Para avaliar melhor o papel da instabilidade do genoma mitocondrial em melanoma, nós partimos para uma abordagem in vivo onde utilizamos um modelo murino, previamente estabelecido por (DANKORT et al., 2009), adicionado a um background deficiente no Fator de transcrição A mitocondrial (TFAM).
Esse modelo murino recapitula aspectos fisiopatológicos chaves do melanoma, permitindo um controle temporal e local da iniciação do melanoma. Para tal, esse modelo utiliza um sistema de knockout condicional com vetor ERCre em um promotor da Tirosinase, que é expresso especificamente em melanócitos. A administração tópica de Tamoxifeno permite que a proteína fusionada Cre-ER entre no núcleo e interaja com os genes alvos, flanqueados pelas inserções loxP (floxed). No caso do gene Braf, o camundongo possui um alelo BrafCA (Cre-activated) que expressa a proteína BRAF selvagem se não for ativado pelo
tamoxifeno. Uma vez ativado, a Cre medeia a recombinação na qual o alelo BrafV600E passa a ser expresso em níveis fisiológicos normais (DANKORT et al., 2007). No caso do Pten, o tamoxifeno desencadeia a deleção dos exons 4 e 5 em ambos alelos, comprometendo assim o funcionamento da proteína e desencadeado o início do melanoma (BRAFV600E/PTENnull/TyrERCre (DANKORT et al., 2009) (Fig. 10)
Figura 10: Modelo murino induzível de melanoma. Modelo murino de melanoma onde a ativação da Cre recombinase por tamoxifeno leva a conversão do Brafwt (BrafCA-Cre-activated) em BrafV600 e deleção dos éxons
4 e 5 nos dois alelos do Pten (Ptenflox/flox) em melanócitos.
A adição do background de estresse no mtDNA ao modelo murino de melanoma foi feito por Dr. A. Phillip West, docente da Texas A&M University. Neste modelo, além das alterações nos genes Braf e Pten sob o vetor ERCre, foi adicionada uma alteração no gene Tfam. Entramos em contato com Dr. West e solicitamos uma Bolsa Estágio de Pesquisa no
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Exterior (BEPE) com duração de 9 meses, onde propusemos avaliar se o estresse no mtDNA limitada às células tumorais (Tfamflox) e tanto em células tumorais como no microambiente
tumoral (Tfam+/-), modifica o crescimento no melanoma, utilizando o modelo murino induzível de BRAFV600E/PTENnull/TyrERCre.
Para testar diferentes condições de estresse mitocondrial em melanoma, nós utilizamos quatro backgrounds diferentes modificando a expressão do TFAM: Tfam+/- com
instabilidade mitocondrial gerada pela ausência de um alelo do gene Tfam em todos os tecidos (Fig. 11, camundongo cinza); Tfam fl/+,com uma cópia do Tfam floxed, o que induz a deleção
de apenas um alelo Tfam nos melanócitos; Tfam fl/fl, homozigoto para o Tfam floxed, deletando ambas as cópias desse gene nos melanócitos (Fig. 11, camundongo azul); e Tfam +/+ que foi
utilizado como controle, sem nenhuma alteração no TFAM e, por consequência, sem depleção no mtDNA (Fig. 11, camundongo amarelo).
Figura 11: Estratégia experimental para avaliar as consequências da depleção do mtDNA no crescimento do melanoma.
Genotipagem dos camundongos
Como nossos camundongos tinham várias modificações genéticas, sete dias após o nascimento todos os camundongos eram identificados e genotipados para os alelos Tfam, Pten, Braf e Tirosinase Cre ER (TyrCre). As condições da PCR eram: 94C por 3 min, seguido por 34 ciclos de 94C por 30 seg, 59C por 30 seg, 72C por 1 min e uma extensão final de 72C por 10 min. Todos os primers podem ser encontrados na tabela 2.
