glu protonados: [urea] = 1,01 mol/L G(prot-água) = -26234,00 cc/mol G(prot-urea) = -11758,60 cc/mol Г = 1,01x[(-11758,60)-(-26234,00)] = 14620,76 cc/L ou 14,62 Asp/Glu desprotonados: [urea] = 1,01 mol/L G(prot-água) = -25766,60 cc/mol G(prot-urea) = -8566,98 cc/mol Г = 1,01x[(-8566,98)-(-25766,60)] = 17371,62 cc/L ou 17,37

Capítulo 3. Microsolvatação da enzima BCL por uréia: considerações sobre o estado de protonação dos resíduos ácidos Aspartato e Glutamato

Podemos observar que ambos os valores de Г são positivos, mostrando que a superfície proteica é preferencialmente solvatada pela uréia, independentemente do estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu. Porém, podemos observar que o parâmetro de interação preferencial Г é ~14,62 quando Asp/Glu estão protonados, aumentando cerca de 19% para ~17,37 quando Asp/Glu estão na forma desprotonada. Isto mostra que, em um ambiente ácido, a protonação dos resíduos de Asp/Glu leva ao decréscimo na afinidade proteína⋯uréia.

Detalhes de alterações na microsolvatação por água e uréia na primeira e na segunda camada de solvatação, de acordo com o estado de protonação de Asp/Glu, podem ser estudados avaliando valores das integrais de Kirkwood-Buff associados a cada camada de solvatação, de acordo com um parâmetro de solvatação 𝛾𝑠𝑜𝑙𝑣 definido como: 𝛾𝑠𝑜𝑙𝑣 = 𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣1ª /𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣2ª , mostrado nas Figuras 3.6D-F, onde 𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣1ª é o valor de KBI para a primeira camada de solvatação (FSL) e 𝐺_{𝑠𝑜𝑙𝑣}2ª o valor de KBI para a segunda camada de solvatação (SSL), de acordo com as áreas sob as curvas mostradas na Figuras 3.5E e F,53 detalhados a seguir.

Nas Figuras 3.6A-C é possível observar a convergência dos valores de Gsolv para proteína-uréia e proteína-água de acordo com o estado de protonação de Asp/Glu. É observada uma leve exclusão de moléculas de água promovida por uréia, comparação das Figuras 3.6A e 3.6B. Isto ocorre por causa do efeito competitivo destas moléculas pela superfície da enzima BCL, que exclui moléculas de água para camadas mais distantes da proteína.76 _{Na Figura 3.6C, o valor de Gsolv associado as moléculas de uréia} (protein-uréia) é menos negativo (~-10x103_{) quando comparado com Gsolv para} proteína-água (~-25x103_{). Isto mostra a grande afinidade de moléculas de uréia pelas} duas camadas de solvatação (ver Figura 3.5D, Gss de 1.62 até 3.37 Å). De forma geral, Gsolv proteína-água é levemente afetada pela protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu. Isto significa que a translação das moléculas de água nas camadas mais internas de solvatação, devido as alterações no estado de protonação, não interfere significativamente no valor total de convergência de Gss. Por outro lado, este efeito é

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bem mais evidente para interações proteína-uréia, dado pelo maior valor negativo de Gss, mostrado na Figura 3.6C, mostrando que a afinidade de uréia pela superfície proteica é dependente do estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu.

Podemos acompanhar o deslocamento de moléculas de água e uréia especificamente nas duas primeiras camadas de solvatação mais próximas da proteína, e monitorar o deslocamento de ambas as moléculas dependentes da alteração no estado de protonação dos resíduos Asp/Glu. Este olhar ampliado (zoom) nesta região próxima da enzima BCL é analisado de acordo com os respectivos valores de Gsolv associados a estas duas camadas, mostrado nas Figuras 3.6D-F.

