Análise da taxa de evolução: dN/dS

Para evidenciar as pressões seletivas sobre a porção codificante do genoma das

cepas foi avaliada taxa de substituição sinônima e não sinônimas. Estas análises

comparam a proporção de mutações silenciosas e as que estariam sob seleção, cuja

relação espera-se seja = 1 em condições de evolução neutral. Se o valor for superior,

indicaria que aquela proteína se encontra sob seleção positiva. Foram encontradas 536

famílias gênicas com evidência de seleção positiva comum a todas as cepas

industriais, e 161 famílias exclusivas das brasileiras. Os casos das famílias com ômega

= 999 como consequência do dS=0 não foram avaliadas, reduzindo assim para 45

famílias, que foram ordenadas em ordem crescente do valor do ômega e selecionadas

as dez mais baixas. Em seguida, foi verificado quais delas possuíam modificações em

sítios ativos ou de interação que poderiam estar afetados, e as duas resultantes estão

discutidas abaixo.

O enriquecimento avaliado por GO (Tabela 6) mostrou novamente que a maioria

dos genes envolvidos estão relacionados a sinalização celular, replicação de DNA e

organização de componentes celulares.

Tabela 6. Funções celulares enriquecidas na lista de genes comum as cepas brasileiras com evidência

de seleção positiva.

Entre os genes que apresentaram evidência de seleção positiva em sítios que

codificam regiões importantes para o funcionamento da proteína se encontram os

genes CTR1 (YPR124W) e RAD9 (YDR217C). O gene CTR1 codifica uma proteína

transportadora de cobre de alta afinidade, cuja transcrição é induzida sob baixos níveis

de cobre (LIN et al., 2002; NOSE; REES; THIELE, 2006). Este elemento é fundamental

para a célula, já que atua como cofator de muitas enzimas, afeta indiretamente a

absorção de ferro, principalmente a atividade da enzima SOD1p (PORTNOY et al.,

2001; RUOTOLO; MARCHINI; OTTONELLO, 2008). A sequência da ORF que codifica

Funções celulares enriquecidas Termo GO FDR Regulação da organização de componentes celulares GO:0051128 3.47E-02 Regulação da transcrição dependente do DNA GO:0006355 8.70E-03 Organização de componentes celulares _{GO:0016043 3.70E-02}

o CTR1 possui aproximadamente 560 nucleotídeos (~186 aminoácidos), e forma um

poro na membrana nuclear, com três unidades idênticas associadas (NOSE; REES;

THIELE, 2006). Esta sequência apresenta dos sítios com evidência de seleção positiva,

uma do lado da outra, na região que codifica a região intermembrana do poro (Figura

18A), que está em contato direto com o transporte do íon, o que possivelmente afetará

a dinâmica do transporte. Os efeitos da deprivação de cobre desencadeia nas células

baixa tolerância a estresses causados por acumulo de ROS, já que a funcionalidade da

enzima SOD1p é diretamente dependente do cobre, como já mencionado antes. Já que

as células durante a fermentação tem que tolerar grandes concentrações de álcool, o

que ocasiona o acumulo de ROS intracelular (HOHMANN; MAGNER, 2003), podemos

hipotetizar que estas modificações podem aumentar a afinidade de transporte,

tornando-o mais eficiente em casos de deprivação de cobre, e consequentemente

ocasionando uma maior tolerância ao acúmulo de ROS intracelular.

Figura 17. Sítios com evidência de seleção positiva nas proteínas CTR1 (A) e RAD9 (B). Cada barra

vertical representa uma posição da sequência da proteína, e as probabilidades de estar sob os diferentes tipos de seleção estão representadas pelas cores roxa (positiva), cinza (neutra) ou rosa (negativa). Os sítios com evidência de seleção positiva em domínios ativos das proteínas se encontram marcados com uma seta.

Na proteína RAD9 foram encontrados dois sítios com evidência de seleção

positiva, nos domínios BRCT e no domínio RAD53-binding da proteína (Figura 18B). O

gene RAD9 codifica uma kinase da mesma via que a RAD53, previamente descrita no

item 4.2.3.1: é uma proteína que auxilia nas respostas frente ao dano celular, nos

checkpoint da G2/M mas também nos pontos de controle de transição G1/S (BRANZEI;

FOIANI, 2006) A kinase RAD9p é fosforilada e assim ativada pela kinase MEC1p

(recrutada nos sítios de dano no DNA), e ambas interagem fisicamente com a RAD53p

formando complexos que, junto com o CHK1, resultam na detenção do ciclo celular até

que o dano seja reparado (BRANZEI; FOIANI, 2006). O domínio RAD53-binding da

RAD9p é fundamental para esta interação acontecer, e a perda de função nesta

proteína elimina completamente todos os pontos de controle na transição G1/S (DE LA

TORRE-RUIZ; GREEN; LOWNDES, 1998). Talvez esta pressão seletiva positiva esteja

relacionada com alterações no gene RAD53, que se encontra na lista de SNPs

missense, com uma alteração no domínio FHA, que interage fisicamente ao RAD9

(SCHWARTZ et al., 2002). O segundo domínio com evidência de seleção positiva na

RAD9p é o BRCT, um domínio muito conservado nos eucariotos, cuja função e mediar

a interação proteína-proteína, a grande maioria no contexto de reparo do dano ao DNA,

e cuja mutação, em humanos, tem sido associado a um aumento na predisposição de

câncer de colo e ovários de 80% (HUYTON et al., 2000). Desta forma, acreditamos que

a alteração neste sítio, no contexto do estresse celular que ocorre nas dornas,

contribua para uma melhor atividade da proteína, pois sem função de reparo ativa, sob

as inúmeras pressões, as leveduras seriam incapazes de sobreviver.

É interessante notar que os dois genes onde as modificações foram em sítios

ativos sejam relacionados a processos de tolerância a estresse. Isso apoia a ideia de

que estas linhagens se encontram constantemente em um processo de acúmulo de

modificações que contribuam para a resistência à fermentação industrial. Entretanto,

não podemos excluir a hipótese de que as mudanças fora de sítio ativo produzam

alterações estruturais nas proteínas, e em suas funções. Novamente, devemos

destacar que são necessárias análises posteriores em laboratório para avaliar se estes

sítios com evidência de seleção positiva de fato tem efeito na fisiologia das leveduras.