Tabela 2: Sequencia dos primers utilizados na genotipagem dos camundongos
Gene Sequencia dos primers
TFAM- A 5’-TGGCTTTTCTGCAAGGTGCC - 3’ TFAM- B 5’- AGGCCACTTTCCATCCCTTG- 3’ TFAM- C 5’- AGATTAGGAGGGTCTCGCACT- 3’ PTEN-A 5’- TGTCTGGCAATGCTGTAGTAATA- 3’ PTEN-B 5’- GCATACATTATACGAAGTTATGGC- 3’ PTEN-D 5’- AAGATAATCCCAGTGTAAGAAAA- 3’ BRAF-A 5’- TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC-3’ BRAF-B 5’- CTCTGCTGGGAAAGCGGC- 3’ TyrCre-1 5’- CAATGGTAGGCTCACTCTGGGAGATG 3’ TyrCre-2 5’- AACACACACTGGCAGGACTGGCTAGG- 3’ TyrCre-3 5’- CAGGGTGTTATAAGCAATCCC- 3’ TyrCre-4 5’-CCTGGAAAATGCTTCTGTCCG- 3’ Indução do melanoma
Os tumores eram induzidos após 21 dias do nascimento dos camundongos. No dia anterior a indução, nós removíamos os pelos dorsais dos camundongos com o creme depilatório Veet, e no dia seguinte, aplicávamos topicamente 1µl de uma solução de 25mM de 4-hidroxitamoxifeno (4OHT), dissolvido previamente em etanol. Após a indução, os camundongos eram monitorados diariamente, para verificar o surgimento do tumor, e eram eutanasiados oito semanas após a aplicação de 4OHT, ou antes dos tumores chegarem a 1cm3 (Fig. 12).
Após a eutanásia, os tumores eram medidos, pesados e congelados em nitrogênio líquido para serem usados em análises posteriores. Os volumes dos tumores foram calculados multiplicando comprimento, largura e altura.
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Figura 12: Workflow da indução localizada do melanoma.
Análise de metabolômica
As análises de metabolômica foram feitas na Metabolomics Facility da Children’s Medical Center Research Intitute at UT Southwestern, em colaboração com Dr. Ralph DeBerardinis. Para as análises de metabolômica, nós homogenizamos uma amostra tumoral de 50mg em metanol 80% gelado, usando beads de 2,0mm de zircônia no equipamento Mini- BeadBeater-16 (Biospect). Após a homogeneização, nós transferimos 200µl do líquido para um novo tubo que continha 800µl de metanol 80% gelado. As amostras foram misturadas vigorosamente por 1 minuto e centrifugadas a 14.000 rpm por 15min a 4C. O sobrenadante contendo os metabólitos foi transferido para um novo tubo e submetido a análise de metabolômica.
A identificação e quantificação relativa dos metabólitos foi feita no equipamento QTRAP 5500 LC-MS/MS (AB Sciex), utilizando o método Selected Reaction Monitoring (SRM), seguido de uma análise de integração da área do pico com o software MultiQuant 2.0 (YUAN et al., 2012). Em cada amostra, a área de pico de cada metabólito identificado foi normalizada contra o Total Ion Count (TIC) de todos os metabólitos identificados, a fim de corrigir qualquer variação. Em seguida, os dados normalizados foram usados para análises estatísticas e de enriquecimento de vias no software MetaboAnalyst 3.0 (XIA; WISHART, 2002).
Análise de expressão gênica
Para a análise de expressão gênica, nós maceramos amostras tumorais com cerca de 15-20mg e extraímos o RNA com o kit Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research). O RNA teve sua integridade checada e foi utilizado para a preparação da biblioteca com o kit TruSeq Stranded mRNA Library Prep (Illumina), seguido de sequenciamento no HiSeq 4000 (Illumina) pelo serviço de Genômica e Bioinformática da Texas A&M University.
