4.7. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
4.7.4. Análise do produto amplificado
A visualização do produto amplificado (330 pares de base) foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2,0% (p/v), utilizando-se tampão de corrida TBE 0,5 X (0,04M tris-acetato e 0,001M EDTA, pH 8,0), segundo Sambrook et al. (1989).
Como controle positivo foi utilizado uma cultura com o sorovar Pomona, e como controle negativo foi utilizada água ultra pura.
Figura 12: Deposição do DNA amplificado e corado com azul de bromofenol no gel de agarose a 2,0% para revelação das bandas.
4.8. Análise Estatística
No experimento utilizou-se a análise de variância de delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (‘Split plot in time”). Para a comparação das médias geométricas dos títulos sorológicos empregou-se o Teste de Tukey (P>
0,05).
5. RESULTADOS
Na Tabela 1 são apresentados os resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR), dos isolamentos de Leptospira em meio de cultivo semi-sólido da urina de cada touro sororeagente submetido ao tratamento com estreptomicina das marcas A e B, e da cultura em meio semi-sólido de Fletcher das amostras de rins e antimicrobianos utilizados, sendo que no grupo 2 todos os animais foram positivos. Os resultados do cultivo para leptospira a partir dos rins e fígados dos hamsters inoculados com a urina dos touros sorologicamente reagentes mostraram que apenas nos animais do grupo 1, ou seja, tratados com a estreptomicina A, foi possível o isolamento de médias geométricas dos títulos sorológicos foram decrescentes a partir do 10 dia após o tratamento, nos touros que receberam a estreptomicina A (grupo 2), já no grupo 2 que foi tratado com a estreptomicina B os títulos começaram a cair apenas no 20 dia após o tratamento (Fig.13). No entanto, pelo Teste de Turkey as médias não diferiram entre si (P> 0,05).
Nas Figuras 14 e 15 pode-se verificar que, quando são comparadas as médias dos títulos sorológicos dos animais tratados com as médias dos seus respectivos grupos controle, verifica-se que quando os animais foram tratados, os
títulos sorológicos contra o sorovar Hardjo decresceram em um padrão constante, inicial aos não tratados, atingindo os títulos mais baixos entre 10 e 15 dias após a aplicação do medicamento. O que é comprovado pela análise do Teste de Tukey, que permite observar uma diferença significativa entre as médias dos títulos sorológicos encontrados nos animais tratados e não tratados, principalmente após 15 dias do tratamento, conforme demonstrados nas Tabelas 3 e 4.
Analise de variância do delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (“Split plot in time”), tendo como dois tratamentos principais (parcelas) os grupos tratados com a estreptomicina A e estreptomicina B, e sete tratamentos secundários (subparcelas) as datas experimentais.
Tabela 1: Resultados da reação em Cadeia da Polimerase e dos isolamentos em meio semi-sólido de urina de touros sororeagentes tratados com estreptomicina e cultura dos rins e fígado de hamsters.
Dia PCR urina bovina Cultivo urina bovina *Fígadoa *Rinsa Controle Rins Controle Fígado
1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 A A A A B B B A A A A B B B A A A A B B B A A A A B B B A A A A B B B A A A A B B B -1 N P N P N P P P P P P P P P P P P P N N N P P P P N N N N N N N N N N N N N N N N N 0 P P P P N P N P P P P P P N P P P P N N N P N P P N N N N N N N N N N N N N N N N N 1 N P P P N N P P P P P P N P P P N P N N N P N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N 2 N N N N N N P N P P N N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 3 N N N N N N N N P P N P P P N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 5 N N N N - - - N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 10 - - - - - - - N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 15 - - - - - - - N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 25 - - - - - - - N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
* vísceras de hamsters inoculados com urina bovina.
a “pool” com grupo de três hamsters; P: Positivo; N: Negativo; -: não realizado.
1A, 2A, 3A, 4A: Touros 1, 2, 3 e 4 tratados com a estreptomicina da marca A.
1B, 2B, 3B: Touros 1, 2 e 3 tratados com a estreptomicina da marca B.
Tabela 2 : Valores médios dos títulos sorológicos contra o sorovar Hardjo e resultados da análise de variância entre os tratamentos de touros sororeagentes a Leptospira com estreptomicina A (grupo 1) e estreptomicina B (grupo 2) (dados transformados em “log x 1”). minúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste Tukey (P > 0,05).
Analise de variância do delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (“Split plot in time”), tendo como dois tratamentos principais (parcelas) os grupos tratados com estreptomicina e controle e sete tratamentos secundários (subparcelas) as datas experimentais.
Figura 13 : Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira interrogans sorovar Hardjo dos animais tratados com as estreptomicinas das marcas A e B. Médias Geométricas (=antilogaritmo da Slog (x)/4).
