ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS 1 Cromatografia em camada delgada

É uma técnica amplamente utilizada em análises fitoquímicas, sendo utilizado neste trabalho cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), apenas para fins analíticos qualitativos, e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP), com finalidade de isolamento e purificação das substâncias em misturas presentes na amostra.

Os reveladores utilizados foram luz UV a 254 e 366nm (método físico), sulfato cérico e anisaldeído sulfúrico seguidos de aquecimento, KOH-5% em etanol, NP-PEG (métodos químicos).

Reveladores utilizados:

Anisaldeído sulfúrico:

Revelador utilizado para detecção de terpenóides, levando a coloração intensa após aquecimento em chapa a 100ºC.

Preparação: Em banho de gelo, a 0,5mL de anisaldeído, adiciona-se 10mL de ácido acético glacial, 85mL de metanol e 5mL de ácido sulfúrico concentrado.

NP-PEG/UV

Revelador utilizado para detecção de vários flavonóides (agliconas e heterosídeos), assim como derivados do ácido fenilpropanóico, (WAGNER, 1984). Sua detecção se dá por cores com fluorescência intensa, estruturas dependentes, quando visualizadas em 366nm. A adição de polietilenoglicol aumenta o limite de detecção.

Preparação: Reagente A: solução metanólica a 1% de difenilboriloxietilamina (NP)

Reagente B: solução etanólica a 5% de polietilenoglicol 4000 (PEG)

Sulfato cérico:

Esse revelador evidencia vários tipos de substâncias, tais como terpenóides, flavonóides, ácidos fenólicos e seus derivados, entre outros. Sua detecção se dá após aquecimento da placa em chapa a 100ºC.

Preparação: A 128mL de H2O destilada, adiciona-se aos poucos 72mL de ácido

sulfúrico concentrado. Posteriormente, adiciona-se sulfato cérico, até se observar precipitação. Filtra-se para retirar o precipitado, obtendo-se assim a solução.

KOH-5% em etanol:

Esse revelador é utilizado para a detecção de cumarinas, as quais adquirem coloração verde-azulada quando visualizadas sob luz UV.

3.2.2.2 Cromatografia em coluna

Sílica (fase normal)

Foi utilizada para a separação de substâncias de polaridade baixa a intermediária.

Sephadex LH-20

Conhecida como cromatografia por exclusão, esta coluna efetua a separação de acordo com o tamanho das moléculas. Foi utilizada na separação de substâncias provenientes de frações polares. Neste trabalho, utilizou-se metanol como fase móvel. As amostras foram submetidas a um “clean-up”, o qual consiste na sua solubilização em metanol, e posterior centrifugação a 3000rpm, por 20min, sendo o sobrenadante eluído na coluna.

3.2.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Neste trabalho, utilizou-se esta técnica com fins analíticos e de purificação. As amostras foram previamente solubilizadas em solvente apropriado, seguido de filtragem em membrana Millipore (0,45µm).

Condições de análise (C1): Utilizou-se coluna analítica ODS (4,6 x 250mm); FM MeOH:H2O em gradiente (0,01 a 25min – 40% a 100% de MeOH; 25 a 30min – 100% de

MeOH; 30 a 35min – 100% a 40% de MeOH; 35 a 40min – 40% de MeOH. O fluxo foi de 0,8mL/min, e o volume injetado de 20µL.

Condições de análise (C2): Utilizou-se coluna analítica ODS (4,6 x 250mm); FM MeOH:H2O em gradiente (0,01 a 15min – 25% a 50% de MeOH; 15 a 20min – 50% de

100% a 25% de MeOH; 27 a 30min – 25% de MeOH. O fluxo foi de 0,9mL/min, e o volume injetado de 20µL.

Condições de análise (C3): Utilizou-se coluna preparativa ODS (20 x 250mm); FM MeOH:H2O em gradiente (0,01 a 30min – 25% a 50% de MeOH; 30 a 40min – 50% de

MeOH; 40 a 44min – 50% a 100% de MeOH; 44 a 50min – 100% de MeOH; 50 a 54min – 100% a 25% de MeOH; 54 a 60min – 25% de MeOH. O fluxo foi de 9,0mL/min, e o volume injetado de 1,0mL.

Condições de análise (C4): Utilizou-se coluna analítica ODS (4,6 x 250mm); FM MeOH:H2O em gradiente (0,01 a 11min – 25% a 42% de MeOH; 11 a 12min – 42% a 50% de

MeOH; 12 a 25min – 50% a 57% de MeOH; 25 a 27min – 57% a 100% de MeOH; 27 a 32min – 100% a 25% de MeOH. O fluxo foi de 0,9mL/min, e o volume injetado de 20µL.

