UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL
INFECÇÃO POR LEPTOSPIRA EM TOUROS (Bos Taurus Indicus):
COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS PRODUTOS À BASE DE ESTREPTOMICINA NA ELIMINAÇÃO DA LEPTOSPIRÚRIA
CAUSADO PELO SOROVAR HARDJO
Thais Marino Silva Girio Luvezuti
Médica Veterinária
2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL
INFECÇÃO POR LEPTOSPIRA EM TOUROS (Bos Taurus Indicus):
COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS PRODUTOS À BASE DE ESTREPTOMICINA NA ELIMINAÇÃO DA LEPTOSPIRÚRIA
CAUSADO PELO SOROVAR HARDJO
Thais Marino Silva Girio Luvezuti
Orientador:Prof. Dr. Luiz Augusto do Amaral
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva)
2013
Luvezuti, Thaís Marino Silva Girio
L976i Infecção por Leptospira em Touros (Bos Taurus Indicus):
Comparação da Eficiência de dois produtos à base de Estreptomicina na Eliminação da Leptospirúria causado pelo Sorovar Hardjo / Thaís Marino Silva Girio Luvezuti. – – Jaboticabal, 2013
xvi, 60 p. ; il .; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2013
Orientador: Luiz Augusto do Amaral
Banca examinadora: Fernando Antonio de Avila, Gisele Maria de Andrade, Halim Atique Netto, Anna Monteiro Lima Ribeiro
Bibliografia
1. Leptospira. 2. Bovinos. 3. Estreptomicina. I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:614.91:636.2
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
THAÍS MARINO SILVA GIRIO LUVEZUTI - nascida em 19 de outubro de 1979, em Jaboticabal - São Paulo, é Médica Veterinária formada pelo Centro Universitário Barão de Mauá na cidade de Ribeirão - Preto, em dezembro de 2003. Desde 03 de março de 2004 exerce as funções de Gerente Técnica e Responsável Técnica da empresa UCB Saúde Animal localizada na cidade de Jaboticabal. Mestre em Medicina Veterinária Preventiva pela faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal, São Paulo em 2008. Doutora em Medicina Veterinária Preventiva, pela faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal, São Paulo em 2009.
EPÍGRAFE
“A maior esperteza do mundo é ser honesto.”
(Dr. Lair Ribeiro)
DEDICATÓRIA
A minha filha Ana Luísa, aos meus pais Raul e Cidinha e ao meu marido Rafael, pelo carinho, apoio e confiança.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por seguir o meu caminho nesta vida e poder deixar gravado nas linhas da minha alma, o amor, a dedicação e compaixão pelos animais e pelas pessoas que me cercam.
Aos meus pais “Vocês são um presente de Deus para mim, valendo-me das palavras de Nossa Senhora, eu digo do mais profundo do meu coração: A minha alma engradece ao Senhor e o meu espírito exulta em Deus, meu salvador, porque me agraciou com pais maravilhosos como vocês.
Ao meu esposo e a minha filha “... Eu tenho tanto para lhes falar, mas com palavras não sei dizer como é grande o meu amor por... vocês”.
Ao meu orientador Dr. Luiz Augusto do Amaral, “TIO” obrigada por tudo.
A UCB Saúde Animal, especialmente Dr. Hilary Rodrigues e Dr. Urias de Souza pela oportunidade e apoio.
As minhas grandes amigas Gisele M. de Andrade e Mariana Paranhos Costa, vocês são demais amo vocês.
Em especial a Gisele M. de Andrade que me ajudou nas correções deste trabalho e me deu força para continua-lo obrigada.
Aos meus animais, amores da minha vida, meu cavalo Buzar (in memorian), minha cachorrinha Kika (in memorian), minha cachorrinha amiga fiel Mell, e a minha égua Lakshmi RB que só me trouxe alegrias e vitórias amo você. Aos meus potros Úalad e Dakota que chegaram de repente na minha vida....como são carinhosos. Como amo esses animais que muito me ensinaram o sentido de amar.
Ao meu tio padrinho Laurinho (in memorian) por me ensinar que devemos ser felizes acima de tudo.
Aos meus queridos avós em especial meu avô Lauro (in memorian) figuras eternas e amáveis, nas quais busco sabedoria, paz e tranqüilidade para o meu coração.
Ao meu bisavô Francisco (in memorian) e a minha avó Maria José amo vocês obrigada por me ensinarem o caminho espiritual.
Aos meus tios e primos, obrigada por todos os momentos de alegria e amizade A minha grande amiga e irmã Priscila Helena Miranda (in memorian), Deus quis você perto dele, você virou anjo em nossas vidas te amo.
As minhas verdadeiras amigas pela eterna amizade, lealdade.
Aos meus amigos e funcionários da empresa UCB Saúde Animal, obrigada pelos momentos de descontração adoro todos vocês.
Aos professores e funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva obrigada pelos momentos que passamos juntos.
Ao técnico de laboratório Nivaldo Aparecido Assis, pela ajuda e apoio durante a realização do trabalho valeu amigo Assis.
Ao Instituto Biológico de São Paulo e a Central de Inseminação Artificial, obrigada pelo apoio que me deram para a realização desse trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS... x
LISTA DE FIGURAS... xi
LISTA DE QUATRO... xiv
RESUMO... xv
ABSTRACT... xvi
1.INTRODUÇÃO... 1
2.REVISÃO DE LITERTURA... 2
3.OBJETIVOS... 16
4.MATERIAL E MÉTODOS... 17
4.1. Animais... 17
4.2. Esquema do tratamento com os antibióticos... 17
4.3. Colheita das Amostras... 18
4.3.1.Sangue... 18
4.3.2.Urina... 18
4.4.Pesquisa de anticorpos... 19
4.4.1. Preparo dos antígenos de leptospira... 19
4.4.2. Técnica de soroaglutinação microscópica... 20
4.5. Instalação e manejo dos hamsters... 20
4.5.1. Pesquisa do agente na urina... 21
4.5.2. Pesquisa de anticorpos e tentativa de isolamento de leptospira em hamsters... 21
4.6. Isolamento de Leptospira em meio de cultura... 24
4.7. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)... 25
4.7.1. Extração de DNA... 25
4.7.2. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) empregados na amplificação... 28
4.7.3. Amplificação do DNA bacteriano... 29
4.7.4. Análise do produto amplificado... 30
4.8.Análise Estatítica... 31
5.RESULTADOS... 32
6.DISCUSSÃO... 43
7.CONCLUSÕES... 46
8.REFERÊNCIAS... 47
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 Resultados da reação em Cadeia da Polimerase e dos isolamentos em meio semi-sólido de urina de touros sororeagentes tratados com estreptomicina e cultura dos rins e fígado de hamsters...34
Tabela 2 Valores médios dos títulos sorológicos contra o sorovar Hardjo e resultados da análise de variância entre os tratamento de touros reagentes a Leptospirose com streptomicina A (grupo 1) e estreptomicina B (grupo 2) (dados
transformados em “logx 1”)...35
Tabela 3 Valores médios dos títulos sorológicos contra a Leptospira sorovar Hardjo em touros tratados com a estreptomicina A e resultados da análise de variância entre os tratamentos com estreptomicina A e respectivo controle (dados transformados em “log x 1”)...37
Tabela 4 : Valores médios e resultados da análise de variância entre os tratamentos de touros reagentes a Leptospira com estreptomicina B e respectivo controle (dados transformados em “log x 1”)...39
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Acondicionamento dos hamsters nas instalações do Infectório das Enfermidades Infecciosas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal...20
Figura 2 Colheita das amostras de sangue de um dos hamsters utilizados, após
anestesia...22
Figura 3 e 4 Necropsia com colheita do material após rigorosa antissepsia, para
retirada de rim e fígado para realização de isolamento em meio de Cultivo...23
Figura 5 e 6 Maceração dos órgãos em gral com pistilos esterilizados, para cultivo em meio de cultura...24
Figura 7 Formação de anel de opalescência nos tubos com material em meio de cultivo, mostrando crescimento de leptospiras, confirmado pela microscopia óptica...25
Figura 8 Fachada do Laboratório de Doenças Bacterianas da Reprodução do Instituto Biológico de São Paulo, onde foi realizada a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...27
Figura 9 Laboratório de PCR, Sala de extração de DNA. Destaque para a capela (fluxo) para manipulação de DNA (“área suja”)...27
