4 MATERIAL E MÉTODOS
4.3. ANÁLISE POR PCR
O PCR (Técnica da reação em cadeia da Polimerase) foi utilizado para a análise da presença de Treponema denticola, Treponema socranskii, Gemella
morbillorum, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella tannerae, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis, Parvimonas micra nas coletas dos canais radiculares e bolsas periodontais nas mesmas etapas de tratamento que a análise microbiológica clássica através de métodos bioquímicos de identificação.
4.3.1 Extração do DNA bacteriano
A extração de DNA foi realizada com o QIA amp DNA kit (QIAGEN, Chatsworth, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante (APÊNDICE IV).
4.3.2 Reação de PCR
A reação de PCR foi processada na quantidade de 25 µL de uma mistura de reagentes (Master Mix) contendo as quantidades especificadas no quadro 1 para 1,5 µL do DNA da amostra.
Reagentes Quantidade (µL) Tampão (10 x Reaction buffer Invitrogen ® - Life
Technology do Brasil) 2,5 µL
DNTPs (Invitrogen ® - Life Technology do Brasil): 0,5 µL
MgCl 2 (Invitrogen ® - Life Technology do Brasil) 1,25 µL
H2O MiliQ 17,625 µL
Primer Forward 100µM (Invitrogen ® - Life Technology do
Brasil) 0,75 µL
Primer Reverse 100µM (Invitrogen ® - Life Technology do
Brasil) 0,75 µL
Taq Platinum (Invitrogen ® - Life Technology do Brasil) 0,125 µL Quadro 1 - Proporções dos reagentes no Master Mix
A Taq DNA Polimerase escolhida foi a Platinum®Taq DNA Polymerase (Invitrogen® - Life Technology do Brasil) que não se degrada com o aumento
gradativo da temperatura, podendo ser acrescentada diretamente na mistura (Mix) da reação evitando a necessidade de hot start.
A determinação da temperatura de anelamento ideal foi feita através de reações de PCR contendo primers espécie-específicos (Quadro 2) realizadas em um aparelho termociclador convencional e submetidas a vários gradientes de temperatura (MJ96G, Biocycler, termocicladores, Curitiba, SC, Brasil) utilizando amostras ATCCs correspondentes e baseadas na literatura de suporte.
Espécies Região
Primers: Seqüência de nucleotídeos Referências
Comprimento do Amplicon
Reação
(ciclos padronizados no laboratório de Microbiologia Endodôntica da FOP-UNICAMP)
A
actinomycetemcomitans
16 S
5’ AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC 3’ 5’ ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 3’ Ashimoto et al., 1996 593 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação: 94°C por 30s
Anelamento: 50°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min F alocis 16 S 5’ CGT GGG TAA TCT GCC TTT GTC 3’ 5’ CCT TGG TGG GCT TTT ATC TCA 3’ Siqueira & Rôças, 1997
594 bp
• Desnaturação inicial: 95°C por 2 min
• 36 ciclos de:
Desnaturação: 94°C por 30s
Anelamento: 60°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min F nucleatum
16 S
5’ ATT GTG GCT AAA AAT TAT AGT T 3’ 5’ ACC CTC ACT TTG AGG ATT ATA G 3’ Ávila-Campos et al.,1999 1000 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 55°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min G morbillorum
16 S
5’ AGA GAC GGT ACC TAA CCA GAA 3’ 5’ TAT GAG GTT GGC TGA CTC TCG 3’ “Primer” desenhado pela autora a partir do seqüenciamento genético L14327 do Gen bank 781 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • ciclos de: Desnaturação: 94°C por 30s
Anelamento: 52°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento:
72°C por 10 min
Quadro 2 - Dados sobre as reações e “primers” espécie - específicos utilizados para cada microrganismo investigado.
