Para todos os grupos de dados, parâmetros como a média, desvio-padrão da média, erro padrão da média, teste de normalidade e demais testes estatísticos foram realizados com o auxílio do programa GraphPad Prism 6.0. Comparações estatísticas foram feitas por Student’s t-test, Mann-Whitney test e two-way ANOVA (Bonferroni post-hoc test). O intervalo de confiança adotado neste trabalho é de 95%.
Em alguns experimentos calculamos o tamanho do efeito (d) como uma ferramenta para quantificar a força de um fenômeno. Para tal quantificação foram utilizadas 3 equações, onde todas elas que subtraem a média de um grupo em relação ao outro e dividem o resultado pelo desvio padrão da população (Ellis, 2010). Quando o desvio padrão dos dois grupos foi semelhante, juntamos os dois desvios padrão para calcular o índice Cohen's d. No caso onde os desvios padrão entre os grupos controle e experimental foram diferentes, utilizamos o desvio padrão do grupo controle na equação para calcular o índice Glass's delta, visto que o grupo controle não sofre os efeitos da ablação e portanto, irá refletir genuinamente o desvio padrão da população. Ainda há a possibilidade de usar o índice Hedges' g quando o tamanho da amostra (n) é diferente entre os grupos, para isso calculamos o desvio da população baseado no n de cada grupo. Para mais detalhes de cada equação consulte o anexo 1. Valores de d entre 0.01 e 0.20 correspondem a um
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effect size pequeno, 0.50 indica um efeito médio, entre 0.80-1.20 revelam um
grande efeito e valores acima de 2 equivalem a um effect size enorme.
3.7.1 Análise da recombinação gênica
Em animais transgênicos para DCX-CRE-ERT2 e Ai9 cuja recombinação ocorreu em E14 foram escolhidas secções nos níveis rostral, intermediário e caudal de três animais com idade E16 e três animais com idade P0. Foi analisada qualitativamente a co-marcação entre as células que expressavam TdTomato com os fatores de transcrição TBR1, CTIP2 e SATB2.
3.7.2 Análise da morte celular
No experimento para identificar a morte neuronal, comparamos animais DTA+DCX+Ai9+ e controles que receberam Tamoxifeno em E12. Foram analisados cortes rostrais, intermediários e caudais de 3 animais por grupo a fim de visualizar a diminuição de células tomato-positivas em animais que sofreram a ablação. Em animais que receberam Tamoxifeno em E14 e foram analisados 36h depois, cortes coronais de 3 animais por grupo foram avaliados qualitativamente quanto a espessura da placa cortical.
3.7.3 Efeitos histológicos da ablação
Primeiramente, foram analisados cortes coronais de animais que receberam injeção de BrdU em E11, injeção de Tamoxifeno em E12 e foram sacrificados em
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E15. Foi traçada uma coluna partindo da superfície pial (formando um ângulo de 90°) até a parede do ventrículo lateral. A quantidade de células BrdU-positivas e TBR1-positivas foi avaliada em secções rostrais, intermediárias e caudais em 9 animais com idade E15. A análise estatística utilizada foi o Student’s t-test .
A análise histológica em animais com idade E18 e P0 foi realizada em diferentes níveis (rostral, intermediário e caudal) do córtex cerebral em 12 animais Os animais receberam Tamoxifeno em E14, BrdU em E15 e foram averiguadas as células TBR1-positivas, CTIP2-positivas e SATB2-positivas, bem como a co- localização dessas células com células imunomarcadas para BrdU. Esta análise foi dividida em dois tipos: análise por área e por bin. No primeiro caso foi traçada uma coluna desde a superfície pial até o ventrículo lateral com largura de 100µm. Na análise por bin, foi construída uma coluna semelhante com largura de 80μm, subdivida em 6 bins com tamanhos idênticos entre si, de forma que independente da espessura do córtex, os 6 bins ocuparão a mesma área no corte. A análise por bins permite avaliar o posicionamento das células ao longo do eixo vertical no córtex. A comparação estatística entre os valores encontrados foi realizada através do teste de Mann-Whitney para a análise por área e two-way ANOVA com Bonferroni post test para análise por bin.
3.7.4 Efeitos da ablação seletiva em longo prazo
Análise histológica em área motora, somatossensorial e visual foi realizada em animais P30 que receberam Tamoxifeno em E14. Foi quantificada a área total córtex cerebral , bem como a espessura da área motora, somatossensorial e visual.
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Além disso, foi analisada a densidade celular das áreas corticais citadas anteriormente. Neste experimento foram analisados 2 animais por grupo, portanto, trata-se de um resultado preliminar.
3.7.4 Efeitos da ablação seletiva in vitro
Culturas primárias foram acompanhadas por 5 dias eforam analisados os fenótipos dos neurônios gerados quando a morte neuronal ocorria in vitro ou durante a gestação. Para isso, todas as grávidas receberam tamoxifeno em E14, sendo que no primeiro caso as células dos embriões foram plaqueadas 6h após a injeção de tamoxifeno e no segundo caso as células foram plaqueadas somente 24h depois da injeção. Além disso, foi avaliada a quantidade de células que proliferaram 24h após administração de tamoxifeno. Como cada embrião possui um genótipo diferente, cada poço recebeu células de apenas um embrião. 15 embriões foram analisados neste experimento e os resultados foram comparados com o Student’s t-test.
3.7.5 Efeito de diferentes densidades celulares in vitro
Culturas primárias provenientes do telencéfalo dorsal de 10 embriões com idade E12 foram plaqueadas com densidade de 25 mil células ou 250 mil células a fim de serem comparadas quanto ao fenótipo de neurônios gerados após 4 dias in vitro. As lamínulas foram submetidas a imunohistoquímica com anticorpos para detectar CTIP2, SATB2 e Ror-β. Foi quantificado o número de neurônios expressando cada fator de transcrição normalizado pelo número total de células, bem como a porcentagem de células co-marcadas com dois ou três destes fatores de transcrição.
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