Figura 10 Laboratório de PCR, Sala de amplificação de DNA e revelação do gel de PCR...28
Figura 11 Termociclador para amplificação de DNA...29
Figura 12 Deposição do DNA amplificado e corado com azul de bromofenol no gel de agarose a 2,0% para revelação das Bandas...30
Figura 13 Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira sorovar Hardjo dos animais tratados com as estreptomicinas das marcas A e B. Médias Geométricas (=antilogaritmo da Slog (x)/4)...36
Figura. 14 Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira sorovar Hardjo dos animais tratados com estreptomicina da marca A e do seu respectivo grupo controle. Médias Geométricas (=antilogaritmo da Slog (x)/4)...38
Figura 15 Gráfico do resultado comparativo das médias de títulos sorológicos contra Leptospira sorovar Hardjo dos animais tratados com a estreptomicina da marca B e do seu respectivo grupo controle. Médias Geométricas
(=antilogaritmo da Slog (x)/4)...40
Figura 16 Resultado da PCR para amostras de urina dos touros sorologicamente reagentes a Leptospira e tratados com a estreptomicina A. 1 e 21) Padrão de peso molecular em escala ascendente de 100pb; 2-7) touro 1A, colheita dos dias -1,0,1,2,3,5;8-13) touro 2A, colheita dos dias -1, 0,1,2,3,5;14-18,22) touro 3A, colheitas dos dias -1,0,1,2,3,5;23-28) touro 4A, colheitas dos dias - 1,0,1,2,3,5;29) Controle positivo; 30) Controle negativo...41
Figura 17 Resultados da PCR para amostras de urina dos touros sorologicamente reagentes e tratados com a estreptomicinaB.1 e 15) Padrão de peso molecular em escala ascendente de 100pb; 2-6) touro 1B, colheitas dos dias -1,0,1,2,3;7- 11) touro 2B, colheitas dos dias -1,0,1,2,3;14 e 19) Controle positivo; 20) Controle negativo...42
LISTA DE QUADRO
Página Quadro 1 Oligonicleotídeos iniciadores Lep 1 e Lep 2 empregados na técnica da
PCR...28
Infecção por Leptospira em Touros (Bos Taurus Indicus): Comparação da Eficiência de dois produtos á Base de Estreptomicina na Eliminação da
Leptospirúria causado pelo Sorovar Hardjo
RESUMO - O objetivo desse trabalho foi verificar a ação de marcas diferentes de estreptomicinas polivalentes para o tratamento da leptospirose bovina em dose única (25 mg de estreptomicina por kg de peso corpóreo). O trabalho foi realizado com 14 touros adultos sorologicamente reagentes para Leptospira interrogans sorovar Hardjo, com título mínimo de 800 e com cultivo positivo. Os animais foram separados em 2 grupos de acordo com a marca da estreptomicina utilizada no tratamento, grupo 1:
estreptomicina A e grupo 2: estreptomicina B. Os bovinos controles não receberam nenhum tratamento. Foram obtidas amostras de sangue e urina dos animais tratados e controles nos dias -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25; considerando-se o dia do tratamento como dia 0. Na urina dos bovinos tratados e controle foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) e isolamento com inoculação em hamsters. Observou-se que a estreptomicina da marca A, em dose única de 25 mg/kg de peso corpóreo, conseguiu eliminar a leptospirúria no grupo de touros após 24h do tratamento. Já no grupo de touros tratados com a estreptomicina da marca B, foi constatado a leptospirúria entre 48h e 72h, após o tratamento. Em ambos os grupos tratados, a resposta sorológica apresentou uma variação da queda dos níveis dos títulos de anticorpos aglutinantes, sendo que embora a estreptomicina A tenha aparentemente apresentado um melhor eficiência quando comparada com as médias geométricas dos títulos do grupo tratado com a estreptomicina B as médias não diferiram entre si pelo Teste de Tukey (P >
0,05). Nos bovinos tratados a leptospirúria foi intermitente e a média geométrica dos títulos foi menor que a média geométrica dos títulos dos bovinos controles. A diferença do efeito da ação das diferentes marcas de estreptomicina está possivelmente na qualidade da matéria prima produzida pelos laboratórios.
Palavras - chave: Leptospira, bovinos, estreptomicina.
Leptospira infection in bulls (Bos Taurus Indicus): Comparison of efficacy of two different commercial streptomycin brands on eliminating leptospiruria
caused by serovar Hardjo
ABSTRACT - The objective of the present work was to evaluated two different commercial streptomycin brands used for the treatment of bovine leptospirosis, administrated in a single dose (25mg/body weight). Thirty serologically reactive bulls for Leptospira interrogans serovar Hardjo were utilized. The bulls presented a 800 minimum antibody titer and positive results at urine samples isolation test. The animals were separated into 2 groups according to the streptomycin brand. Treatments consisted of: group 1: streptomycin A and group 2: streptomycin B. The control animals received no application of any streptomycin product. Blood and urine samples of treated and controls bulls were collected at -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 days considering the treatment day as D0. Detection of leptospira genetic material was carried out in all bulls urine samples using the PCR assay. It was observed that the streptomycin A eliminated leptospiruria 24h after treatment. The elimination of leptospiruria was evidente 48 and 72hs in bulls treated with the streptomycin B. In both treated groups, the serological response varied considering antibodies titers decreasing. Streptomycin A group 1 showed a better performance accordingly to geometric means in comparison to antibodies titers of the streptomycin B group 2, although there were no significant difference found by the Tukey Test (P > 0.05). In the bovine control group the leptospiruria was intermittent and the treated bovines antibody titers average was lower than the average of the bovine controls, during all the experimental period. The action effect difference of the diferent streptomycin brands used is possibly due to the quality of the raw material used to produced the products manufactured by the pharmaceutical laboratories.
Keywords: Leptospira, bovine, streptomycin.
1. INTRODUÇÃO
Desde o século passado estudos realizados mostravam que o Brasil apresentava grande potencialidade para o desenvolvimento da exploração pecuária, no entanto, os valores médios de produção e produtividade dos rebanhos nacionais situam-se entre os mais baixos do mundo. Essa ineficiência na produção de carne e leite sempre parecem que estava altamente influenciada pela baixa fertilidade dos rebanhos nacionais. Dentre os vários processos infecciosos da esfera reprodutiva, a leptospirose, foi apontada como uma das causas da queda de fertilidade, que ocasionam elevadas perdas econômicas acentuadas.
No caso da espécie bovina as perdas econômicas produzidas pela leptospirose sempre estiveram diretamente ou indiretamente relacionadas ao abortamento, queda na produção de leite, falhas reprodutivas e a custos relacionados à assistência veterinária, medicamentos, vacinas e testes laboratoriais. Além de afetar significativamente o ciclo reprodutivo dos bovinos, pode causar prejuízos com a elevação nos coeficientes de mortalidade dos rebanhos afetados, principalmente dos animais jovens.
Um dos fatores estudados que contribuem para elevar a prevalência da leptospirose são as condições climáticas dos países tropicais e subtropicais. O Brasil por ser um país tropical, dependendo da região, as chuvas são mais frequentes e o solo apresenta reação neutra ou levemente alcalina, oferecendo melhores condições de transmissibilidade das leptospiras entre os animais.
No caso dos bovinos adultos que conseguem sobreviver à fase aguda da doença, as leptospiras atingem a luz dos túbulos contornados renais e passam a ser eliminadas por meio da urina por períodos variados, caracterizando a fase de leptospirúria e com isso torna-se uma fonte de infecção importante, denominada de portador renal.
