Análises de restrição seletiva em outras regiões do genoma

As mesmas análises de RSCU e de máxima verossimilhança com modelos de substituição de códons apontadas nos itens 1.1 e 1.2 foram efetuadas para outras doze regiões gênicas considerando C. hominivorax e espécies de Drosophila. Essas regiões foram escolhidas a partir da anotação funcional do transcriptoma de C. hominivorax (Carvalho et al., 2010) com o programa Blast2GO (Conesa et al., 2005), selecionando sequências com mais de 100 pb, E-values mínimos menores que 1e−5 e presença de ortólogos conhecidos (Anexo 3).

28 2. Investigação de seleção positiva sobre as substituições não-sinônimas

O DNA genômico de um indivíduo de C. hominivorax, um de Cochliomyia macellaria e um de Chrysomya megacephala foi extraído pelo método de fenol- clorofórmio, adaptado para tubos de microcentrífuga (Lyra et al., 2009), e o pellet ressuspendido em 100 µl de tampão TE e armazenado a -20°C. A região que abrange os dois éxons (E3 e E4), que possuem as mutações Gly137Asp e Trp251Leu no gene da carboxilesterase E3, foi amplificada usando os oligonucleotídeos 7F1a (5'- GGCTCCAGAAACTAAACG-3'), 7R3a e RN2 (Carvalho et al., 2006). A amplificação do fragmento, verificação em gel de agarose 1%, purificação, sequenciamento, análise dos cromatogramas e montagem dos contigs foram realizados como descrito no Capítulo 1. Sequências de DNA dessa região da carboxilesterase de outros Muscomorpha disponíveis no GenBank e no Flybase foram obtidas: L. cuprina (U56636.1), Lucilia sericata (AY691501.1), M. domestica (AF133341.1), Haematobia irritans (AF139082.1), D. melanogaster (CG1112), D. simulans (GD19475), D. sechellia (GM10474), D. erecta (GG25127), D. persimilis (GL12171), D. ananassae (GF17298), D. yakuba (GE25784), D. virilis (GJ10232), D. mojavensis (GI23478), D. willistoni (GK11077), D. grimshawi (GH19269), D. pseudoobscura (GA10768) e Ceratitis capitata (EU130782.1), esta última utilizada como grupo externo nas reconstruções filogenéticas.

As sequências obtidas dos éxons de C. hominivorax, C. macellaria e C. megacephala e as dos táxons mais distantes obtidas nos bancos de dados foram traduzidas a fim de realizar o alinhamento dos aminoácidos no Muscle (Edgar, 2004), o qual serviu como referência para corrigir o alinhamento das sequências de nucleotídeos. Testes de recombinação foram feitos a fim de verificar a presença de possíveis sequências

29 recombinantes, devido à sua influência nas inferências filogenéticas (Schierup & Hein, 2000). Os testes utilizados foram MaxChi (Maynard, 1992), Geneconv (Padidam et al., 1999) e RDP (Martin & Rybicki, 2000), disponíveis no programa RDP4.16 (Heath et al., 2006).

As relações filogenéticas das sequências dos éxons foram reconstruídas por máxima verossimilhança usando o programa Phyml 3.0 (Guindon & Gascuel, 2003) e através do modelo bayesiano implementado no programa MrBayes 3.1 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). O modelo ótimo de substituição nucleotídica SYM+I+G foi selecionado nos programas jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008; Guindon & Gascuel, 2003) e mrAIC (Nylander, 2004), considerando os critérios de informação de Akaike (AIC), Akaike corrigido (AICc) e Bayesiano (BIC). A árvore de máxima verossimilhança foi construída a partir de cinco árvores randômicas iniciais, com o operador de busca de topologia de árvores BEST e suporte dos ramos dado através do bootstrap (número de replicatas = 1.000). A árvore de inferência bayesiana foi construída a partir de duas análises independentes, por 100.000 gerações, com amostragem dos parâmetros e das árvores a cada 100 gerações. Após a convergência das cadeias foi realizado o descarte das 25% primeiras árvores amostradas e a construção da árvore consenso, cujos suportes de ramos são dados pelas suas probabilidades posteriores.