Tabela 3 : Valores médios dos títulos sorológicos contra a Leptospira interrogans sorovar Hardjo em touros tratados com a estreptomicina A e resultados da análise de variância entre os tratamentos com estreptomicina A e respectivo controle (dados transformados em “log x 1”). minúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste Tukey (P > 0,05).
Analise de variância do delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (“Split plot in time”), tendo como dois tratamentos principais (parcelas) os grupos tratados com estreptomicina e controle e sete tratamentos secundários (subparcelas) as datas experimentais.
Figura. 14 : Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira interrogasns sorovar Hardjo dos animais tratados com estreptomicina da marca A e do seu respectivo grupo controle. Médias Geométricas (=antilogaritmo da Slog (x)/4).
Tabela 4 : Valores médios e resultados da análise de variância entre os tratamentos de touros reagentes a Leptospira interrogans sorovar Hardjo com estreptomicina B e respectivo controle (dados transformados em “log x 1”).
Grupos / Médias = ∑log(x)/n* minúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste Tukey (P > 0,05).
Analise de variância do delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (“Split plot in time”), tendo como dois tratamentos principais
(parcelas) os grupos tratados com estreptomicina e controle e sete tratamentos secundários (subparcelas) as datas experimentais.
Figura 15 : Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira interrogans sorovar Hardjo dos animais tratados com a estreptomicina da marca B e do seu respectivo grupo controle. Médias Geométricas (=antilogaritmo da Slog (x)/4).
Analise de variância do delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (“Split plot in time”), tendo como dois tratamentos principais (parcelas) o grupo tratado com estreptomicina B e respectivo controle, e sete tratamentos secundários (subparcelas) as datas experimentais.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 1 2 2 2 3 2 4 25 26 2 7 28 29 30
Figura 16: Resultado da PCR para amostras de urina dos touros sorologicamente reagentes a Leptospira e tratados com a estreptomicina A. 1 e 21) Padrão de peso molecular em escala ascendente de 100pb; 2-7) touro 1A, colheita dos dias -1,0,1,2,3,5;8-13) touro 2A, colheita dos dias -1, 0,1,2,3,5;14-18,22) touro 3A, colheitas dos dias 1,0,1,2,3,5;2328) touro 4A, colheitas dos dias -1,0,1,2,3,5;29) Controle positivo; 30) Controle negativo.
Os resultados da prova da PCR para as amostras de urina dos touros sorologicamente reagentes à Leptospira interrogans sorovar Hardjo e tratados com as estreptomicinas das marcas A e B são apresentadas nas Fig. 4 e 5, respectivamente.
Touro 1 A Touro 2 A Touro 3 A Touro 4 A +
600
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 17: Resultados da PCR para amostras de urina dos touros sorologicamente reagentes e tratados com a estreptomicina B.1 e 15) Padrão de peso molecular em escala ascendente de 100pb; 26) touro 1B, colheitas dos dias -1,0,1,2,3;7-11) touro 2B, colheitas dos dias -1,0,1,2,3;14 e 19) Controle positivo; 20) Controle negativo.
Touro 1 B Touro 2 B + +
6. DISCUSSÃO
Com relação ás médias geométricas dos títulos sorológicos contra Leptospira interrogans sorovar Hardjo, verificou-se que a partir da aplicação da estreptomicina da marca A houve uma queda de 50% dos títulos, resultados não evidenciados nos touros que receberam a estreptomicina da marca B. Essa queda dos títulos sorológicos após tratamento com estreptomicina pode acontecer nos casos de leptospiremia ou nos casos de infecção crônica de bovinos debilitados, comprovações semelhantes foram verificadas por Gerreitsen et al. (1994) nos primeiros 30 dias após infecção pelo sorovar Hardjobovis. No entanto, a condição de queda dos títulos sorológicos detectados pela SAM não dá a garantia de ausência de infecção renal, para que isso aconteça precisa tratar e monitorar adequadamente a fonte de infecção do rebanho bovino (HANSON, 1982).
O controle da leptospirúria em bovinos, por meio de um recurso terapêutico massal, aplicado simultaneamente a doentes, portadores e comunicantes, seria de grande valor no controle da leptospirose. A estreptomicina apresenta facilidade de penetração renal o suficiente para destruir as leptospiras presentes nos túbulos renais, devido a sua excreção urinária sendo a maior parte por infiltração glomerular como demonstrado por Gerreitsen et al. (1994), em bovinos infectados que receberam dose única de 25 mg/kg de peso corpóreo.