2. REVISÃO DE LITERATURA
A leptospirose é uma enfermidade bacteriana infectocontagiosa, aguda ou crônica, que pode acometer diversas espécies de animais domésticos, silvestres e humanos, por isso é considerada uma zoonose (HORSCH, 1999; COLEMAN, 2000; ACHA &
SZYFRES, 2001).
No âmbito internacional, o interesse pela leptospirose provem das epidemias e calamidades que tem sido registradas devido aos desequilíbrios climáticos e ecológicos, como chuvas em excesso, maremotos e ciclones que não se restrigem apenas as regiões tropicais (LEVETT, 2001; HARTSKEERL, 2009; OLIVEIRA et al., 2009;
SEHGAL, 2009). Assim a leptospirose tem sido identificada como doença re-emergente, particularmente na Nicarágua, Brasil, India, Malásia (PALANIAPPAN et al., 2007), Tailândia, Indonésia, América Latina e Estados Unidos da América (LEVETT, 2001 &
HARTSKEERL, 2009).
A leptospirose pode ser um problema importante para saúde mundial, suas taxas de morbidade e mortalidade podem apresentar dados diferentes nas diversas regiões do planeta. O número de casos de leptospirose seria subestimado em decorrência da anamnese e exame clínico mal realizado e o não uso dos testes apropriados para o seu diagnóstico (AHMED et al., 2006)
Entre os animais, as consequências desta infecção são de esfera econômica, tendo em vista o envolvimento de animais de produção como bovinos, ovinos, caprinos, suínos e equinos (BRASlL, 1995). Nos bovinos, as perdas econômicas decorrem de transtornos reprodutivos como infertilidade, aborto, nascimento de bezerros fracos e diminuição temporária da produção leiteira (CERVANTES et al., 2002). Em bovinos o abortamento pode ocorrer predominantemente no terceiro trimestre de gestação e tem uma característica epizoótica, com desenvolvimento de imunidade para o sorovar envolvido. Entretanto, podem ocorrer novos surtos com outros sorovares (RICHTZENHAIN et al., 2002).
A transmissão da leptospirose depende de condições favoráveis para a sobrevivência do organismo no meio ambiente, do número de animais portadores em uma população e do tempo de duração que esses abrigam as leptospiras (HUNTER &
HERR, 1994). A umidade, temperatura e pH são pontos críticos para a sobrevivência do agente no meio ambiente (RIET- CORREIA & LEMOS, 2001).
Países de clima tropical e subtropical, particularmente nos períodos de elevação dos níveis de precipitação pluviométrica e em regiões onde o solo apresenta reação neutra ou levemente alcalina, apresentam as maiores prevalências de leptospirose (RADOSTITS et al., 2010). A redução de temperatura retarda ou interrompe a multiplicação das leptospiras em vida livre, as quais, no entanto, sobrevivem bem a congelação. À temperatura ambiente, entre 20oC e 26oC, multiplicam-se rapidamente, mas podem ter a sobrevivência reduzida (GIRIO & LEMOS, 2007). Contudo, as leptospiras podem sobreviver, por longo período de tempo, em condições quentes e úmidas, em pH próximo á neutralidade, variando entre 7,2 a 7,4 (BINDER & MERMEL, 1998). Segundo Horsch (1999), as leptospiras apresentam grande sensibilidade a variação de pH, sendo resistentes aos desinfetantes que desviam o pH abaixo de 6 e acima de 11.
A princípio as leptospiras eram diferenciadas por reações sorológicas e duas espécies eram reconhecidas: uma patogênica, Leptospira interrogans, e outra apatogênica, saprófita, isolada do ambiente, Leptospira biflexa (ELLIS, 1995).
Os meios de cultura mais utilizados para o isolamento e cultura de leptospiras são o EMJH (Ellighausen, McCullough, Johson e Harris), meio líquido, e o Fletcher, meio semissólido (FAINE, 1982). A temperatura de multiplicação destas bactérias varia entre 28oC e 30oC, sendo o tempo de geração, aproximadamente de 12 horas (FAINE et al., 1999).
O gênero Leptospira são espiroquetas pertencentes à ordem Spirochaetales e família Leptospiracae (NOGUCHI, 1918). De acordo com estudos de Brenner et al.
(1999) e Levett (2001), a classificação genética permite observar que espécies semelhantes sorologicamente, como, por exemplo, o sorovar Hardjo, que pertence a duas espécie, L. borgpetersenii e L. interrogans, devido ao fato de que os antígenos
superficiais comuns serem compartilhados por esses dois microorganismos geneticamente distintos. No entanto, alguns pesquisadores identificam os sorovares por meio de testes de aglutinação cruzada e testes de absorção de aglutininas (SURUJBALLI & MALLORY, 2004).
Mais de 260 sorovares estão agrupados em 23 sorogrupos definidos, sendo a L.
interrogans classificada em 13 espécies patogênica: L. alexanderi, L. alstonii, L.
borgpetersenii, L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae, L. weilii e L. wolffii (ALDER & MOCTEZUMA, 2010).
Em levantamentos bibliográficos realizados Quinn et al. (2005) e Figueiredo, Girio e Lemos (2008), foi verificado que cada sorovar tem predileção por determinadas espécies animais que podem servir como hospedeiros naturais ou de manutenção, atuando como reservatórios do agente e causando doença moderada ou subclínica, seguida por excreção prolongada das leptospiras na urina, ou ainda como hospedeiros acidentais, que desenvolvem a enfermidade clinicamente e podem transmiti-la para outros animais. Exemplos dessa condição configuram-se nas associações estabelecidas entre o rato-de-esgoto e o sorovar Icterohaemorrhagiae, o cão doméstico e o sorovar Canicola, o suíno e o sorovar Pomona, e o bovino e o sorovar Hardjo (FAINE et al., 1999). De acordo com Rebhun (1995), os bovinos podem permanecer com leptospirúria intermitente por um período entre 10 e 180 dias, já em outras espécies como equinos e ovinos não são fontes de infecção comuns, por apresentaram leptospirúria intermitente em grau reduzido (RADOSTITS et al., 2010).
Especificamente a manutenção da L. borgpetersenii sorovar Hardjo destacam-se os bovinos e, além disso, acredita-se que esse sorovar pode-se adaptar a espécie ovina (COUSINS et al., 1989). No entanto, Ellis et al.,(1989), afirmam que a L. interrogans sorovar Hardjo também pode adaptar-se aos bovinos, mas, por ser mais virulenta do que L. borgpetersenii sorovar Hardjo, esporadicamente pode causar doença nesses ruminantes.
A patogenia da leptospirose inclui a penetração do microrganismo através das mucosas ou de lesões na pele, seguida de multiplicação no sangue e em praticamente todos os órgãos e tecidos, o que caracteriza a fase denominada leptospiremia. Também
há o comprometimento do fígado, dos rins, dos pulmões, das adrenais, do cérebro, do útero, do ovário, das trompas e da glândula mamária. Nas fêmeas em gestação, o abortamento e suas complicações tornam a leptospirose uma importante doença da esfera reprodutiva (FAINE, 1982; FAINE, 1994).
Durante o período de incubação, de 7 a 14 dias, ocorre a sepse, surgindo a produção de anticorpos da classe IgM, que têm uma atividade de poucos dias, e surgem mais tardiamente anticorpos da classe IgG. Apesar dos anticorpos ajudarem no combate a bacteremia, não elimina por si só a infecção renal (REBHUN, 1995). Nos animais que conseguem sobreviver à fase aguda da leptospirose, os microrganismos atingem a luz dos túbulos contornados renais e passam a ser eliminados por meio da urina por períodos de tempo variados, caracterizando a fase de leptospirúria; com isso os animais tornam-se uma fonte de infecção importante, denominada portador renal (FAINE, 1982; VASCONCELLOS, 1987).
