que o número de cópias mitocôndrias parece tem impacto maior na bioenergética celular, nós prosseguimos nossas análises avaliando esse parâmetro por meio da expressão do gene TFAM, o principal regulador do número de cópias mitocôndrias e que tem sua expressão associada com o mtDNAcn (TAN et al., 2015; WEST et al., 2015; REZNIK et al., 2016).
Primeiramente, nós correlacionamos a expressão do TFAM nas linhagens de melanoma com o mtDNAcn e os dados de bioenergéticas. Obtivemos correlações positivas com mtDNAcn (r=0,676, p=0,032, correlação de Pearson) (Fig. 24A), taxa de consumo de glicose (r=0,937, p=0,002) (Fig. 24D) e valores próximos ao significativo com os níveis de ATP (r=0,666, p=0,050) (Fig. 24C). Não encontramos nenhuma correlação entre a expressão do TFAM com os níveis de peróxido de hidrogênico (r=0,431, p=0.167) (Fig. 24B), taxa de produção de lactato (r=0,250, p=0.3164) (Fig. 24E) ou com eficiência metabólica (r=-0,589, p=0.8907) (Fig. 24F).
Resultados e Discussão | 61
Figura 24: Análises de correlação entre a expressão de TFAM nas linhagens de melanoma com mtDNAcn e os dados de bioenergética.
Peróxido de hidrogênio (µM)
Expressão relativa do TFAM (CPM)
Expressão relativa do TFAM (CPM)
Taxa de produção de lactato
(pmol/célula/dia)
Expressão relativa do TFAM (CPM)
Y lac/glc
C
D
E
F
Expressão relativa do TFAM (CPM)
A
B
mtDNAcn
Expressão relativa do TFAM (CPM)
ATP (µM)
Expressão relativa do TFAM (CPM)
Taxa de consumo de glicose
Embora não tenhamos encontrado correlação entre a expressão do TFAM e a eficiência metabólica, como havíamos encontrado nas análises de mtDNAcn, observamos correlações entre a expressão do TFAM com o consumo de glicose e uma tendência com os níveis basais de ATP, o que nos sugere que a expressão desse gene pode ser importante para o metabolismo do melanoma. Além disso, o silenciamento do TFAM já foi previamente associado com disfunção mitocondrial e mediando alterações metabólicas em outros tipos de câncer (LARSSON et al., 1998; BALLIET et al., 2011; XIE et al., 2016).
Diante disso, nós prosseguimos com as análises para investigar vias gênias reguladas pelo TFAM. Os dados de RNA-seq das linhagens de melanoma haviam sido gerados anteriormente nosso grupo. Utilizando esses dados nos avaliamos separadamente a expressão de TFAM (Fig. 25A). Como resultado, nós observamos que as linhagens tinham a expressão bem homogênea, com exceção da WM35. Optamos então por expandir o painel de linhagens utilizando dados públicos, proveniente do trabalho de Pawlikowski et al. (PAWLIKOWSKI et al., 2013). Ao final, nosso painel de linhagens possuía as oito linhagens que havíamos analisado anteriormente (FM308, WM35, WM1552, WM1789, WM793, WM278, 1205LU, WM1617), somadas a oito linhagens proveniente dos dados públicos (EBRAF-MC, A375, A2058, c32, MalMe3M, SKMEL28, SKMEL5, WM2664). Novamente, nós avaliamos as expressões desse gene no painel de linhagens expandido e observamos que as expressões eram bem diferentes entre elas (Fig. 25B). Então, selecionamos células com expressões distintas, dividindo assim em dois grupos: baixa e alta expressão de TFAM (Fig. 25B). Para comprovar que as células selecionadas tinham realmente expressões distintas, comparamos estatisticamente os grupos e comprovamos a diferença (p=0,0001383, teste t de student) (Fig. 25C). Nessa etapa, nós optamos por excluir os melanócitos, mantendo apenas as linhagens de melanoma para evitar viés nas análises. Além disso, todas as linhagens selecionadas possuíam a mutação BRAFV600E, já descrita como reguladora do
metabolismo oxidativo (HAQ et al., 2013). Prosseguimos então com as análises de expressão diferencial utilizando esses dois grupos de linhagens. Acreditamos que utilizando linhagens com expressões bem diferentes do TFAM, podemos identificar melhor vias gênicas moduladas por ele.
Resultados e Discussão | 63
Figura 25: Correlação do mtDNAcn com o TFAM e sua expressão nas linhagens de melanoma. (A) Expressão do TFAM nas linhagens de melanoma. (B) Variação na expressão do TFAM no painel de linhagens de melanoma adicionado aos dados públicos. (C) Expressão diferencial do TFAM entre os grupos com alta e baixa expressão desse gene, confirmando a diferença estatística entre os grupos (p= 0,0001383, teste t de student).
