Análise de polimorfismos no gene ccoaomt

A amplificação de segmentos do gene ccoaomt em três espécies de Eucalyptus teve

como objetivo inicial o estudo da diversidade nucleotídica e haplotípica em um segmento

deste gene. Foram observados SNPs tanto em regiões codificadoras como em não

codificadoras deste segmento gênico.

A comparação entre os segmentos do gene ccoaomt se baseou na análise de uma

mesma região, com igual número de bases e em confronto a uma seqüência de referência. De

acordo com a seqüência de referência, para as três espécies em estudo, um total de 12

diferentes SNPs e uma inserção com 5 nucleotídeos foram os polimorfismos encontrados no

fragmento do gene ccoaomt amplificado neste estudo. A deleção de apenas uma base em dois

indivíduos de E. urophylla também foi encontrada.

Dentre os SNPs encontrados para os indivíduos de E. grandis, aquele na posição 238

implicaria na alteração do aminoácido, de uma valina para uma fenilalanina, ambos não

polares, resultando em uma mutação sinônima. Esta alteração, por se encontrar na região de

exon, pode ter uma grande importância na formação da estrutura final da proteína onde apenas

um aminoácido modificado pode acarretar alterações drásticas na sua função. Esta hipótese

deve ainda ser testada em estudos de expressão gênica e análises cristalográficas em mutantes

naturais ou transgênicos, além da verificação da possibilidade de alteração de especificidade

do substrato, caso o polimorfismo esteja relacionado ao sítio catalítico da enzima.

Em E. globulus, diferentemente de E. grandis, polimorfismos foram encontrados

apenas nas regiões de introns. É bem descrito na literatura que a maior proporção de

polimorfismo de seqüência é encontrada na região de introns, pela fraca ou ausente pressão de

seleção (CHING et al., 2002). Assim como em E. globulus, E. grandis e E. urophylla também

apresentaram polimorfismos em introns. De igual maneira à E. grandis, E. urophylla também

Na posição 431, em E. urophylla, ocorreu uma mutação sinônima alterando o

aminoácido valina por uma leucina. Esta alteração pode, de alguma forma, modificar a

estrutura final da proteína mesmo conservando a característica apolar do aminoácido original.

Já na posição 238, um polimorfismo em relação à seqüência utilizada como referência foi

observada em E. urophylla. O polimorfismo estava fixado para todos os indivíduos, não

caracterizando assim um polimorfismo intra-específico. Entretanto, a alteração com relação à

seqüência de referência, alterou o aminoácido valina por uma fenilalanina, modificando o

aminoácido mas conservando a sua característica apolar, da mesma forma como encontrado

em E. grandis. Contudo, vale lembrar que nesta situação a alteração do aminoácido, mesmo

mantendo as características apolares, pode trazer modificações significativas para a estrutura

da proteína. O espaço físico necessário para o aminoácido inicial deverá ser alterado para

comportar a presença de um anel aromático, presente na estrutura da fenilalanina, o que pode

fisicamente trazer alterações significativas, assim como modificar a especificidade da enzima

resultante, já que a alteração pode influenciar diretamente no sítio catalítico da enzima. Este

resultado merece investigações mais detalhadas do efeito deste polimorfismo na atividade da

enzima CCoAOMT em E. urophylla com relação às outras duas espécies.

Outro polimorfismo na região de exon foi detectado em E. urophylla na posição 229, o

qual alteraria o aminoácido cisteína por uma arginina, resultando em uma mutação não

sinônima. Este tipo de alteração é grave, por alterar o aminoácido e a sua característica

original, inicialmente polar para um aminoácido básico. Este polimorfismo e sua conseqüente

alteração na estrutura primária da enzima CCoAOMT em E. urophylla abrem o caminho para

interessantes experimentos de bioquímica que podem gerar informações importantes sobre

uma potencial relação entre fenótipos de propriedades químicas da madeira e estes

polimorfismos. Vale ressaltar que E. urophylla é a única espécie que não ocorre no continente

espécie e monomórficos dentro de espécie são possivelmente posteriores ao processo de

especiação de E. urophylla e podem ser úteis para a identificação de germoplasmas, por

exemplo. Além disso, a tipagem deste SNP pode ser extremamente útil para a inferência da

participação de E. urophylla na geração de híbridos espontâneos no Brasil.