A transmissão do sorovar Hardjo na espécie bovina pode ocorrer de forma indireta, pelo contato com água e solos contaminados, e pelo modo direto, principalmente pela via venérea (AMATREDJO et al., 1975). Esta é considerada como a mais importante principalmente pela transmissão por meio de sêmen industrializado quando é minimizada, desde que os critérios preconizados pela Organização Mundial de Saúde (OIE-Organization for Animal Helath) em relação à saúde do touro doador e a manipulação do ejaculado sejam seguida. (Disponível em http://www.biológico.sp.gov.br/artigos)
Os inquéritos sorológicos realizados em populações bovinas, no território brasileiro, evidenciam como importantes os sorovares Hardjo, Wolffi, Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Canicola, sendo o mais prevalente o sorovar Hardjo (FAVERO et al., 2001; LILENBAUM & SOUZA, 2003; ARAÚJO et al.,2005;
THOMPSON et al., 2006; LAGE et al.,2007).
Moorepark et al. (1992) observaram que bovinos naturalmente infectados, com título em torno de 300, eliminaram leptospiras na urina por um período médio de 28 a 40 semanas, e que os animais experimentalmente infectados apresentaram leptospirúria pelo período de oito a 60 semanas mas com uma média de 26 a 32
semanas, assim, esses autores concluíram que em infecções naturais o período de leptospirúria é mais prolongado.
Leonard et al. (1993) estudaram a relação entre o fim da leptospirúria e os níveis de anticorpos na urina de bovinos, observando que as leptospiras eram isoladas intermitentemente e estavam associadas a um acentuado aumento nos níveis de anticorpos das classes IgG e IgA da urina dos animais.
A presença de Leptospira spp. em sêmen de touros, natural e experimentalmente infectados, já foi demonstrada, indicando a possibilidade de transmissão da leptospirose bovina pela monta natural ou pela inseminação artificial (IA) (SLEIGHT & WILLIAMS, 1961; SLEIGHT et al., 1964; SLEIGHT, 1965; RODINA, 1971; RODINA & BALASHOV, 1971).
Sleight & Willians (1961) relataram que a relação anatômica dos aparelhos urinário e genital dos machos, em que a uretra é o ducto excretor comum para urina e sêmen, favorece a contaminação do sêmen por leptospiras enquanto o animal se apresenta em fase de leptospirúria.
Sleight et al. (1964) pesquisaram touros experimentalmente infectados por L.
interrogans sorovar Pomona. Foram analisados seis animais, dos quais quatro apresentavam lesões histológicas nos testículos e no epidídimo semelhantes àquelas encontradas nos rins. As amostras de sêmen, colhidas de dois animais infectados, estavam contaminadas por leptospiras, porém os autores consideraram mais provável a contaminação pela urina, uma vez que a extensão do envolvimento dos órgãos genitais era insuficiente para comprovar a presença da bactéria no sêmen. Mencionaram também que, devido à susceptibilidade individual dos animais à infecção pelo sorovar Pomona seria possível a ocorrência de orquite, capaz de afetar a fertilidade dos touros infectados.
Ellis et al. (1986) isolaram o sorovar Hardjo da vesícula seminal, do epidídimo e dos testículos de touros abatidos em Belfast (Irlanda do Norte), relacionando o fato à contaminação do sêmen e afirmando que, na cadeia epidemiológica da leptospirose, a transmissão venérea a partir de machos infectados é tão ou mais importante que a transmissão urinária.
Guimarães et al. (1987), analisando amostras de soro sangüíneo e de esperma de reprodutores da espécie bovina em regime de quarentena em centrais de inseminação artificial no Estado de São Paulo, observaram que 30 (73,2%) dos 41 animais não foram reagentes na prova de soroaglutinação microscópica e que, dos 11 (26,8%) animais que foram reagentes para L. interrogans, nove foram para o sorovar Wolffi e dois para o sorovar Shermani; no entanto todas as amostras de sêmen resultaram negativas frente à técnica de isolamento adotada. Resultado semelhante foi obtido por Schönberg (1981).
Brod et al. (1995) realizaram um amplo estudo epidemiológico sobre a leptospirose bovina em rebanhos leiteiros e de corte, constituídos de animais com e sem sinais clínicos da doença. Nesse estudo, fizeram uma avaliação do sêmen dos reprodutores e verificaram que era possível observar leptospiras durante o exame direto, após 24 horas de cultivo em meio semissólido. Concluíram que o sêmen, quando não recebe controle rigoroso, pode ser um importante veículo de transmissão da leptospirose bovina.
Brandespim (2004), utilizando as técnicas de Levaditi e imunohistoquímica, observou a presença de L. interrogans sorovar Pomona no testículo, no epidídimo, na vesícula seminal, no rim e no fígado de hamsters experimentalmente infectados. Foram visualizadas mais leptospiras em fígado que em rim.
O incremento da produção animal intensificou, inicialmente, o uso das técnicas de Inseminação Artificial (IA), cuja difusão passou a exigir o estabelecimento de rigorosos critérios sanitários, tendo em vista o risco do sêmen atuar como veículo transmissor de inúmeros agentes de doenças, entre os quais estão incluídas as leptospiras (HARE, 1985).
De acordo com Eaglesome & Garcia (1992), a técnica da IA recomenda que o sêmen seja colocado diretamente no útero, fazendo com que eventuais agentes escapem da ação germicida das secreções vaginais e cervicais do estro. Para prevenir o risco de transmissão de agentes infecciosos por meio da inseminação artificial, faz-se necessário um rígido controle da condição sanitária dos touros doadores e da qualidade do sêmen, desde a coleta até a conservação.
Com o desenvolvimento da IA, foi reconhecido que muitos patógenos presentes no sêmen podem sobreviver aos processos de congelamento, trazendo sérios riscos aos animais (PALIT et al., 1986; EAGLESOME & GARCIA, 1992).
Cessi & Lodetti (1969) demonstraram a viabilidade do sorovar Pomona e a manutenção de sua virulência mediante congelação rápida e lenta em nitrogênio líquido por até 18 meses.
Rodrigues (1997) conseguiu demonstrar que o sorovar Pomona pode manter sua virulência em amostras de sêmen que foram contaminadas com 5 x 106 leptospiras, após serem resfriadas a 4o C por cinco horas e diluídas sem antibiótico.
Quanto aos antibióticos, há relatos na literatura comprovando que as leptospiras podem suportar as concentrações empregadas no processo de congelamento, com ou sem redução em sua virulência (HOAG & BELL, 1955; BLENDEN, 1975; BRYAN &
BOLEY, 1975).
A SAM com antígenos vivos aplicada ao diagnóstico da leptospirose é o procedimento aceito como padrão - ouro de referencia internacional (BRASIL, 2005).
Segundo Mascolli et al. (2002) a técnica de SAM pode ser empregada para a vigilância epidemiológica da leptospirose com o monitoramento da distribuição espacial dos sorovares de leptospiras presentes em diferentes regiões.
Esta técnica é a mais utilizada para o diagnóstico da leptospirose bovina (BOLIN et al., 1989) no Brasil e em todo o mundo (OLIVEIRA, 1999). Thiermann (1984) ressaltou que, apesar da padronização desse teste, há dificuldade de obter resultados concordantes devido ser um teste subjetivo entre os diferentes laboratórios. É uma técnica laboriosa e exige o uso de leptospiras vivas como antígenos (CHAPPEL et al., 1998).
Ellis et al. (1982; 1986) revelaram a baixa correlação existente entre o estado de portador e a presença de anticorpos séricos, salientando que a SAM pode fornecer uma parcela de resultados falso-negativos.
Thiermann (1983) mostrou que infecções pelo sorovar Hardjo podem ocorrer regularmente sem a presença de anticorpos aglutinantes. Resultados negativos nas
provas sorológicas não garantem que o animal esteja livre da infecção renal, visto ser possível o isolamento de bactérias a partir da urina de animais não reagentes (BLENDEN, 1975).
