Análises das integrações no locus da distrofina

Integração de minicírculos de kDNA no locus da distrofina foi documentada em células somáticas de diversas aves da Família 1, inclusive nas aves k1-207 e k1-202 do presente estudo (Guimaro, 2012). Ademais, estudo anterior revelou a possível associação deste gene com os múltiplos fatores da patogênese da doença de Chagas, traduzindo em insuficiência cardíaca e fraqueza da musculatura esquelética (Teixeira e cols, 2011a). O gene da distrofina (Gene ID: 396236, NCBI) é cópia única

Figura 32. Análise conformacional de sequências de minicírculos de kDNA integradas no gene da enzima málica. a) As tensões que geram curvaturas (linha vermelha) e os teores de C/G (linha verde) estão indicadas na sequência ENG 66 (da ave k1-527). Note que a região deletada (caixa) corresponde a uma alça de curvatura do DNA. b) Imagem representativa da topologia da quimera kDNA- enzima málica. O círculo destaca a curvatura sujeita a deleção. c) A deleção de parte da sequência do kDNA resultou em perda de curvatura na molécula de DNA.!Verde: gene da enzima málica; azul escuro: região conservada de kDNA; azul claro: região variável de kDNA; amarelo: região de microhomologia. ! 455 1!! 244 ! !! 963 1!! 244!! 747 ! a) b) c)

localizada no cromossomo 1 da galinha. As análises dessas mutações no locus NW_001471534.2 do gene da distrofina foram conduzidas mediante abordagem usada para o estudo da enzima málica NADP-dependente.

Para a identificação de sequências quimeras no locus da distrofina, foram conduzidas reações de amplificação pela tpTAIL-PCR, combinando primers de kDNA com os primers específicos para a sequência do gene da distrofina, como explicado para o gene da enzima málica. O procedimento gerou 16 sequências quimeras do gene da distrofina de 8 aves da Família 1. As sequências obtidas estão apresentadas no Anexo III. Em vários eventos de integração descritos neste estudo, o minicírculo de kDNA inserido no mesmo ponto do gene da distrofina apresentou região variável diferente.

A Figura 33 mostra dois eventos de integrações no genoma de uma ave, sendo que, em um deles, a sequência de kDNA aparentemente sofreu deleção. Nesse caso, o kDNA foi integrado no mesmo nucleotídeo da sequência da distrofina com 260 pb, mostrando E-value 6e-126 e identidade de 96%.

Figura 33. Diversidade de integrações de kDNA no gene da distrofina de uma mesma ave. Alinhamento das sequências EDG-44 e EDG-47, pertencentes à ave k1-224. A sequência de kDNA de EDG-47 parece ter surgido da deleção de parte da sequência de EDG-44. Verde: gene; azul: kDNA; amarelo: região de microhomologia. Na figura, apenas as concordâncias entre as sequências estão em destaque.

A análise in silico das sequências representadas na Figura 33 revela que a região variável que teria sido deletada apresentava forte grau de curvatura (Figura 34b e d). A Figura 34c mostra o perfil da sequência posterior à deleção. A análise Bend-it sugere o perfil de curvatura da sequência do gene no sítio de inserção do kDNA (Figura 34a).

Figura 34. Análise conformacional de sequências quimeras kDNA-distrofina. a) Pontos de tensões que geram curvaturas (linha vermelha) e os teores de C/G (linha verde) na sequência original da distrofina. Note a inserção a região de inserção do kDNA (círculo azul). b) Idem na sequência EDG 44 da ave k1-224, onde a região deletada (caixa) compunha a curvatura do DNA. c) Idem na sequência EDG77 da mesma ave, onde teria ocorrido deleção parcial do segmento do kDNA, resultando no desaparecimento da curvatura em b.!d) Imagem gerada a partir das curvaturas de b com o sítio de deleção (círculo). Em verde, gene; azul escuro, região conservada de kDNA; azul

claro, região variável de kDNA; amarelo, região de microhomologia. A sequência quimera analisada está representada no esquema abaixo do gráfico.

! !! !! a) b) c) #$ ! 398 Local de inserção de kDNA 1 6 2 0 ! ! 448 1!! 244! !! 661 ! 1 246 451

O alinhamento de sequências do parental e da progênie mostrou homologia de 250 pb da região variável de kDNA (Figura 35). Porém, o kDNA da progênie tinha a sequência mais longa que a encontrada no parental. A análise Blastn revelou homologia do kDNA integrado com E-value 2e-118 e identidade de 98%. Sequências de regiões variáveis idênticas (170 pb) também foram documentadas em aves F2 da Família 1, mostrando que houve a herança vertical (Mendeliana) da mutação (Figura 36). Neste caso, a região variável de kDNA foi identificada no banco de dados com grau de similaridade E-value 8e-52 e identidade 94%.

Figura 35. Herança de kDNA integrado no gene da distrofina. Alinhamento da sequência EDG24 da ave F0 k1-527 e da sequência EDG32 da ave F1 k1-202. Note a integração no mesmo nucleotídeo (transição da microhomologia em amarelo para o gene em verde), e a identidade quase perfeita nas sequências variáveis do kDNA (azul). As homologias estão coloridas.

Figura 36. Mutações similares no gene da distrofina em aves F2. Alinhamento das sequências EDG76 da ave k1-638 e EDG77 da ave k1-884 descendentes de parental F1 k1-202 e k1-207. Note que a integração ocorreu no mesmo ponto (base 999) do gene da distrofina (verde), e que a sequência variável do kDNA tem similaridade quase total (azul). Em amarelo, microhomologia.

Ao se comparar os dados obtidos aqui com as integrações na distrofina em células somáticas (Guimaro, 2012), viu-se que as sequências da Figura 36 também pareavam com aquela de origem somática do clone DG156 da ave k1-202 (Figura 37). Na sequência na célula somática, há evidência de hitchhiking (Guimaro, 2012), onde segmento de DNA de um segundo cromossomo hospedeiro aparece na cor vermelha.

Figura 37. Identificação de mutação similar em células germinativas e somáticas de aves congênicas. Alinhamento das sequências de gametas EDG-24 do parental F0 (galo k1-527) e da progênie F1 EDG-32 (galo k1-202) com a sequência oriunda de célula somática DG-156 do mesmo galo F1 k1-202. As regiões variáves de kDNA (azul) das três sequências são similares e estão integradas no mesmo ponto (base 999) do gene da distrofina (verde). A sequência DG156 da célula somática mostra segmento de outro cromossomo (vermelho) carreado com fragmento de kDNA mediante hitchhiking. Microhomologia em amarelo.

V. Discussão