Os dados brutos foram tratados conforme descrito anteriormente em Análise do Exoma, tendo por fim sua qualidade checada com o software FastQC. No entanto, a análise do RNA-seq foi feito de uma maneira diferente com o software CLC Genomics Workbench 8 (Version 8.0.1). Nesse software, os arquivos “.fastq” foram mapeados contra a sequencia de referência do Mus musculus (GRCm38). Rodamos então a ferramenta de análise de RNA-seq com as opções “Genome annotated with Genes and transcripts” e “Map to gene regions only”, que leva em consideração genes e transcritos anotados anteriormente e ignora todas as regiões intergênicas na referência. A análise de expressão diferencial foi feita com a ferramenta "Empirical Analysis of DGE", colocando o grupo Tfam+/+ como controle. Essa ferramenta é baseada no edgeR, package que utilizamos nas outras análises de RNA-seq. Análises de via, enriquecimento, reguladores upstream e integração de dados com o perfil metabólico foram feitos no Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen).
qRT-PCR
O RNA extraído anteriormente foi também utilizado para a síntese de cDNA (RT) usando o kit qScript XLT cDNA SuperMix (Quanta Bio). Com o cDNA nós realizamos a PCR quantitativa com o SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) no equipamento CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). As expressões gênicas foram determinadas utilizando o método de 2-DDCt, utilizando o gene GAPDH como normalizador. A sequencia dos primers usados para a validação da qPCR podem ser encontrados na tabela 3.
Tabela 3: Sequência dos primers utilizados na qPCR
Gene Sequencia dos primers
Gapdh- F 5’- GACTTCAACAGCAACTCCCAC- 3’ Gapdh - R 5’- TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3’ Tfam- F 5’- AAGGATGATTCGGCTCAGG- 3’ Tfam- R 5’- GGCTTTGAGACCTAACTGG- 3’ MadCam1- F 5’- GGGCAGGTGACCAATCTGTA- 3’ MadCam1- R 5’- ATAGGACGACGGTGGAGGA- 3’ Glud1- F 5’- GACGACCCCAACTTCTTCAA- 3’ Glud1- R 5’- CAGCTTGTCCTCTACGATGCT- 3’ Gls- F 5’- GCACAGACATGGTTGGGATA- 3’ Gls - R 5’- TTCACATGTCACTTCAATAGAGCA- 3’
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Western blot
Para a obtenção de proteínas, nós homogeneizamos amostras tumorais com cerca de 30mg em tampão RIPA contendo inibidores de proteinase, utilizando beads de zircônia de 2,0mm no Mini-Bead-Beater-16 (Biospect). Os lisados foram quantificados com o kit Pierce BCA Protein Assay.
Após a quantificação, 25-30µg do lisado foi misturada com 6x SDS e aquecida a 95°C por 5 minutos. Foi utilizado o sistema vertical de eletroforese Mini-PROTEAN Tetra cell (BioRad), conforme instruções do fabricante. À cuba de eletroforese foi adicionado o tampão de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS 1%), com 100V constante. As proteínas foram eletrotransferidas para membranas de PVDF (Hybond-P, GE Life Sciences, EUA), utilizando o sistema Mini Trans-Blot (BioRad) com tampão de transferência gelado (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%) por aproximadamente 1 hora a 100 V. Após a transferência, a membrana foi lavada com água destilada e embebida em metanol. Em seguida, foi colocada em por 30min em uma incubadora a 37C para secar.
Uma vez seca, foi adicionado o anticorpo primário e deixado overnight a 4C em uma baixa rotação (11rpm). Após a incubação com o anticorpo primário, a membrana foi lavada cinco vezes, por 5min com PBS 1x. Em seguida a membrana foi incubada por 1 hora, em temperatura ambiente, com o anticorpo secundário previamente diluído na proporção de 1:20.000 em tampão de bloqueio. Após a incubação, a membrana foi lavada 10 vezes por 5min com PBS 1x. Após a lavagem, a membrana foi incubada por 3 minutos com o substrato ECL-Plus (GE Life Sciences, EUA) e, então, levada a sala escura onde foram reveladas. O anticorpo anti- HSP60 foi usado como controle de carregamento de proteínas no gel e para normalização da quantidade de proteína de interesse.