Van eys et al. (1989) concluíram em seus estudos que a sorologia não reflete necessariamente o estado de portador ou eliminador de leptospiras em bovinos.
Embora a prova de SAM seja sensível, determinando o sorovar envolvido, algumas desvantagens podem ser observadas, entre elas, o fato de ser um teste indireto, não reconhecendo a presença de leptospira, mas sim a resposta imunológica do hospedeiro infectado, não indicando se a infecção é ativa (KEE et al., 1994).
Oliveira (1999) alertou para a interferência no diagnóstico sorológico devido ao uso de vacinas polivalentes, dificultando o estabelecimento da prevalência da doença.
O diagnóstico definitivo da infecção por Leptospira spp. é usualmente dado pelo isolamento e cultivo do agente, entretanto esse procedimento é oneroso, necessita de amostras recém-colhidas, e pelo menos 30 dias são requeridos para a obtenção de resultados conclusivos (BOLIN et al., 1989). Segundo Smith (1984), o isolamento a partir de fígado, rim ou cérebro fetal é possível, mas é lento e pouco prático.
Thiermann (1983; 1984) relatou que o isolamento de Leptospira spp., além de ser de difícil execução, é dependente de fatores como: o tipo e a uniformidade do meio utilizado, e a experiência do laboratorista.
Com a necessidade do desenvolvimento de métodos que oferecessem maior sensibilidade, especificidade e rapidez, técnicas de biologia molecular têm sido aplicadas para detectar leptospiras.
A reação em cadeia pela polimerase (PCR) é um método utilizado para uma amplificação exponencial “in vitro” de regiões específicas de DNA, em um curto espaço de tempo. O grande número de moléculas amplificadas pela técnica de PCR pode então ser facilmente detectado e identificado por meio de eletroforese. A técnica de PCR é executada em ciclos repetidos de aumento e diminuição da temperatura. Cada ciclo consiste de três fases: 1) desnaturação das fitas de DNA; 2) anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores específicos ao DNA molde; 3) síntese do DNA específico utilizando-se a enzima Taq DNA-polimerase (BELÁK & BALLAGI-PORDÁNY, 1993).
A técnica da PCR tornou-se uma importante ferramenta na detecção de agentes patogênicos. O método é rápido e extremamente sensível, podendo teoricamente detectar uma única molécula de DNA em poucas horas. Outra grande vantagem da técnica de PCR decorre do fato de não ser necessária à viabilidade dos patógenos para a realização do teste, o que permite a inativação e o armazenamento das amostras, bem como a aplicação da técnica em amostras mal conservadas (GILLESPIE, 1990;
GINGERAS et al., 1990; PAUL, 1990). Kee et al. (1994) puderam detectar L.
interrogans no sangue de Merionis unguiculatus dois dias após a infecção experimental, enquanto anticorpos só foram detectados pela SAM sete dias pós-infecção.
Merien et al. (1992) sintetizaram o par de oligonucleotídeos iniciadores Lep 1 e Lep 2 a partir da seqüência do gene 16S rRNA de L. interrogans sorovar Canicola determinada por Fukunaga et al. (1990). A técnica da PCR, quando utilizada com esse par de oligonucleotídeos iniciadores, revelou ser específica para Leptospira spp, não amplificando o DNA de outras bactérias como Borrelia burgdorferi, Borrelia hermsii, Treponema denticola, Treponema pallidum, entre outras.
Novos oligonucleotídeos iniciadores (primers) foram desenvolvidos a partir de DNA de outro sorovares, como Icterohaemorrhagiae e Bim, estes capazes de detectar apenas leptospiras patogênicas (GRAVEKAMP et al., 1993).
Woodward & Redstone (1993), utilizando oligonucleotídeos iniciadores gênero- específicos, conseguiram detectar diversos sorovares de L. interrogans e, por meio da análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA amplificado, classificaram os sorovares analisados em três grupos. Savio et al. (1994), utilizando a mesma técnica, conseguiram discriminar a maioria dos sorovares testados.
Heinemann (1995) demonstrou que os oligonucleotídeos iniciadores sintetizados por Merien et al. (1992) foram capazes de amplificar um fragmento de 330 pares de base (bp) a partir do DNA de todos os 30 sorovares de Leptospira spp testados em seu trabalho, independentemente de serem das espécies L. biflexa (apatogênica) ou L.
interrogans (patogênica), devido provavelmente ao fato dos genes de rRNA serem altamente conservados entre as bactérias.
Shi et al. (1997) utilizaram a PCR e isolamento em meio de cultivo, para monitorar a excreção de leptospiras na urina de bovinos naturalmente infectados e, comparando as duas técnicas, concluíram que a PCR é um método simples, rápido e sensível para a investigação da fonte da infecção por leptospira.
Barocchi et al. (2001) preferiram utilizar um oligonucleotídeo único com 438 bp, denominado iRep1, para analisar amostras clínicas humanas obtidas durante uma epidemia urbana de leptospirose entre 1996 e 1998 em Salvador. Concluíram que esse método da PCR para diferenciação de sorogrupos de Leptospira pode proporcionar uma alternativa ao teste sorológico mais rápido e barato para os laboratórios de referência.
Magajevski (2002), estudando amostras pareadas de sêmen e de urina de 10 touros naturalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar Hardjo, detectou DNA de leptospira em apenas uma amostra de urina e em nenhuma das amostras de sêmen. No entanto, 15% das amostras de urina foram positivas no isolamento em meio de cultivo.
Vários autores tem descrito bons limiares de detecção de leptospiras pela técnica da PCR. Heinemann et al. (2000) observaram um limiar de detecção de 100 bactérias por mL para o sêmen bovino. Em urina, Cetinkaya et al.(2000) detectaram até cinco leptospiras por mL do material. Veloso et al. (2000) atentam para o fato de que o procedimento de extração do DNA do material que se deseja avaliar e os primers utilizados podem proporcionar diferentes resultados.
De acordo com Magajevski et al. (2008), a escolha correta da técnica de extração do DNA e do primer para a reação em cadeia da polimerase, são fundamentais no sucesso da pesquisa de agentes patogênicos, principalmente em matérias densos, viscosos e com possíveis inibidores como o sêmen.
A técnica da PCR vem sendo utilizada com sucesso em vários estudos relacionados com leptospirose, seja para simples detecção do agente em diversos materiais, como sêmen (HEINEMANN, 1995; MASRI et al., 1997; HEINEMANN et al.
1999; HEINEMANN et al., 2000; SCARCELLI et al., 2001), urina (VAN EYS et al., 1989;
MERIEN et al., 1995; BAL et al., 1994; MASRI et al., 1997; CETINKAYA et al., 2000) e
humor aquoso (FABER et al., 2000), seja para monitorar a densidade de leptospiras em sangue e órgãos de hamsters infectados experimentalmente e tratados com diferentes doses de antibióticos (TRUCCOLO et al., 2002).
A estreptomicina foi um dos primeiros antibióticos a ser utilizado para a terapia da leptospirose e é considerada, até hoje, uma das melhores opções de tratamento.
Vários trabalhos na literatura empregam experimentalmente o uso de estreptomicina na terapia contra leptospirose e os resultados obtidos mostraram que esse antibiótico pode controlar a leptospiremia e leptospirúria, por meio de dose única, quando aplicada na concentração de 25 mg/kg (CAVAZINI et al., 2008).
Hafez (1995) descreveu que a combinação de penicilina entre 50 e 100 UI/mL e estreptomicina entre 500 e 1.000 UI/mL proporciona um largo espectro de atividade antibacteriana. O autor recomendou, quando do congelamento do sêmen, a utilização de crioprotetores como o glicerol e o dimetilsulfóxido e destacou que o glicerol pode auxiliar parcialmente a ação inibidora dos antibióticos sobre os microrganismos. O glicerol mostrou-se dez vezes mais tóxico que o dimetilsulfóxido para os sorovares Hardjo, Pomona, Tarasovi e Icterohaemorrhagiae, segundo trabalho realizado por Palit et al. (1986).
