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1 INTRODUÇÃO

1.2 SECREÇÃO DE PROTEÍNAS POR BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

1.2.3 Sistema Sec-dependente

Componentes estruturais do sistema Sec

O sistema Sec está envolvido na translocação de proteínas através da membrana citoplasmática e na inserção de proteínas integrais de membrana (FEKKES & DRIESSEN, 1999). Em E. coli, o sistema Sec é composto por várias proteínas de membrana interna (SecD, SecE, SecF, SecY), uma ATPase citoplasmática associada à membrana (SecA), uma chaperona (SecB), uma peptidase de sequência sinal periplasmática, além de um número de proteínas acessórias como SecD e SecF (HUECK, 1998). SecA possui 2 domínios de ligação a nucleotídeos trifosfato, cuja hidrólise fornece energia para o transporte. Entre os 2 domínios fica a região que se liga à pré-proteína e reconhece o peptídeo sinal (LEE & SCHNEEWIND, 2001).

SecY possui 10 regiões hidrofóbicas imersas na membrana. Com 48 kDa, é a maior subunidade de SecYEG, formando um poro através do qual as proteínas passam. Este complexo é o receptor de um dímero de SecA. SecE e G também

são proteínas de membrana. SecE atravessa a membrana 3 vezes e faz parte do poro. SecG estimula a secreção in vitro. Em condições de translocação, a proteína SecA aproxima dois dímeros de SecYEG formando um tetrâmero SecYEG que constitui um poro (PUGSLEY, 1993). SecYEG e SecA são conhecidos como translocase e são os componentes primários da maquinaria de translocação (MORI & ITO, 2001)

Todas as proteínas secretadas pela via Sec-dependente possuem peptídeo sinal, que funciona tanto no direcionamento quanto no reconhecimento do peptídeo pela translocase. O tamanho desta sequência varia de 18 a 30 resíduos de aminoácidos e pode ser dividida em 3 partes estruturalmente distintas: a região N-terminal, positivamente carregada (região N); a região central hidrofóbica (região H) e a região de clivagem, mais polar (região C). A sequência de aminoácidos dessas regiões não é bem conservada, mas suas características fisicoquímicas são (FEKKES & DRIESSEN, 1999; TJALSMA et al., 2000).

Resíduos de lisina ou arginina são responsáveis pela carga líquida positiva na região N. Esta carga serve para orientar as proteínas corretamente em relação à bicamada lipídica. O potencial elétrico transmembrana ( ,negativo dentro) previne a translocação de resíduos carregados positivamente e facilita os resíduos carregados negativamente. Desta maneira, o contribui para a topologia correta de proteínas de membrana, obedecendo a regra “positivo dentro” (VON HEIJNE, 1990).

O centro hidrofóbico da região H varia entre 7 e 15 resíduos. A hidrofobicidade total desta região contribui para a eficiência da translocação: a

eficiência aumenta com o aumento da hidrofobicidade desta região (CHOU & KENDALL, 1990).

A região C é o sítio de clivagem pelas peptidases de sinal. Esta é a única região que possui certa especificidade de sequência primária. São conhecidos dois tipos de peptidases de sinal: as do tipo I clivam pré-proteínas comuns enquanto que as do tipo II são específicas para lipoproteínas. Para sequências sinal que dependem de peptidases tipo I, as restrições estão nos resíduos localizados nas posições –1 e –3 em relação ao início da proteína madura. Esse domínio interage com a peptidase, que cliva a sequência sinal. Esses resíduos possuem cadeias laterais pequenas e neutras como alanina, glicina e serina, com uma preferência por alanina (VON HEIJNE, 1984). Lipoproteínas dependentes de peptidases tipo II possuem resíduos grandes e hidrofóbicos na posição –3, como por exemplo leucina e uma cisteína sempre está presente na posição +1. Após remoção da sequência sinal, esta é degradada por um número de peptidases (FEKKES & DRIESSEN, 1999).

Rotas de Direcionamento ao Sistema Sec Direcionamento Mediado por SecB

Existem duas rotas para direcionamento das pré-proteínas até a maquinaria de translocação do sistema Sec. A maioria das pré-proteínas seguem uma rota de direcionamento pós-traducional, na qual a proteína precursora se mantém em um estado desnaturado devido à interação com a chaperona SecB. SecB forma tetrâmeros de 64 kDa (PUGSLEY, 1993) e é quem direciona as pré-proteínas à subunidade periférica de SecA do complexo de translocação heterotrimérico (SecYEG) na membrana citoplasmática (LEE & SCHNEEWIND, 2001).

Após a ligação do complexo pré-proteína-SecB à SecA, SecB é liberada para atuar em novos substratos (FEKKES & DRIESSEN, 1999). SecA atua de forma cíclica, transportando a pré-proteína através do poro em vários passos. Um domínio de SecA de aproximadamente 30 kDa insere-se pelo menos parcialmente, através da membrana, carregando um segmento de aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos da pré-proteína (DOUVILLE et al., 1995). A hidrólise de ATP permite que SecA se dissocie da pré-proteína (ECONOMOU & WICKNER, 1994). SecA associa-se novamente e ocorre outro ciclo. O potencial elétrico da membrana auxilia na transferência da proteína através dos poros. O peptídeo sinal é a primeira parte a ser translocada, porém, a parte hidrofóbica fica retida na membrana. Assim que a proteína atinge o periplasma, uma peptidase de sinal cliva a sequência sinal (MORI & ITO, 2001; PUGSLEY, 1993; DRIESSEN et al., 2001).

Direcionamento Mediado pela Partícula de Reconhecimento de Sinal (SRP)

Esta via de direcionamento co-traducional envolve a partícula de reconhecimento de sinal (SRP). A SRP de E. coli é composta pela GTPase Ffh, de 45 kDa e pelo RNA 4.5S, de aproximadamente 100 pb (DRIESSEN et al., 2001).

A SRP reconhece a sequência sinal ou o segmento hidrofóbico transmembrana assim que ele emerge do ribossomo. O complexo ribossomo-pré-proteína e SRP (RNC) é então direcionado ao receptor FtsY de SRP, que fica ancorado à membrana interna. Essa interação aumenta a afinidade de Ffh e FtsY por GTP. O RNA 4.5S aumenta a afinidade de Ffh por sequências sinal e é essencial na interação entre SRP e seu receptor. A ligação de GTP a FtsY associado à membrana e/ou SRP dissocia o complexo RNC de SRP liberando a

pré-proteína para o complexo SecYEG (GU et al., 2003; MORI & ITO, 2001; PUGSLEY, 1993; DRIESSEN et al., 2001).

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