A partir das árvores filogenéticas obtidas, as pressões seletivas que modelaram a evolução do fragmento do gene E3 foram investigadas usando o software Codeml, implementado no programa Paml 4.6 (Yang, 2007). Foram usados os testes branch-site relaxado e branch-site estrito (Yang & Nielsen, 2002; Zhang et al., 2005), que levam em conta a taxa de substituições não-sinônimas/sinônimas (dN/dS=ω). A fim de verificar se as estimativas de ω não estavam enviesadas por conta de um excesso de substituições

30 sinônimas, foi realizado um teste de saturação das substituições sinônimas e não-sinônimas plotando a relação entre o número de diferenças sinônimas pelo número de sítios sinônimos (pS) e a relação entre o número de diferenças não-sinônimas pelo número de sítios não- sinônimos (pN) contra a distância genética entre pares de taxa (Anexo 6). Os valores de pS, pN e distância entre as sequências foram calculados pelo método Nei-Gojobori (Nei & Gojobori, 1986), com uma taxa de transição/transversão de 1,5 no programa Mega 5.0 (Tamura et al., 2011).

Para os testes branch-site, foram definidos dois tipos de ramos: ramos de primeiro plano, em que foi testada a hipótese de seleção positiva, e ramos de fundo. Foram considerados cinco diferentes ramos de primeiro plano: (a) apenas o ramo de C. hominivorax; (b) o ramo que dá origem a C. hominivorax e C. macellaria; (c) o ramo que dá origem ao grupo que contém C. hominivorax, C. macellaria e C. megacephala; (d) o ramo dos califorídeos (C. hominivorax, C. macellaria, C. megacephala, L. cuprina e L. sericata) e (e) o ramo que dá origem ao grupo califorídeos + M. domestica. Os ramos de primeiro plano foram então contrastados com os ramos de fundo, constituídos pelas linhagens de Drosophila e demais espécies que não foram incluídas nos ramos de primeiro plano.

Tanto o teste branch-site relaxado como o teste branch-site estrito usam o modelo MA como modelo alternativo. Neste modelo é permitido que os códons nos ramos de primeiro plano tenham ω > 1, enquanto os códons nos ramos de fundo apresentam valores ω ≤ 1. O modelo nulo do teste branch-site relaxado, denominado M1a, assume as mesmas taxas de evolução para todos os sítios e ramos, com 0 < ω ≤ 1. Já o modelo nulo do teste branch-site estrito, denominado MA restrito, fixa a categoria ω > 1 em 1, forçando todos os códons com ω > 1 a evoluir de forma neutra (ω = 1). Um valor de verossimilhança é

31 associado a cada modelo e um teste log da razão de verossimilhança (LRT) significativo desses valores, verificado por um teste qui-quadrado, indica seleção positiva ou seleção purificadora relaxada, no caso do primeiro teste (M1a X MA), e seleção positiva, no caso do segundo teste (MA relaxado X MA). Devido aos múltiplos testes com o mesmo conjunto de dados, foi feita a correção de Bonferroni para os níveis de significância. Uma vez detectado um ramo com sinal de seleção positiva, o método Bayes empirical Bayes (BEB) (Yang et al., 2005) foi utilizado para estimar que sítios estavam sob a influência da seleção positiva, considerando probabilidade posterior maior que 95%.

A seleção positiva também foi investigada através do método MM01 de McClellan et al. (2005), com o programa TreeSAAP 3.2 (McClellan & McCracken, 2001; Woolley et al., 2003; McClellan et al., 2005), que avalia se as substituições não-sinônimas favorecem ou não mudanças estruturais ou funcionais na proteína. As mudanças nas propriedades físico-químicas devido a cada substituição não-sinônima são consideradas, criando uma escala que vai de substituições conservadoras a muito radicais (McClellan et al., 2005). McClellan et al. (2005) definiram seleção estabilizadora como aquela que tende a manter os atributos bioquímicos originais da proteína e seleção desestabilizadora como aquela que favorece mudanças estruturais e funcionais em uma região da proteína. Inicialmente a análise foi feita com base no comprimento total das sequências para detectar quais propriedades físico-químicas apresentam sinais de seleção positiva, com a significância estatística dada pelos valores de escore-z (escore padrão). Uma vez apontadas as propriedades dos aminoácidos que mostraram mudanças significativas, foi realizada uma análise de janela deslizante, de 20 aminoácidos de comprimento, para verificar quais regiões específicas foram afetadas por seleção positiva desestabilizadora, que representaria uma evidência de adaptação molecular.