Miraglia et al. (2003), comparando a capacidade de quatro antibióticos, acrescidos ao diluidor de sêmen gema-citrato, concluiu que a associação penicilina e estreptomicina apresentaram os melhores resultados na capacidade de destruir leptospiras, mas houve 2,0% (7/348) de cultivos positivos para leptospiras. Amoxicilina, ceftiofur sódico e a combinação de ambos, nas concentrações de 1.000 µg/mL, não foram efetivos para inativar as leptospiras.
Nos Estados Unidos da América existe o “Certified Semen Services (CSS) Minimun Requirements for Disease Control of Semen Produced for Artificial Insemination”, o qual determina um protocolo com os padrões mínimos para o monitoramento de saúde e doenças dos touros anteriormente à sua entrada, bem como durante o isolamento (quarentena) e a residência dos mesmos nas centrais de inseminação artificiais (CIA), a fim de evitar a transmissão de algumas doenças por meio do sêmen. Com relação à leptospirose, os touros doadores de sêmen nas CIA são
submetidos aos testes sorológicos semestrais para os cinco sorovares mais importantes naquele país: Pomona, Hardjo, Canicola, Icterohaemorrhagiae e Grippotyphosa. Além disso, o CSS determinou quais os antibióticos e diluidores mais efetivos no controle microbiológico do sêmen. Um protocolo aceitável é aquele em que o sêmen e o diluidor são tratados com os antibióticos gentamicina, tilosina, lincomicina e estreptomicina (NATIONAL ASSOCIATION of ANIMAL BREEDERS, 2002).
No Brasil, o controle da transmissão de doenças pelo sêmen de touros doadores em centrais de inseminação artificial (CIA) é fixado pelas instruções normativas estabelecidas pela Divisão de Fiscalização de Materiais de Multiplicação Animal – DIFMA, com base no Artigo 81 da Portaria no 241 de 10/03/1978 (BRASIL, 1979). Esse documento determina que os reprodutores, antes de ingressarem nas dependências de quarentena das CIA, devem ser submetidos à pré-seleção sanitária nos estabelecimentos de origem, com resultados negativos às provas para diagnóstico de leptospirose e de outras doenças. Após o ingresso dos bovinos nas centrais, os mesmos devem ser mantidos em quarentena (mínimo de cinco semanas), em instalações apropriadas, a fim de serem submetidos a reexames clínicos e laboratoriais para o diagnóstico de doenças infecciosas e zoonóticas, entre elas a leptospirose.
Os animais que apresentarem reações positivas às provas de diagnóstico das doenças referidas devem ser afastados imediatamente da quarentena, ficando o seu ingresso no quarentenário condicionado à apresentação de duas provas negativas, com intervalo mínimo de cinco semanas. Na fase de colheita do sêmen, as provas para diagnóstico clínico e laboratorial da leptospirose devem ser semestrais, sendo o animal imediatamente afastado do regime de colheita quando apresentar qualquer sinal clínico ou laboratorial da doença. No Brasil adota-se como critério para leptospirose o resultado negativo na prova de soroaglutinação microscópica (BRASIL, 1979). No entanto, tal condição não é garantia absoluta da ausência de infecção renal. Hanson (1977) relatou o isolamento de Leptospira spp. da urina ou do tecido renal de animais sorologicamente não reagentes.
O Colégio Brasileiro de Reprodução Animal recomenda que o animal que apresentar título igual ou superior a 100 na prova de soroaglutinação para os sorovares
Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola, Wolffi e Hardjo somente poderá ser utilizado novamente para colheita de sêmen se for submetido ao tratamento com diidroestreptomicina ou estreptomicina na dose de 25 mg/Kg de peso vivo, intramuscular, durante três dias seguidos, sendo também indicadas penicilina e oxitetraciclina, e apresentar resultado negativo na imunofluorescência direta da urina ou no cultivo em meio semi-sólido de Fletcher, após sete dias do último tratamento.
Doherty (1967) injetaram por via intramuscular uma dose única (25 mg/Kg) de sulfato de estreptomicina em oito bovinos que apresentavam leptospirúria após oito dias, e não detectaram leptospiras na urina e nos rins desses animais após o tratamento. No mesmo trabalho os autores detectaram anticorpos contra leptospira na urina de apenas um animal tratado, e em todas as amostras de urina dos seis animais controle esses anticorpos foram detectados.
Gerritsen et al. (1993) estudaram vacas experimentalmente infectadas com L.
interrogans sorovar Hardjo com e sem tratamento com estreptomicina. As seis vacas tratadas tiveram baixa resposta imunológica quando comparadas com as não tratadas, e as amostras de urina dos animais tratados foram negativas a PCR a partir do segundo dia após o início do tratamento, enquanto as amostras de urina das não tratadas foram positivas por 70 dias.
Em estudo realizado numa fazenda cujo proprietário havia contraído Leptospira Hardjobovis, Gerritsen et al. (1994) trataram, com dihidroestreptomicina, as vacas dessa propriedade que eram sorologicamente positivas e que estavam excretando leptospira na urina com 25 mg/kg de peso vivo, e em uma semana todos os animais pararam de apresentar leptospirúria.
Avaliando vários antibióticos em 245 hamsters e 121 suínos experimentalmente infectados Alt & Bolin (1996) indicaram como tratamento de predileção a associação de dihidroestreptomicina e penicilina G, após observarem que dos seis tratamentos avaliados, este foi o que apresentou os melhores resultados.
Utilizando quatro esquemas de tratamento para leptospirose em 42 bovinos experimentalmente infectados, Alt et al. (2001) concluíram que a associação dihidroestreptomicina e penicilina G ainda é o melhor tratamento, embora outros
antibióticos (oxitetraciclina, tilmicosin, ceftiofur) também apresentem bons resultados.
Os mesmos autores ressaltam que critérios como custo, segurança e ação residual dos vários medicamentos disponíveis devem ser considerados.
Santos et al. (2001) empregaram ceftiofur sódico ou estreptomicina para a terapia da leptospirose em hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados com L. interrogans sorovar Pomona. Os resultados obtidos confirmaram a atuação da estreptomicina para o controle da leptospiremia e leptospirúria em uma única aplicação na concentração de 25 mg/Kg de peso vivo. O ceftiofur sódico aplicado da mesma forma na mesma concentração foi capaz de eliminar a infecção renal em 48 dos 50 animais inoculados.
O controle da leptospirose nos animais domésticos depende de um correto diagnóstico, de um tratamento apropriado e da implantação de medidas de manejo (HUHN et al., 1993). Ellis (1984) relata que a vacinação pode ser uma das mais importantes medidas de controle da doença e que pode estar associada com medidas de controle de roedores sinantrópicos. Smith (1984) menciona que a limitação do contato de roedores e animais silvestres com o bovino, seus alimentos e com a água de bebida é difícil de ser realizada, mas tal medida reduz o potencial de transmissão da leptospirose.
Em bovinos, a vacinação desempenha um importante papel no controle da leptospirose e deve ser associada a outras medidas de manejo, podendo com isso reduzir sensivelmente a prevalência de animais reagentes no rebanho (HODGES &
DAY, 1987), no entanto, quando se tenta fazer o controle de animais positivos para leptospirose apenas com vacinação corre-se o risco de aumentar o número de animais atingidos uma vez que a vacinação não elimina o estado de portador, e assim o animal continua excretando a leptospira no meio, mesmo sem apresentar a maioria dos sintomas. Percebe-se então a importância do tratamento adequado dos animais que já se encontram positivos, antes ou durante a implantação de um esquema de vacinação em rebanhos.
3. OBJETIVOS
1) Verificar o desempenho de duas marcas diferentes de antibióticos, cujo o princípio ativo é a estreptomicina, no tratamento de touros naturalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar Hardjo.
2) Realizar o monitoramento sorológico dos touros infectados por meio da prova de SAM.
