MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS

Quanto aos materiais vegetais em estudo:

Coleta e identificação de Mikania laevigata para a realização de trabalho fitoquímico.

O material vegetal foi coletado na cidade de Ribeirão Preto – SP, em novembro de 2005. Sua identificação botânica foi realizada pelo Prof. Roberto Lourenço Esteves, da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, e sua excicata está depositada no Herbarium Bradeanum da UERJ, sob o nº CAC02.

Coleta de Mikania laevigata para a realização da padronização do extrato da lavagem foliar. O material vegetal foi fornecido pela Profª. Drª. Maria do Carmo Vieira da Faculdade de Agronomia da UFMS – Dourados, em julho de 2007.

Coleta de Mikania laevigata para a realização da análise comparativa dos extratos da lavagem foliar em duas épocas do ano.

O material vegetal foi coletado na cidade de Ribeirão Preto – SP, em janeiro de 2006 e em julho de 2006, sendo as folhas adquiridas do mesmo espécime utilizado para o estudo fitoquímico.

Coleta de Mikania glomerata para a realização da padronização do extrato da lavagem foliar. O material vegetal foi fornecido pela Profª. Drª. Maria do Carmo Vieira da Faculdade de Agronomia da UFMS – Dourados, em julho de 2007.

Coleta de Mikania glomerata para a realização da análise comparativa dos extratos da lavagem foliar em duas épocas do ano.

O material vegetal foi fornecido pela Profª. Drª. Maria do Carmo Vieira da Faculdade de Agronomia da UFMS – Dourados, em julho de 2006 e em janeiro de 2007.

Amostras de “guaco” para avaliação do perfil químico.

As amostras, com utilização popular, foram obtidas dos estados: Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina.

Quanto aos materiais utilizados:

Os solventes utilizados foram de grau técnico, purificados no laboratório, e de grau P.A. As placas cromatográficas CCDC e CCDP foram preparadas a partir da suspensão de gel de sílica 60 (GF254 – Merck) em água destilada, sendo a espessura de 0,25mm para as placas comparativas e 1,00mm para as placas preparativas.

Os reveladores utilizados na cromatografia em camada delgada foram: irradiação UV de 254 e 366 nm (método físico), NP-PEG, sulfato cérico, anisaldeído sulfúrico e KOH-5% em etanol (métodos químicos).

Utilizou-se o ultrassom da marca Odontobrás, modelo 1440D. Utilizou-se centrífuga da marca Fanem®, modelo 206.

Utilizaram-se filtros Millipore LCR – 0,45µm da marca MillexTM. Utilizou-se padrão de cumarina da marca Sigma-Aldrich.

Foram utilizados gel de sílica (230 – 280 Mesh – 0.060 – 0.200mm, diâmetro de poro: 6mm) e Sephadex LH-20 para a realização das colunas cromatográficas clássicas.

Para efetuar a secagem de algumas frações foi utilizado o evaporador rotatório, sob pressão reduzida, da marca TECNAL, modelo TE-120.

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C foram obtidos através dos espectrofotômetros BRUKER DPX 300; BRUKER DRX 400 e BRUKER DRX 500, com a utilização de solventes deuterados da marca Aldrich.

As obtenções dos αD foram realizadas em Polarímetro digital, marca Jasco, modelo DIP-

370. As leituras foram realizadas em 589nm.

As análises em HPLC foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com três bombas Shimadzu, modelo LC-6AD, detector de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelo SPD-M10AVP, injetores manual e automático e sistema de integração computadorizada com software CLASS-VP. Foram utilizadas coluna analítica C18 (4,6 x 250mm; 5µm) e coluna semipreparativa C18 (20 x 250mm, 15µm) modelo SHIM- PACK PREP. ODS(H) KIT, Shimadzu. Foi utilizada também a pré-coluna ODS-8, Shimadzu.

Para as análises no Espectrômetro de Massas, utilizou-se o aparelho da marca Bruker Daltonics, modelo: ultrOTOFQ - ESI-TOF Mass Spectrometer.

As análises por GC-MS foram realizadas em Cromatógrafo gasoso acoplado a Espectrômetro de Massas com modo de ionização por Impacto eletrônico, marca Shimadzu, modelo GC-MS-QP2010. As análises foram realizadas utilizando-se as colunas DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) ou DB-1MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) e hélio como gás de arraste.

3.2 METODOLOGIA

Neste tópico serão apresentados os métodos utilizados no processo de obtenção de extratos, isolamento, purificação, elucidação estrutural e análises em GC-MS.

3.2.1 EXTRAÇÕES

As extrações foram realizadas após separação das folhas e secagem das mesmas em estufa a 40ºC.

3.2.1.1 Lavagem foliar com diclorometano Neste trabalho, utilizou-se essa extração:

Na fitoquímica de M. laevigata, no intuito de isolar as substâncias presentes nesse extrato, e posteriormente utilizá-los como padrões em análises por GC-MS. (procedimento P1).

Nas análises químicas qualitativas e quantitativas, em GC-MS, dos constituintes presentes na superfície foliar de M. laevigata e M. glomerata (procedimento P2). Nas análises químicas, em GC-MS, dos constituintes presentes na superfície foliar de amostras de uso popular de “guaco” provenientes de diferentes regiões do Brasil (procedimento P2).

Procedimento (P1): Folhas secas e íntegras de M. laevigata foram submetidas a extração, por 30 segundos, com diclorometano. O extrato foi filtrado em lã de vidro, e rotaevaporado em banho a 25ºC.

Procedimento (P2): Pesou-se aproximadamente 5,0g de folhas secas e íntegras, sendo

essas submetidas a extração, por 30 segundos, com 150mL de diclorometano. O extrato foi homogeneizado, sendo 20mL filtrados em membrana Millipore - 0,45µm, e seco em ar comprimido. O extrato seco obtido foi então pesado, diluído em 1mL de diclorometano, e injetado no cromatógrafo.

3.2.1.2 Percolação

Consiste num método de extração exaustiva, no qual o pó do material vegetal é acondicionado em percolador, e o solvente extrator é submetido a um fluxo lento e constante. Neste trabalho, este processo extrativo foi utilizado na obtenção do extrato etanólico bruto de

M. laevigata, para posteriores estudos fitoquímicos da espécie.

A obtenção dos extratos utilizados na fitoquímica de M. laevigata está ilustrado no fluxograma 1.

Fluxograma 1. Preparação dos extratos para estudo fitoquímico de M. laevigata.