Nas análises de expressão diferencial entre os grupos, encontramos 295 genes diferencialmente expressos (FDR<0,05), destes 131 down e 164 up regulados no grupo com baixa expressão de TFAM. Esses genes podem ser encontrados no apêndice B, com seus respectivos Ensembl ID, fold change e valores de p ajustados (FDR). Utilizamos esses genes diferencialmente expressos (Differential expressed gene, DEG) para identificar vias gênicas enriquecidas utilizando a plataforma DAVID. Como resultado, obtivemos algumas vias associadas a angiogênese, ao sistema nervoso e processos celulares, como migração e adesão celular, sugerindo que o TFAM pode regular diversos processos biológicos (Fig. 26).
Interessantemente, a via de resposta a peróxido de hidrogênio também estava enriquecida, indicando que vias de respostas antioxidantes estão sendo reguladas por variações no TFAM/mtDNAc, como havíamos sugerido anteriormente após as quantificações de peróxido de hidrogênio.
Figura 26: Análise de vias linhagens de melanoma. Principais vias gênicas enriquecidas pelos 295 genes diferencialmente expressos as linhagens de melanoma com diferente expressão de TFAM.
Investigando detalhadamente os DEGs mais diferentes entre os grupos, observamos dois alvos do HIF1-α com expressão aumentada em linhagens com baixa expressão de TFAM (Baixo TFAM), o LOX e o VEGFC (Fig. 27A). A Lisil Oxidase (LOX) é uma das principais enzimas responsáveis pela propriedade invasiva das células cancerosa em hipóxia, agindo em mecanismos de adesão celular (ERLER et al., 2006). Já o VEGFC foi descrito como atuando na linfangiogênese (CARMELIET, 2005), e também foi associado anteriormente com alguns tipos de câncer (SU et al., 2007; DUFIES et al., 2017).
Figura 27: Expressão diferencial linhagens de melanoma. Análise de expressão diferencial entre as linhagens de melanoma com diferente expressão do TFAM (A) Vocano plot mostrando os principais genes diferencialmente expressos entre as linhagens de melanoma. (B) Heatmap com o padrão de expressão dos genes alvos do HIF-alpha nas linhagens de melanoma e os dois clusters com expressão distinta entre os grupos.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 Adesão celular Organização das fibrilas de colágeno Regulação negativa do desenvolvimento de projeções neurais Regulação positiva da proteína de sinalização Rho Angiogênese Regulação positiva da migração celular Fasciculação axonal Regulação do processo metabólico do cGMP Regulação positiva da migração de células endoteliais Organização da matriz extracelular Cicatrização Indução da angiogênese Resposta a peróxido de hidrogênio Percepção sensorial da dor Resposta a citocinas -log(P-value) Pr oc es so s bi ol óg ico s LOX SERPINE1 CCND1 VEGFA CXCL12 CTGF IGFBP2 PDGFA PFKL MMP9 PDGFB ANGPT2 ANGPT1 VEGFC SLC2A1 MMP2 TGFA FLT1 TEK PLAUR PDK1 SLC2A3 CXCR4 CDH1 VEGFB MXI1 ENO1 HK2 LDHA HK1 ALDOA KDR PGK1 SKMEL5 WM35 A375 A2058 WM1552 1205LU WM1617 WM278
Row Z-Score 2 1 0 1 2 TFAM Expression TFAM_Down TFAM_UP Tumorigenesis Angiogenesis Invasion Metabolism Proliferation 2
B
Cluster I Cluster IIResultados e Discussão | 65
Outros genes interessantes para o contexto tumoral também apareceram diferencialmente expressos, como o gene da 3-fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH). Esse gene codifica a primeira enzima da via da serina, um intermediário importante em diversas vias de biossíntese, como a de nucleotídeos. O PHGDH já foi descrito como amplificado em melanoma e estudos indicam que esse gene confere vantagens de crescimento às células tumorais (MULLARKY et al., 2011; RATNIKOV et al., 2016), inclusive, o silenciamento desse gene em células com alta expressão dele, resultaram na diminuição da biossíntese de serina e da proliferação celular.
A PHGDH age na primeira etapa de biossíntese da serina a partir do 3-fosfoglicerato, que é formado a partir da quebra da glicose (Fig. 28). Como nas linhagens com menor expressão de TFAM/mtDNAcn nós observamos um menor consumo de glicose, a baixa expressão dessa enzima pode ser consequência de uma baixa concentração da 3- fostoglicerato. Análises de metabolômica e fluxo metabólico seriam necessárias para confirmar essa hipótese.