A mutação é a força geradora de variabilidade. Uma mutação causada por substituição

nucleotídica, inserção/deleção, recombinação ou conversão gênica, pode se propagar na

população por efeito de deriva, fluxo gênico e/ou seleção natural e, eventualmente, ser fixada

na espécie (NEI & KUMAR, 2000). Entre as espécies estudadas, vários polimorfismos foram

identificados como comuns e espécie-específicos. O polimorfismo na posição 167 se encontra

fixado para a espécie E. globulus, com o alelo G em 100% dos indivíduos. Já para a espécie

E. grandis, 73,1% dos indivíduos apresentaram o alelo G em homozigose e 10,4% em

heterozigose, indicando que o alelo G ainda é o mais freqüente. Para E. urophylla, a diferença

é significativa, com apenas 11,6% dos indivíduos homozigotos para o alelo G e a grande

maioria dos indivíduos homozigotos para o alelo A. Estas diferenças em freqüências alélicas

refletem o processo de especiação, que normalmente traz vantagens para a adaptação e

permanência da espécie no meio ambiente, embora possa também ser apenas o resultado de

efeito de deriva. Por estar localizado em região de intron, as diferenças para este

polimorfismo são possivelmente resultantes de efeito de deriva por não ter conseqüências

diretas na formação da proteína, mas pode haver influências indiretas, como sinais de ativação

de expressão gênica, indicativo de “splicing alternativo” para a formação das isoformas.

O polimorfismo da posição 238 está fixado para a espécie E. globulus e E. urophylla e

apresenta-se em 73,1% dos indivíduos em E. grandis. Este polimorfismo encontra-se na

região de exon e a conseqüência de uma variação nesta região pode ser mais significativa que

as alterações localizadas nas regiões de introns, por alterar o aminoácido, produto da leitura

formação da madeira, este pode ser um polimorfismo importante que tem efeito direto sobre a

atividade enzimática da CCoAOMT e conseqüentemente na qualidade da madeira da espécie.

Assim como para o polimorfismo anteriormente descrito, estudos de associação devem ser

ainda realizados para a confirmação desta hipótese.

Há outros polimorfismos que estão presentes em uma espécie e ausente em outras. No

nosso estudo, foram observados os polimorfismos nas posições 10, 76, 154 e 368, presentes

somente na espécie E. grandis, assim como nas posições 178, 179, 189, 229 e 431, presentes

somente em E. urophylla. Os sítios polimórficos presentes em E. globulus são todos também

observados em E. grandis, não apresentando polimorfismos específicos para esta espécie.

Observação semelhante foi feita no gênero Arabidopsis, comparando os níveis de

polimorfismo para o locus Adh (Álcool desidrogenase) para duas espécies, A. thaliana, com

predominância de autopolinização, e A. lyrata, com cruzamento aberto. A distribuição dos

sítios segregantes no gene foi muito diferente entre as duas espécies (INGVARSSON, 2005;

SAVOLAINEN et al., 2000). Esses polimorfismos espécie específicos podem ser importantes

no sentido de formarem um conjunto de marcadores altamente discriminatórios,

principalmente quando analisados na forma de haplótipos para a identificação de uma

determinada espécie ou de híbridos delas derivados.

Em E. urophylla observou-se ainda um polimorfismo de grande interesse para estudos

filogenéticos. No intron 2, observou-se em 53,5% dos indivíduos analisados, a presença de

uma inserção de 5 nucleotídeos, TCTGT, que se apresenta como uma duplicação dos 6

nucleotídeos anteriores, ATCTGT. Todos os indivíduos que possuem essa inserção possuem o

alelo A anterior à inserção, na posição 189, tornando o sítio polimórfico (Figura 43). Este

alelo é indicado como sendo um sítio polimórfico específico para a espécie E. urophylla. Essa

inserção, presente somente em indivíduos da espécie E. urophylla, pode também ser utilizada

Figura 43. Ilustração esquemática do alinhamento das seqüências obtidas por amplificação com iniciadores específicos em E. urophylla. Observações quanto à inserção encontrada em alguns indivíduos e a presença do alelo A antecedendo à inserção. Seqüências alinhadas pelo programa

SeqScape com a indicação de qualidade de bases (barras em azul).

A construção de um oligonucleotídeo iniciador ancorado de forma que a última base

no terminal 3’ coincida exatamente com a posição 189, permitiria a amplificação exclusiva de

indivíduos que apresentassem a inserção. Alternativamente, este indel de cinco bases poderia

ser facilmente detectado por eletroforese em gel de poliacrilamida. Este marcador, juntamente

com a análise dos vários SNPs com significativas diferenças de freqüências entre espécies

serão altamente úteis para a investigação da formação de híbridos envolvendo E. urophylla.