Espécies Região
Primers: Seqüência de nucleotídeos Referências
Comprimento do Amplicon
Reação
P micra 16 S
5’AGA GTT TGA ATC CTG GCT CAG 3’ 5’ATA TCA TGC GAT TCT GTG GTC TC 3’ Conrads G et al., 1997 207 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 60°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min
P endodontalis
16 S
5’ GCT GCA GCT CAA CTG TAG TC 3’ 5’ CCG CTT CAT GTC ACC ATG TC 3’
Siqueira et al., 2001 672 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 58°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min P gingivalis
16 S
5’ CAA TAC TCG TAT GCC CGT TAT TC 3’
Conrads et al.,1996 5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ Edwards et al., 1989 478 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 58°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min
P intermedia
16 S
5’ TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG 3’ 5’ TCA ACA TCT CTG TAT CCT GCG T 3’
Slots et al., 1995 575 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 58°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min
Quadro 2 - Dados sobre as reações e “primers” espécie - específicos utilizados para cada microrganismo investigado (continuação).
Espécies Região
Primers: Seqüência de nucleotídeos Referências
Comprimento do Amplicon
Reação
P nigrescens
16 S
5’ ATG AAA CAA AGG TTT TCC GGT AAG 3’ 5’ CCC ACG TCT CTG TGG GCT GCG A 3’
Bogen & Slots, 1999
804 bp
• Desnaturação inicial: 95°C por 2 min
• 36 ciclos de:
Desnaturação 94°C por 30s
Anelamento: 58°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min P tannerae
16 S
5’ CTT AGC TTG CTA AGT ATG CCG 3’ 5’ CAG CTG ACT TAT ACT CCC G 3’
Xia et al., 2000 550 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação 94°C por 30s
Anelamento: 55°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min T forsythia 16 S 5´-TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3´ Slots et al., 1995 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ Edwards et al., 1989 641 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 56°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min T denticola
16 S
5’TAA TAC CGT ATG TGC TCA TTT ACA T 3’ 5’TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA 3’ Ashimoto et al., 1996 316 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação 94°C por 30s
Anelamento: 58°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min
Quadro 2 - Dados sobre as reações e “primers” espécie - específicos utilizados para cada microrganismo investigado (continuação).
Espécies Região
Primers: Seqüência de nucleotídeos Referências Comprimento do Amplicon Reação Treponema socranskii 16 S
5’ GAT CAC TGT ATA CGG AAG GTA GAC A 3’
5’ TAC ACT TAT TCC TCG GAC AG 3’
Siqueira et al., 2003 288 bp • Desnaturação inicial: 95°C por 2 min • 36 ciclos de: Desnaturação:94°C por 30s
Anelamento: 56°C por 1min
Extensão: 72°C por 2min
• Elongamento: 72°C por 10 min
Quadro 2 - Dados sobre as reações e “primers” espécie - específicos utilizados para cada microrganismo investigado (continuação).
Além das amostras, foram utilizados como controles positivos o DNA genômico purificado dos microrganismos investigados e como controle negativo água Mili Q esterilizada.
4.3.3 Eletroforese
As amostras após a reação de PCR (produtos da amplificação), foram conservadas a 4 °C ou analisadas imediatamente por eletroforese. Utilizou-se gel de agarose a 1% (Invitrogen® - Life Technology do Brasil) em tampão de Tris- borato EDTA (pH 8,0) e corado com brometo de etídio (5ug/mL-Invitrogen® - Life
Technology do Brasil).
Foi incluído em cada gel, um padrão de peso molecular de 100 bp (DNA ladder, Invitrogen® - Life Technology do Brasil). Após o término de cada corrida (60 volts por 1 hora), as bandas foram observadas com auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta. A documentação fotográfica dos géis foi obtida com o sistema Image Master-VDS (Pharmacia Biotech, Cambridge, England) e a
captura das imagens foram realizadas pelo programa LISCAP Image Capture software. As imagens ilustrativas podem ser conferidas na figura 5.
Figura 5- Processamento das amostras pelo método de PCR. A-Estação de trabalho para reações de PCR; B-Termociclador; C-Gel de agarose na cuba; D-Sistema de eletroforese; E- Sistema de imagens para leitura dos géis; F- Imagem dos géis após a corrente para análise.