Além disso, interessantemente alguns genes relacionados ao sistema imune, como o ALCAM e o EMB, ambos membros de famílias de receptores de imunoglobulina (FAGERBERG et al., 2014), apareceram down regulados no grupo com baixa expressão do TFAM, sugerindo uma modulação da resposta imune por esse gene (Fig. 27A). Esse dado corrobora com a análise de vias, onde a via de resposta a citocina estava enriquecida (Fig. 26).
Como dito anteriormente, dois alvos do HIF1-α apareceram up regulados em linhagens de melanoma com menor expressão do TFAM. A estabilização do HIF1- α é o principal mecanismo ativado em situações de hipóxia celular e é muito descrita no contexto do câncer, pois induz a expressão de vários genes de angiogênese, proliferação, reprogramação metabólica e adesão celular que conferem vantagens à célula cancerosa. Inclusive, nas análises com os DEGs, observamos vias de angiogênese e adesão celular enriquecidas (Fig. 26).
Diante de sua importância na tumorigênese, avaliamos se outros alvos do HIF-α estavam sendo regulados pelo TFAM, investigando somente as suas expressões nas linhagens de melanoma (Fig. 27B). Primeiramente, observamos que as linhagens foram agrupadas de acordo com a alta ou baixa expressão do TFAM, indicando que esse gene pode ter um papel importante na modulação da resposta do HIF1alpha. Além disso, observamos a formação de clusters de genes com padrões distintos de expressões. Nos interessamos especificamente por dois clusters que estavam bem discrepantes: um cluster com a expressão mais elevada em linhagens com baixa expressão do TFAM (Fig. 27B-Cluster I), e outro com menor expressão (Fig. 27B-Cluster II).
A fim de investigar se havia prevalência de alguma propriedade nos clusters, categorizamos os genes quanto as suas principais funções na tumorigênese. Como resultado, nós vimos que os genes com uma maior expressão no grupo baixo-TFAM eram em sua maioria relacionados a angiogênese e invasão, corroborando com as análises de vias enriquecidas, o que sugere que a baixa expressão do TFAM pode induzir esses processos. Por outro lado, o Cluster II possuía apenas genes relacionados a metabolismo.
Ao investigar o papel dos genes do Cluster II, observamos que o ENO1, HK2 e LDHA codificam enzimas que participam da quebra da glicose em piruvato (Fig. 28). A hexoquinase (HK2) é a primeira enzima da glicólise, sendo responsável pela conversão de glicose em glicose-6-fosfato. A alpha-enolase (ENO1) age na mesma via, convertendo 2-fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato e por fim, a lactato desidrogenase (LDHA) que converte piruvato em lactato, que tem a expressão bem característica da reprogramação metabólica (STRICKAERT et al., 2017).
Assim como sugerido anteriormente, como as linhagens de melanoma com menor mtDNAcn/TFAM consumiram menos glicose, acreditamos que essa diminuição na expressão das enzimas do metabolismo e quebra da glicose pode ser consequência do menor consumo deste metabólito. Como já descrito, o metabolismo tumoral é bastante heterogêneo e as células cancerosas podem depender de outras vias alternativas como fonte de carbono, como por exemplo a via do glutamato (RATNIKOV et al., 2016; STRICKAERT et al., 2017). Ainda, vale a pena salientar que nossas análises de expressão gênica utilizaram apenas 8 linhagens celulares de melanoma, um número amostral bastante limitado. Além disso, embora sejam bastante utilizadas, as linhagens celulares foram retiradas do microambiente tumoral há um certo tempo, o que pode desencadear padrões de expressões gênicas e epigenéticas diferentes das células tumorais originais (VAN STAVEREN et al., 2009). Então, para investigar melhor as vias gênicas pelas quais o TFAM pode regular os mecanismos celulares e metabólicos no melanoma, nós expandimos nossas análises para tecido humano, utilizando dados públicos depositados no TCGA.
Resultados e Discussão | 67
Figura 28: Vias metabólicas com enzimas alteradas nas análises com as linhagens de melanoma. Glicólise e via de biossíntese da serina, destacando as enzimas metabólicas que estavam diferencialmente reguladas na análise de expressão gênica entre os grupos de alto e baixo TFAM. Enzimas em verde foram encontradas down-reguladas no grupo baixo TFAM. Figura modificada de (LUO, 2011; STRICKAERT et al., 2017).
5.5 Análises de vias gênicas nucleares em tumores de melanoma metastático reguladas