Análise de proteínas secretadas pelas estirpes SmR1 e mutante (RAMHN1) de H

As análises eletroforéticas bidimensionais de proteínas extracelulares de H. seropedicae, estirpes SmR1 e RAMHN1 foram feitas em triplicata biológica e o perfil observado foi muito semelhante nas duas estirpes (figura 11).

A única diferença detectada foram diferentes isoformas da proteína FliD (HS255.0091) (destaque, figura 11). Esta proteína esteve presente nas duas estirpes como múltiplas isoformas. Na estirpe selvagem, as isoformas migraram com massa molecular aparente (MM) entre 63 e 65 kDa e ponto isoelétrico (pI) entre 7,6 e 9,8, sendo que a maioria focalizou entre os pIs 9,5 e 9,8. Na estirpe mutante,

as isoformas migraram com MM ligeiramente superior, entre 68 e 70 kDa e pI entre 7,0 e 9,9, sendo que a maioria focalizou entre os pIs 8,6 e 9,0. Estes resultados

FIGURA 10: LOCALIZAÇÃO CELULAR PREVISTA DAS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS NO SECRETOMA DE H. seropedicae

A previsão da localização celular foi feita utilizando o programa PSORTb v2.0.4 (http://www.psort.org/psortb/).

indicam que há diferenças na regulação pós-traducional desta proteína. Aparentemente, a proteína FliD da estirpe mutante é mais extensamente modificada que a da estirpe selvagem.

Recentemente foi demonstrado que em Pseudomonas aeruginosa existe um controle cruzado negativo entre proteínas do SSTT e as envolvidas na montagem do flagelo, sendo que a motilidade e/ou a montagem do flagelo são antagonistas ao SSTT. Foi observado que em estirpes sem flagelo, a expressão dos genes do sistema de secreção tipo III esteve aumentada. Por outro lado, a expressão de genes de proteínas do flagelo e a motilidade estiveram diminuídas em uma estirpe superexpressando ExsA, um regulador do SSTT, enquanto mutantes no gene que codifica a proteína do filamento do flagelo (∆fliC) apresentaram um SSTT supereficiente (SOSCIA et al., 2007). Portanto, é possível que na estirpe mutante RAMHN1, a ausência de um SSTT funcional tenha induzido a expressão e/ou modificações de proteínas do aparato do flagelo.

Excluindo a FliD, não foi detectada nenhuma outra proteína expressa exclusivamente pela estirpe selvagem ou mutante. A ativação do sistema de secreção tipo III de organismos nos quais este já foi bem caracterizado requer a presença de um indutor que é específico para cada espécie. Em outros casos, somente após contato com a célula hospedeira ocorre a ativação deste sistema.

Proteínas secretadas pelo sistema tipo III da bactéria fitopatogênica Pectobacterium atrosepticum já foram estudadas e foi definido um meio mínimo que mimetiza o apoplasto da planta e é capaz de induzir a secreção destas proteínas in

vitro (MATTINEN et al., 2007). Foram feitos estudos de secretoma em meio indutor e também extratos de plantas e os mapas bidimensionais resultantes foram comparados utilizando a estirpe selvagem e uma estirpe mutante no gene hrpG, que codifica para um regulador da expressão do SSTT (∆hrpG). Não foi possível observar nenhuma diferença no secretoma destas estirpes; pelo contrário, em todas as condições analisadas, foi observado um maior número de proteínas na estirpe mutante (MATTINEN et al., 2007). Resultados similares foram obtidos por Kazemi-Pour e colaboradores (2004), que analisaram comparativamente o secretoma da estirpe selvagem e uma estirpe mutante hrpG de Erwinia chrysanthemi. Foram

identificadas diversas proteínas relacionadas com virulência, entretanto, não foi possível identificar nenhuma proteína diferencialmente secretada entre as duas estirpes.

Tal fato por ser resultado da metodologia utilizada, que permite visualizar e identificar apenas proteínas muito abundantes. Se as proteínas do sistema tipo III são expressas em baixas concentrações é possível que sua presença nestes géis seja muito fraca para ser visualizada ou ainda, sua presença pode ser mascarada por proteínas mais abudantes que migram em locais próximos impedindo portanto sua identificação.

Até o presente momento, apenas 1 trabalho demonstrou a secreção de proteínas pelo sistema tipo III utilizando géis bidimensionais. Para isso, Nissinen e colaboradores (2007) utilizaram culturas de Erwinia amylovora cultivadas em um meio indutor bem definido, concentraram as proteínas 5000 vezes e utilizaram coloração com prata. Com esta metodologia, 6 proteínas candidatas foram identificadas, mas a qualidade destes dados devido às baixas concentrações foi ruim

o que fez com que estes autores tivessem que utilizar uma metodologia complementar (nano LC-ESI-MS/MS) para identificar um maior número de proteínas e confirmar a identidade das mesmas.

Apesar da identificação de proteínas pouco abundantes ser mais difícil, é possível visualizá-las utilizando métodos de coloração mais sensíveis, como a coloração com nitrato de prata. Após análise dos géis corados com Coomassie, os mesmos foram corados com prata para verificar se havia alguma diferença entre as estirpes, mas nenhuma diferença adicional foi detectada.

Outra alternativa é a necessidade de um indutor para identificar as proteínas secretadas pelos sistema tipo III. Entretanto, indutores já conhecidos foram utilizados por Matttinen e colaboradores (2007) e estes tampouco tiveram sucesso. Alternativamente, estes autores sugeriram que tendo em vista que proteínas efetoras do tipo III são necessárias em um estágio inicial na interação planta-bactéria, estas poderiam estar ausentes em culturas na fase estacionária, estágio no qual a maioria dos estudos foram feitos.

O aparato de secreção tipo III e o flagelo bacteriano possuem diversas características em comum, e já foi demonstrado que o flagelo é capaz de secretar proteínas (KONKEL et al., 2004; YOUNG et al., 1999). A diferença essencial entre os dois é que apenas o SSTT é capaz de translocar as proteínas diretamente até o citoplasma da célula hospedeira. Portanto, é possível que, na ausência do SSTT, o flagelo poderia funcionar como maquinaria de secreção, o que explicaria a ausência de diferença entre estas estirpes. Entretanto, o flagelo não é capaz de translocar proteínas para o interior da célula hospedeira (BLOCKER et al., 2003), o que justificaria avirulência ou virulência diminuída nestes mutantes.

Estudos de secretoma utilizando mutantes no sistema tipo III, no aparato flagelar e duplo mutante de bactérias cujos indutores do SSTT já foram bem estabelecidos poderiam ajudar a esclarecer esta questão.