Condições de análise (C5): Utilizou-se coluna preparativa ODS (20 x 250mm); FM MeOH:H2O em gradiente (0,01 a 22min – 25% a 42% de MeOH; 22 a 24min – 42% a 50% de

MeOH; 24 a 50min – 50% a 57% de MeOH; 50 a 54min – 57% a 100% de MeOH; 54 a 64min – 100% a 25% de MeOH. O fluxo foi de 9,0mL/min, e o volume injetado de 1,0mL.

3.2.2.4 Cromatografia gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas (GC-MS)

A cromatografia gasosa é utilizada na separação de substâncias apolares, tais como misturas de substâncias voláteis. Nas aplicações analíticas, é possível o acoplamento com o Espectrômetro de Massas (GC-MS), permitindo tanto a identificação quanto a quantificação de componentes de baixo peso molecular, mesmo em misturas complexas. Neste trabalho, utilizou-se o impacto eletrônico como modo de ionização das substâncias.

Esta técnica foi empregada na identificação estrutural de substâncias presentes em frações de baixa polaridade, baseado na comparação dos espectros de massas da biblioteca Willey e padrões do laboratório, além dos índices de retenção de Kovats’ (IK), sendo que para a determinação dos IK foi necessária a injeção de hidrocarbonetos n-alcanos (C9-C22).

(ADANS,1995).

Algumas amostras foram previamente submetidas a um “clean-up”, em coluna Sepack – sílica (fase normal). Neste procedimento, as amostras, após adsorção em sílica –fase normal, foram eluídas seqüencialmente, com hexano, diclorometano e metanol. As frações analisadas foram provenientes da eluição em diclorometano.

Condições de análise (C6): foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250oC) e com proporção slipt 1/50. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 2,00 mL/mim, pressão de 131,6 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de 75ºC por 6,0min, de 75ºC a 170ºC a 20ºC/min; 170ºC por 5,0min; de 170ºC a 260ºC a 5ºC/min, 260ºC por 1,0min; de 260ºC a 280ºC a 10ºC/min; 280ºCpor 15,0min; de 280ºC a 300ºC a 10ºC/min; e 300ºC por 3,0min.

Condições de análise (C7): foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250oC) e com proporção slipt 1/50. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 1,78 mL/mim, pressão de 131,4 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de 100ºC por 2,0min, de 100ºC a 200ºC a 15ºC/min; de 200ºC a 230ºC a 6ºC/min, 230ºC por 2,0min; de 230ºC a 280ºC a 15ºC/min; e 280ºC por 15,0min.

Condições de análise (C8): foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250oC) e com proporção slipt 1/50. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-1 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 1,78 mL/mim, pressão de 131,4 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de 100ºC por 2,0min, de 100ºC a 200ºC a 15ºC/min; de 200ºC a 230ºC a 6ºC/min, 230ºC por 2,0min; de 230ºC a 280ºC a 15ºC/min; e 280ºC por 15,0min.

Análises quantitativas em GC-MS:

A padronização do método de extração da lavagem foliar de M. laevigata e M.

glomerata foi baseado na linearidade, seletividade, precisão, exatidão e limite de detecção

Tabela 4. Parâmetros utilizados na padronização do método de extração das folhas de M.

laevigata e M. glomerata.

Parâmetros

Seletividade Garante que o pico da substância a ser quantificada seja exclusivamente da substância de interesse. Como o método utilizou detecção por espectrometria de massas, a comparação com os espectros dos picos obtidos na separação com o de um padrão, indicou a presença de picos das substâncias puras, nas condições experimentais C8.

Linearidade É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Neste trabalho, as soluções padrão utilizadas na construção da curva de calibração foram injetadas no cromatógrafo em triplicata, sob as condições de análise C8, da solução menos concentrada para a solução mais concentrada. Foi obtido um valor médio para as áreas dos picos para cada concentração, e plotado um gráfico área do pico x concentração.

Precisão Intra-dia: foram realizadas 3 extrações para as folhas de M. laevigata e

M. glomerata (procedimento P2), e analisadas sob as condições C8. Os

resultados foram expressos através da estimativa do coeficiente de variação (%CV).

Inter-dia: foram realizadas 3 extrações para as folhas de M. laevigata e

M. glomerata (procedimento P2), em três dias consecutivos, e as

amostras analisadas sob as condições C8. Os resultados foram expressos através da estimativa do coeficiente de variação (%CV).

Exatidão Foi estimado a partir de ensaios de recuperação, no qual concentrações conhecidas do padrão das substâncias a serem quantificadas foram adicionadas ao solvente extrator, seguindo-se a mesma metodologia de extração/quantificação empregada com a amostra (Procedimento P2, Condições C8). A recuperação é expressa em termos de porcentagem da quantidade medida da substância em relação à quantidade adicionada na matriz, em um determinado número de ensaios.

Limite de

detecção É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção foi estimado com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de base.

3.2.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS – IONIZAÇÃO POR