3) Realizar o isolamento de Leptospira a partir da urina de touros naturalmente infectados através de inoculação direta, em meio de cultura semi-sólido e através de inoculação intraperitoneal em hamster.
4) Fazer a pesquisa de DNA da Leptospira na urina dos touros por meio da técnica da PCR.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
O trabalho foi realizado com 14 touros adultos (Bos taurus indicus), em quarentena separados em baias individuais numa Central de Inseminação Artificial (CIA) localizada no município de Sertãozinho, Estado de São Paulo. Foram escolhidos animais sorologicamente reagentes para Leptospira interrogans sorovar Hardjo utilizando a técnica de (SAM). De acordo com a rotina da CIA, o título mínimo de anticorpos para a seleção desses animais foi de 800, um dia antes do início do experimento. Além de reagentes para o sorovar Hardjo, os animais escolhidos apresentaram também reação positiva (anel de opalescência), a partir do isolamento da urina em meio de cultura semi-sólido de Fletcher.
4.2. Esquema do tratamento com os antibióticos
A partir do resultado positivo dos animais, os mesmos foram separados em quatro grupos, o primeiro com quatro animais, grupo 1, foram tratados com a estreptomicina da marca A e o segundo, com três animais, grupo 2, foram tratados com a estreptomicina da marca B. Os tratamentos dos animais dos dois grupos foram iniciados no dia seguinte após a confirmação dos resultados positivos nas técnicas de SAM e do isolamento em meio de cultura. Nestes grupos foram aplicados dose única de 25mg de estreptomicina por kg de peso corpóreo. Para controle do tratamento foram utilizados dois grupos, o primeiro, controle A, com quatro animais e o segundo, controle B, com três animais, que apresentaram títulos sorológicos de 800 contra o sorovar Hardjo na prova de SAM, um dia antes da aplicação das estreptomicinas A e B. Nos animais do grupo controle não utilizou-se a pesquisa na urina somente o monitoramento sorológico.
Paralelamente na urina dos animais do grupo tratado foi realizada pesquisa de DNA de leptospira por meio da técnica da PCR e isolamento com inoculação em hamsters (Mesocricetos auratus).
Os animais foram monitorados durante 25 dias, considerando-se o dia do primeiro tratamento como dia zero. Foram obtidas amostras de sangue e urina nos dias -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25 soros obtidos das amostras de sangue, grupo tratado e controle, foram dessoradas e submetidas a prova de SAM, as amostras de urina, do grupo tratado, foram submetidas às técnicas de tentativa de isolamento de leptospira e da PCR.
4.3. Colheita das amostras
4.3.1. Sangue
Amostras de sangue foi realizada por meio de venopunção sem anti coagulante.
O soro obtido foi então identificado e encaminhado para exames sorológicos, pela técnica de SAM no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal Unesp - Campus de Jaboticabal. A prova utilizada serviu como parâmetro para selecionar os touros para o estudo.
4.3.2. Urina
As amostras de urina foram obtidas após a desinfecção e lavagem do prepúcio através da técnica de massagem prepucial. Cada amostra foi dividida em três alíquotas:
uma para realização de isolamento do agente em meio de cultura semi-sólido, a segunda para isolamento por inoculação em hamster e a terceira para a realização da técnica da PCR. Para os isolamentos, as amostras foram processadas no menor tempo possível, menor que duas horas, e para a PCR foram congeladas a temperatura de -20º C até o momento do exame.
4.4. Pesquisa de anticorpos
4.4.1. Preparo dos antígenos de leptospira
Os sorovares Wolffi e Hardjo utilizados como antígenos foram provenientes de matrizes repicadas semanalmente em meio de cultura EMJH (Difco) enriquecido com soro sangüíneo de coelho, na proporção de 10%, e mantidos em estufa bacteriológica (B.O.D.) a temperatura de 28oC junto ao laboratório de Leptospirose e Brucelose Animal do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal Unesp - Campus de Jaboticabal. Todos os antígenos foram utilizados ao redor do sexto dia de incubação. A concentração considerada ideal foi padronizada de forma a corresponder à metade da turvação do tubo número 1 da escala de MacFarland (100 a 200 leptospiras por campo microscópico), livre de contaminação e de autoaglutinação, segundo as orientações de Sulzer & Jones (1980).
4.4.2. Técnica de soroaglutinação microscópica
Os soros foram diluídos em solução tamponada de Sörensen, segundo técnica utilizada por Santa Rosa (1970), sendo a diluição inicial de 1/50. Dessa diluição foram colocadas alíquotas de 50 µL em tubos e adicionada igual quantidade de antígeno, resultando na diluição de 1/100. A mistura soro-antígeno foi levemente agitada e incubada em estufa bacteriológica a temperatura de 28o C por duas horas, procedendo-se a seguir à leitura em microscopia de campo escuro, com objetiva de 25x e ocular de 10x. O critério adotado para considerar um soro como reagente foi o de 50% de aglutinação, ou seja, metade das leptospiras aglutinadas no campo microscópico no aumento de 250 vezes. Os soros reagentes na triagem inicial foram reexaminados com sete diluições seriadas de razão dois para obtenção do título final. O título do soro foi considerado a recíproca da sua maior diluição que apresentou 50% de aglutinação.
4.5. Instalação e manejo dos hamsters
Os hamsters utilizados para isolamento de leptospira foram mantidos em instalações apropriadas no Infectório de Enfermidades Infecciosas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, SP; com temperatura ambiental não climatizada, no interior de caixas plásticas individuais forradas com maravalha esterilizada, trocada a cada três dias, recebendo água comum da rede pública e ração comercial “ad libidum”.
Foram inoculados 63 hamsters com urina, supostamente contaminada, e 18 hamsters foram mantidos como controle. Dos 63 hamsters inoculados, 36 foram para o grupo A e 27 para o grupo B, os respectivos grupos controle foram constituídos de 9 hamsters cada.
Figura 1: Acondicionamento dos hamsters nas instalações do Infectório das Enfermidades Infecciosas do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal.
4.5.1. Pesquisa do agente na urina
Para pesquisa de leptospira na urina, foram empregadas as técnicas de: a) cultivo de leptospiras por inoculação de 2,0 mL de urina, por via intraperitoneal em hamsters machos com 80 a 120g de peso corpóreo; b) cultivo de leptospira em meio de cultura semi-sólido; e c) extração e detecção de material genético de leptospira por meio da técnica da PCR.
4.5.2. Pesquisa de anticorpos e tentativa de isolamento de leptospira em hamsters
Decorridos cinco dias da inoculação da urina, todos os hamsters, inoculados e controles (com aplicação de solução de Sörensen esterilizada), foram sacrificados individualmente em uma câmara com vapores de éter etílico. Foram colhidas
amostras de sangue, por punção cardíaca, para a pesquisa de anticorpos contra os sorovares Hardjo e Wolffi para obter a confirmação positiva para o sorovar Hardjo podendo ocorrer reação cruzada, foi realizada por meio da técnica de
soroaglutinação microscópica descrita no item 4.4.2. A seguir foi realizada rigorosa assepsia da região abdominal, procedendo-se a laparotomia mediana para retirada dos rins e fígado de cada hamster. Aproximadamente 1g de amostra de cada órgão foi colhido assepticamente, macerado individualmente em gral com pistilo
esterilizados, e suspendido em 2 mL de solução de Sörensen estéril. Após homogeneização por dois minutos, 1,5 mL de cada suspensão foi utilizado para cultivo de leptospiras.
Figura 2: Colheita das amostras de sangue de um dos hamsters após sacrifício.
Figura 3 e 4: Necropsia com colheita do material após rigorosa antissepsia, para retirada de rim e fígado para realização de isolamento em meio de
cultivo.