A estreptomicina da marca A conseguiu em 50% dos touros causar um bloqueio na leptospirúria a partir do 20 dia após o tratamento (touros 1 e 4). Entretanto, nos outros 50% dos touros a eliminação da leptospirúria somente foi possível de concretizar após no 30 dia do tratamento (touros 2 e 3). Já na maioria dos touros tratados com a estreptomicina B a leptospirúria ocorreu de forma intermitente até o 30 dia após a aplicação (Tabela 1).
Nas situações observadas acima fica caracterizado que a eliminação da excreção do sorovar Hardjo pela urina foi entre 48 e 72 horas após a aplicação da estreptomicina por via intramuscular. Resultados semelhantes foram observados por Gerritsen et al.(1994) que estudando grupos de 40 bovinos infectados naturalmente detectaram DNA de leptospiras do sorovar Hardjobovis na urina desses animais por até 48 horas após o tratamento.
A despeito dos resultados obtidos, no presente estudo, discordam daqueles observados por Gerritsen et al. (1994), pois não se pode descartar a possibilidade das origens diferentes das matérias primas utilizadas pelos fabricantes na produção das estreptomicinas comerciais. Isso se torna ainda mais importante, quando se constata que a estreptomicina empregada, ou seja, mesmo princípio ativo antimicrobiano apresentou diferentes resultados devido possivelmente às procedências distintas do medicamento.
No presente estudo na Tabela 1 fica demonstrado há não realização da técnica de PCR para acompanhar a leptospirúria durantes os 25 dias do experimento.
Tal decisão foi embasada nos estudos de Truccolo et al. (2002), que a partir de um resultado negativo de PCR as chances de conseguir um resultado positivo é muito raro e o que levou-se em conta em diminuir os custos com a compra de primers.
Para a utilização de um grande número de hamsters inoculados com urina de touros para as tentativas de isolamento do fígado e rim foi necessária a constituição dos grupos controles com número reduzido de animais, pois o modelo experimental visava determinar o bloqueio da leptospirúria, após o tratamento com a estreptomicina em bovinos infectados naturalmente. Fato este não verificado nos touros tratados com a estreptomicina da marca B, conforme mostra a Tabela 1, mas de acordo com a orientação de Bolin et al. (1989) e Faine et al. (1999), a utilização da técnica da PCR pode ajudar na possível comprovação da eliminação de material genético pela urina, principalmente quando o isolamento pelo cultivo da urina não demonstrar que não houve a leptospirúria.
Com o intuito da verificação de ocorrência do bloqueio da indução de anticorpos na infecção optou-se pela constituição de um grupo controle com touros sororeagentes que não foram tratados com as duas marcas de estreptomicina os quais foram monitorados por meio da prova de SAM. Procedimento este defendido por Kee et al. (1994) quando mencionam que o monitoramento sorológico pode caracterizar a resposta imunológica devido á infecção, e que a pesquisa do agente por meios diretos de isolamentos pode sofrer ação de fatores bloqueadores de crescimento, o que pode induzir a um diagnóstico não conclusivo.
O procedimento adotado na aplicação de dose única 25mg/kg de peso corpóreo de estreptomicina para o controle da leptospirúria nos touros foi eficiente e esta de acordo com as recomendações de Faine et al. (1999) e também pelos resultados obtidos por Gerritsen et al. (1994) e por Santos et al. (2001).
No entanto, quanto á dose e á frequência da aplicação da diidroestreptomicina ou da estreptomicina no controle da leptospirúria, estudos realizados por Hodes & Day (1987) e por Huhn et al. (1993) revelaram que, para os dois antimicrobianos aludidos, uma única aplicação pela via intramuscular na dose de 25 mg/kg de peso corpóreo é suficiente para destruir as leptospiras localizadas nos túbulos renais. Ainda, como complementação no tratamento, Alt et al. (2001) recomendam a associação com a penicilina G no sucesso para eliminação do portador renal e Miraglia et al. (2003) para melhor proteção do sêmen bovino utilizado na inseminação artificial.
7. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos e analisados, segundo a metodologia empregada, possibilitaram as seguintes conclusões:
As médias dos títulos sorológicos dos grupos tratados com estreptomicina foram menores do que as médias dos títulos do grupo controle.
A estreptomicina da marca A apresentou um melhor eficiência na diminuição das médias dos títulos sorológicos do grupo que recebeu tratamento com a estreptomicina da marca B, tendo iniciado o declínio das médias dos títulos dois dias antes, embora pelo Teste de Tukey as médias não tenham apresentado diferença significativa.
Os resultados do cultivo e isolamento de leptospira na urina dos touros tratados tanto com a estreptomicina da marca A quanto da B mostram que as duas marcas conseguiram diminuir a leptospirúria a partir do 30 dia após o tratamento.
Com esses resultados constata-se que embora a estreptomicina seja uma excelente opção para o tratamento da leptospirose, deve-se verificar a procedência, idoneidade e característica dos diversos produtos comerciais.
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