O efeito competitivo que a uréia desempenha, faz com que moléculas de água sejam excluídas proporcionalmente de ambas as camadas de solvatação, isto é observado pelo mesmo valor de 𝛾𝑠𝑜𝑙𝑣, comparação entre as Figuras 3.6D e 3.5E (~0,7 para Asp/Glu desprotonado e ~0.5 para Asp/Glu protonado, igualmente para os dois sistemas). Ademais, moléculas de uréia apresentam alta afinidade pela primeira camada de solvatação comparativamente à segunda camada, dado pelo alto valor de 𝛾_{𝑠𝑜𝑙𝑣} (~1.65), mostrado na Figura 3.6F. No entanto, a protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu leva a decréscimo de 𝛾_{𝑠𝑜𝑙𝑣} para proteína-uréia, revelando uma exclusão significativa de moléculas de uréia da primeira camada de solvatação, em relação a segunda camada. Como já discutido anteriormente, isto é explicado pela perda da efetividade das ligações de hidrogênio proteína⋯uréia. Este decréscimo também é observado para as interações proteína-água, de acordo também com a perda de orientação das ligações de hidrogênio. É importante destacar o grande decréscimo em 𝛾𝑠𝑜𝑙𝑣 para proteína-uréia (~1.65 para 1.12, Figura 3.6F), confirmando que a afinidade das moléculas de uréia depende do estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu. Portanto, efeitos de desnaturação proteica induzida por uréia em pH ácido não devem ser discutidos em termos de aumento da solvatação proteica por uréia, ou do aumento de interações diretas com resíduos da superfície proteica.

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Figura 3. 6 Valores de Gss para a solvatação da enzima BCL por água e uréia, de acordo com o estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu. Em (A-C) Gss considerando uma camada de solvatação espessa até 10 Å (Gsolv). Em (D-F) proporcionalidade de solvatação das duas primeiras camadas, dada por 𝜸𝒔𝒐𝒍𝒗 = 𝑮𝒔𝒐𝒍𝒗𝟏ª /𝑮𝒔𝒐𝒍𝒗𝟐ª , de acordo com Gss para a primeira camada de solvatação (FSL) e segunda camada de solvatação (SSL), definidas pelas áreas sob os respectivos picos de máximo.

A partir das análises dos resultados de microsolvatação proteica, podemos construir um modelo simples que mostra como ocorre a translação de moléculas de uréia nas duas camadas de solvatação mais próximas da superfície da proteína, de acordo com o estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu, apresentado na Figura 3.7. De acordo com o parâmetro 𝛾_{𝑠𝑜𝑙𝑣} , podemos sugerir que existem dois comportamentos distintos para a solvatação de proteínas por uréia (e para água também) dependente dos estados de protonação dos resíduos Asp/Glu:

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(I) Sentido direto no deslocamento do equilíbrio do modelo. Quando os resíduos Asp/Glu estão protonados, ocorre decréscimo nas orientações das ligações de hidrogênio (perda de afinidade) proteína⋯uréia. Isto leva ao deslocamento de moléculas de uréia da primeira para a segunda camada de solvatação (a mesma interpretação pode ser feita para as interações proteína⋯água). Com isso, em uma situação de ambiente com pH ácido em que a proteína esteja imersa, pode-se sugerir que as moléculas de uréia percam parte da afinidade pela superfície proteica e que as interpretações dos resultados de desnovelamento induzido por uréia em pH baixo devem considerar este comportamento;

(II) Sentido inverso no deslocamento do equilíbrio do modelo. Por outro lado, quando os resíduos Asp/Glu estão desprotonados, ocorre aumento na afinidade por moléculas de uréia (ligações de hidrogênio bem orientadas). Isto faz com que moléculas de uréia fiquem concentradas na primeira camada de solvatação, interagindo fortemente com os resíduos da superfície proteica (interpretação valida para as moléculas de água também). Ou seja, em um ambiente de pH alcalino, o deslocamento do equilíbrio para o estado desprotonado dos resíduos Asp/Glu leva ao aumento da concentração de uréia na supefície proteica. Portanto, simplesmente aumentar a solvatação por uréia não deve necessariamente aumentar o caráter desnaturante desta molécula.

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Figura 3. 7 Modelo da microsolvatação proteica por água e uréia de acordo com o estado de protonação dos resíduos ácidos Asp/Glu. O fluxo de moléculas está associado aos valores de KBI calculados para as primeira e segunda camadas de solvatação.