4.6. Isolamento de Leptospira em meio de cultura
Foi realizado o cultivo de leptospira pela semeadura em tubos de 1,5 mL da urina dos touros, suspensão de rim e suspensão de fígado dos hamsters sacrificados após cinco dias da inoculação da urina dos touros, em meio semi-sólido de Fletcher (Difco) acrescido de 5-fluorouratil (Hoffman – Roche), na proporção de 400µL/mL de meio, nas primeiras 24 horas de cultivo, seguido de repicagem e cultivo em meio livre de antibiótico. Após a semeadura, os tubos foram incubados à temperatura de 28° C durante 12 semanas, observando-se a ocorrência de anel de opalescência e realizando- se leituras semanais em microscopia de campo escuro, com objetiva de 40x e ocular de 15x.
Figura 5 e 6: Maceração dos órgãos em gral com pistilos esterilizados, para cultivo em meio de cultura.
Figura 7: Formação de anel de opalescência nos tubos com material em meio de cultivo, mostrando crescimento de leptospiras, confirmado pela microscopia óptica.
4.7. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
4.7.1. Extração de DNA: O protocolo de extração de DNA das amostras de urina por meio de lise enzimática com proteinase K foi realizado segundo (SAMBROOK et al., 1989)
• A técnica da PCR foi realizada em conformidade com o protocolo para a extração de DNA do Laboratório de Bacterioses, do Instituto Biológico de São Paulo, São Paulo. Resumidamente, foram adicionados 300µL de tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 (TE). (somente para as amostras de sêmen) para um microtubo de 1,5 mL contendo 300µL da amostra clínica, sendo este tubo homogeneizado por 10 segundos em agitador de tubos e centrifugado a 13.000 x g por 30 minutos. O sedimento foi
então ressuspenso adicionando 300µL de tampão de lise seguida da adição de 150µL de tampão fenol e homogeneizados por meio de agitação por 20 segundos em agitador de tubos. As amostras foram novamente centrifugadas a 13.00 x g por 5 minutos. A seguir, 200µL da fase aquosa foi transferida para um novo microtubo de 1,5 mL, tomando-se cuidado para não aspirar a interface orgânica, e adicionou-se 100µL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, na proporção de 25/24/1 em seguida, homogeneizado por 10 segundos em agitador de tubos e centrifugado por 13.000 x g por 5 minutos. Posteriormente 100µL da fase aquosa foi transferida para outro microtubo de 1,5 mL e acrescentou-se 20µL de acetato de sódio a 2M e 240µL de etanol absoluto, e então homogeneizados, invertendo-se o microtubo. Cada amostra foi mantida em temperatura de - 20º C “overnight”. Centrifuga-se o microtubo a 13.000 x g por 15 minutos e acrescentou-se 500µL de etanol 70%, invertendo-se várias vezes para lavar o sedimento de DNA. O sedimento foi centrifugado a 13.000 x g por 15 minutos, e o etanol descartado cuidadosamente. Para secar o sedimento, o microtubo foi invertido sobre papel absorvente. Para ressuspender o DNA, 30µL de TE com pH 7,4 foram adicionados ao microtubo que foi incubado em banho maria a temperatura de 56º C por 15 minutos, e posteriormente, mantido a – 20º C até ser realizada da técnica da PCR.
Figura 8: Fachada do Laboratório de Doenças Bacterianas da Reprodução do Instituto Biológico de São Paulo, onde foi realizada a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Figura 9: Laboratório de PCR, Sala de extração de DNA. Destaque para a capela (fluxo) para manipulação de DNA (“área suja”).
Figura 10: Laboratório de PCR, Sala de amplificação de DNA e revelação do gel de PCR
4.7.2. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) empregados na amplificação
Os oligonucleotídeos iniciadores Lep 1 e Lep 2 descritos por MERIEM et al.
(1992), foram escolhidos por serem gênero-específicos (Quadro 1).
Quadro 1: Oligonicleotídeos iniciadores Lep 1 e Lep 2 empregados na técnica da PCR.
PRIMERS SEQÜÊNCIA
Lep 1 5’ GGCGGCGCGTCTTAAACATG 3’
Lep 2 3’ TTAGAACGAGTTACCCCCCTT 5’
4.7.3. Amplificação do DNA bacteriano
A amplificação das amostras de DNA foram realizadas em microtubos de 500µL, com volume final de 50µL, de acordo com o protocolo de Meriem et al. (1992),
Inicialmente foram Adicionados 18,7 µL de água ultrapura e 5,0 µL de tampão de reação 10x (500mMKCl; 15mM MgCl2; 100mM tris-HCl, pH 9,0). Adicionou 8,0 µL da mistura de dNTPs (200mM de cada nucleotídeo [dCTP, dATP, dGTP, dTTP]) ,4,0 µL de Lep 1 (10 pmol/µL), 4,0 µL de Lep 2 (10 pmol/µL), 0,3 µL de Taq DNA- polimerase (5 unidades por µL) e 10 µL da amostra de DNA extraído.
Foi realizada a desnaturação da fita de DNA, utilizando a temperatura de 94ºC por 5 minutos. Foram empregados 29 ciclos, divididos em:
Desnaturação do DNA: 94º C/60seg Anelamento dos “primers”: 63º C/90seg
Polimerização do DNA: 72º C/120seg Extensão final: 72º C/10min
Figura 11: Termociclador para amplificação de DNA.
4.7.4. Análise do produto amplificado
A visualização do produto amplificado (330 pares de base) foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2,0% (p/v), utilizando-se tampão de corrida TBE 0,5 X (0,04M tris-acetato e 0,001M EDTA, pH 8,0), segundo Sambrook et al. (1989).
Como controle positivo foi utilizado uma cultura com o sorovar Pomona, e como controle negativo foi utilizada água ultra pura.
Figura 12: Deposição do DNA amplificado e corado com azul de bromofenol no gel de agarose a 2,0% para revelação das bandas.
4.8. Análise Estatística
No experimento utilizou-se a análise de variância de delineamento inteiramente casualizado em parcelas subdivididas no tempo (‘Split plot in time”). Para a comparação das médias geométricas dos títulos sorológicos empregou-se o Teste de Tukey (P>
0,05).
5. RESULTADOS
Na Tabela 1 são apresentados os resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR), dos isolamentos de Leptospira em meio de cultivo semi-sólido da urina de cada touro sororeagente submetido ao tratamento com estreptomicina das marcas A e B, e da cultura em meio semi-sólido de Fletcher das amostras de rins e fígados dos hamsters inoculados com a urina dos touros. Pode-se observar nessa tabela que a partir do 30 dia após o tratamento dos grupos 1 e 2 não foi possível detectar material genético de leptospira pela técnica de PCR em nenhuma das amostras de urina de touros. Porém pelo cultivo em meio semi-sólido, da urina dos touros foi possível isolar leptospira até o 30 dia do tratamento com os dois antimicrobianos utilizados, sendo que no grupo 2 todos os animais foram positivos. Os resultados do cultivo para leptospira a partir dos rins e fígados dos hamsters inoculados com a urina dos touros sorologicamente reagentes mostraram que apenas nos animais do grupo 1, ou seja, tratados com a estreptomicina A, foi possível o isolamento de leptospira. Nos rins e fígados dos hamsters dos grupos controles as culturas bacteriológicas foram negativas.
A Tabela 2 mostra os valores médios dos títulos sorológicos contra o sorovar Hardjo e os resultados da análise de variância entre os tratamentos dos touros sororeagentes com as estreptomicinas A e B. Antes do tratamento os animais dos grupos apresentaram título sorológico de 800, após a aplicação da estreptomicina as médias geométricas dos títulos sorológicos foram decrescentes a partir do 10 dia após o tratamento, nos touros que receberam a estreptomicina A (grupo 2), já no grupo 2 que foi tratado com a estreptomicina B os títulos começaram a cair apenas no 20 dia após o tratamento (Fig.13). No entanto, pelo Teste de Turkey as médias não diferiram entre si (P> 0,05).
Nas Figuras 14 e 15 pode-se verificar que, quando são comparadas as médias dos títulos sorológicos dos animais tratados com as médias dos seus respectivos grupos controle, verifica-se que quando os animais foram tratados, os
