Análises das integrações no locus da enzima málica mitocondrial NADP dependente.

A frequência de eventos de integração no locus NW_003763650.1 foi a mais alta do estudo (10,87%). Este locus tem os alelos que codificam a enzima málica mitocondrial NADP dependente, que catalisa a descarboxilação oxidativa do malato, gerando piruvato e CO2, com redução de NADP+ para NADPH, na presença de um

cátion bivalente (Mg2+ ou Mn2+). Conforme a especificidade do cofator e localização subcelular, são reconhecidas três isoformas de enzimas málicas: i) citosólica NADP+ dependente (c-NADP-ME ou ME1); ii) mitocondrial NAD(P)+ dependente (m-NAD-ME ou ME2); e, iii) mitocondrial NADP+ dependente (m-NADP-ME ou ME3) (Hsieh e cols, 2009).

Figura 24. Resultado de alinhamento de sequências de célula germinativa e somática com integração de minicírculo de kDNA com a mesma sequência. As sequências EG16 e MG266 da ave k1-527 mostram integrações em locus diferentes e com sequência de kDNA praticamente igual. A região correspondente ao kDNA começa e termina nos nucleotídeos indicados pelas setas.

A integração de minicírculos de kDNA ocorreu no locus NW_003763650.1 da enzima málica NADP-dependente mitocondrial ME3. O gene da ME3 da galinha (Gene ID: 419019, NCBI) é conservado em humanos, chipanzés, cães, camundongos, e outros. O gene cópia única está localizado no cromossomo 1. As análises do BLASTn indicaram que a integração do KDNA entrou na região de um íntron. A identificação da mutação no locus NW_003763650.1 em várias aves foi possível com a técnica tpTAIL-PCR, devido a combinação de primers de kDNA, com

primers específicos para sequência do gene ME3 do banco de dados NCBI. As

amplificações produziram 15 sequências com minicírculos integrados no gene da enzima málica, em oito aves da Família 1. As sequências estão apresentadas no Anexo II.

A PCR direta conduzida em DNA de ave negativa (sem contato com T. cruzi) com os primers específicos do gene revelou amplicons de até 1,7 kb. Quando essas sequências obtidas foram alinhadas, verifcou-se identidade quase completa com aquela do locus NW_003763650.1 (Figura 25) e com as quimeras neste sítio de integração. Entretanto, a análise por PCR feita em amostra de DNA de aves da Família 1 com primers S1 e aS1 específicos para NADPME não produziu sequência quimera.

A comparação do sítio de inserção original com a sequência quimera kDNA-DNA de galinha mostra algumas diferenças, principalmente na região de microhomologia (Figura 26). Essa análise revelou que a sequência no genoma hospedeiro correspondente à microhomologia não era idêntica àquela da região conservada do kDNA, porém, no sitio de junção pós-integração a sequência adquiriu padrão CSB1.

Figura 25. Sítio de integração do kDNA no locus NW_003763650.1, da enzima málica NADP- dependente mitocondrial. Alinhamento entre a sequência do banco de dados do NCBI e da sequência gerada a partir da PCR de um controle negativo (k1-2433). Os nucleotídeos discordantes estão em destaque. O kDNA se integrou no local indicado pela seta.

A tpTAIL-PCR conduzida com primers específicos para NADPME mostrou que as integrações ocorreram sempre na mesma posição (base 90092) no mesmo nucleotídeo. A análise in silico da estrutura da sequência original revelou que a inserção do kDNA ocorreu numa região de alça do DNA. O gráfico obtido com ajuda do programa Bend-it revela os pontos onde se formam as curvaturas (Figura 27).O alinhamento das sequências confirmou a diversidade dos minicírculos de kDNA integrado, na ave parental e nas progênies (Figura 28).!!

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

Figura 26. Região de microhomologia antes e depois da integração no locus NW_003763650.1. A linha de cima corresponde à sequência do controle negativo da Figura 25. A linha de baixo corresponde à região próxima à microhomologia do clone ENG 71 da ave k1-636. Azul, kDNA; verde, genoma da galinha; amarelo, microhomologia.

! 355

Local de inserção de

kDNA

1 862

Figura 27. Representação gráfica das tensões que geram curvaturas (linha vermelha) e capacidade de se dobrar (linha verde) na região original do sítio da enzima málica mitocondrial (representada abaixo do gráfico). Note que a inserção do kDNA (correspondente ao nucleotídeo 90092 do banco de Dados) se deu no ponto com uma alta curvatura (destaque em azul).

Ainda que houvesse grande diversidade de sequências de minicírculos integradas no genoma de aves, foi possível detectar minicírculos idênticos na F1 k1-207 e na sua progênie k1-603 integrados na mesma base da sequência do gene da enzima málica. Neste caso, a sequência paterna era 110 pb mais longa que a da progênie, mas parte da região variável do parental apresentava homologia de 180 pb com a da progênie (Figura 29). Essas sequências de kDNA foram reconhecidas no banco de dados com E-value de 6e-73, 95% de identidade. Com este achado, foi possível detectar a herança da mutação da ave F1 pela progênie F2.

Figura 28.Diferenças entre as sequências de kDNA integradas no gene da enzima málica em aves da mesma família. Alinhamento de três sequências pertencentes ao galo k1- 202 (ENG69), à galinha k1-224 (ENG16) e à sua cria k1-616 (ENG72). Note que a integração ocorreu no mesmo local do gene (verde), mas a região do kDNA é diferente nas três aves (azul). Em amarelo tem-se a região de microhomologia. Apenas as concordâncias entre as sequências estão em destaque.

Eventos de recombinação do kDNA foram encontrados nas sequências das aves k1-527 (F0), k1-202 (F1) e k1-636 (F2), conforme ilustrado na Figura 30. Esta figura sugere que a mutação de kDNA na ave k1-202 (F1) teria sido herdada da ave parental F0 k1-527 (aproximadamente 260 pb, incluindo região variável) e que a região variável teria sido parcialmente deletada (Figura 31). Em outro caso, a progênie (F2) k1-636 teria herdado a sequência variável do minicírculo de kDNA de seu progenitor (k1-202), mas na ave da geração F2 a região variável da sequência aparece duplicada. Não é possível afirmar se a duplicação ocorreu nas células do progenitor ou da progênie. A região de kDNA foi reconhecida no banco de dados e possuía E-value igual a 0.0 e identidade de 96%.

Figura 29. Herança de kDNA integrado no gene da enzima málica. Alinhamento da sequência da ave k1-207 (ENG11) e de sua descendência (ENG18). Note que a integração ocorreu no mesmo local do gene (verde), e que a região do kDNA é igual entre as aves (azul). Em amarelo, tem-se a região de microhomologia. Na Figura, apenas as concordâncias entre as sequências estão em destaque.

Figura 30. Recombinação do kDNA integrado entre diferentes gerações. A Figura mostra as sequências das aves k1-527(F0), k1-202 (F1) e k1- 636(F2), respectivamente. A integração ocorreu no mesmo ponto do locus NW_003763650.1 da enzima málica. Na sequência ENG69 (k1-202), parte da região variável foi herdada da ave k1-527 (ENG66), o restante da sequência de kDNA do parental aparentemente foi deletado na progênie (ver Figura 31) .A sequência ENG71 (k1-636, F2) mostra a mesma região variável da ave F1 k1-202 (ENG69), porém aparece duplicada. Azul escuro: região conservada; azul claro: região variável; gene: verde; amarelo: microhomologia; sublinhado: primers.

ENG 66: 963 bp ORIGIN

67rev