32 Resultados e Discussão

1. Investigação de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas

As sequências de cDNA obtidas nos bancos de dados apresentaram um tamanho de 1545 pb após a edição do alinhamento.

A análise de composição nucleotídica para as 16 espécies consideradas mostrou uma porcentagem de conteúdo GC que variou de 36,87 a 55, 81%, sendo que a terceira posição dos códons nas espécies de drosofilídeos apresentou uma porcentagem mais elevada (>58%), com exceção de D. willistoni. (Tabela 1).

O número efetivo de códons (NEC) é um índice usado para inferir um viés de uso de códons sem a necessidade de utilizar dados de genes de referência. Os valores do NEC variam de 20, em que um códon é exclusivamente usado para cada aminoácido, a 61, em que o uso dos códons sinônimos é igualmente provável (Wright, 1990). Na Tabela 1 pode- se notar que os valores de NEC são um pouco menores que 61, de modo que em C. hominivorax e L. cuprina estes valores são os menores, indicando que nestas espécies há uma preferência um pouco maior por alguns códons em relação às demais espécies. Porém, de forma geral, a especificidade não é demasiado alta.

33

Tabela 1. Composição nucleotídica de 16 espécies de Diptera, considerando a porcentagem de

códons raros, a porcentagem de conteúdo GC total, a porcentagem de conteúdo GC nas primeira, segunda e terceira posições dos códons e o número efetivo de códons (NEC).

% códons raros % G+C % GC 1a posição % GC 2a posição % GC 3a posição NEC C. hominivorax 2,977 36.87 47.08 35.58 27.96 40.65 L. cuprina 2,478 39.47 47.43 35.58 35.40 42.02 M. domestica 2,301 44.54 47.79 36.64 49.20 47.99 H. irritans 2,478 39.00 45.13 36.99 34.87 47.18 C. capitata 1,93 43.66 52.39 40.35 38.23 53.73 D. virilis 1,926 52.15 56.28 39.29 60.88 48.51 D. mojavensis 2,452 55.81 56.11 39.82 71.50 44.15 D. grimshawi 1,751 51.15 53.98 39.65 59.82 50.58 D. simulans 1,396 51.68 54.16 37.35 63.54 53.02 D. sechellia 1,396 52.21 53.81 36.99 65.84 51.73 D. melanogaster 1,396 52.51 54.51 36.99 66.02 50.46 D. erecta 0,698 52.63 55.04 36.64 66.19 51.08 D. ananassae 1,222 50.32 54.69 38.23 58.05 53.71 D. persimilis 2,618 52.39 55.58 38.58 63.01 48.36 D. pseudoobscura 3,053 52.00 55.04 39.15 61.82 49.42 D. willistoni 1,222 43.78 50.97 38.23 42.12 52.52

Para investigar melhor esse viés no uso de códons e detectar quais códons são preferencialmente utilizados em cada espécie, os valores de uso relativo de códons sinônimos (RSCU) de cada sequência foram plotados em um mapa de agrupamento por correlação (Figura 5). O índice RSCU, desenvolvido por Sharp & Li (1986), é dado pela razão entre a frequência observada do uso de códons e a frequência esperada considerando que todos os códons são igualmente utilizados (neutralidade). Valores de RSCU acima de 1 representam códons que são usados com uma frequência maior que a esperada, de modo que quanto maior o seu valor, mais abundante é o códon na sequência. Os valores de RSCU para cada códon na sequência da carboxilesterase E3 das 16 espécies estudadas evidenciam um padrão geral de uso de códons diferente entre as espécies de Drosophila e as demais espécies consideradas. Novamente, a espécie D. willistoni difere das outras espécies de

34 Drosophila no sentido de não apresentar um viés muito evidente no uso de códons, mais próximo do padrão observado para as espécies não pertencentes ao gênero Drosophila. Esse padrão diferenciado de D. willistoni em relação as demais espécies de Drosophila já foi evidenciado por Vicario et al. (2007) em um abrangente estudo sobre o viés de uso de códons nos 12 genomas de Drosophila, no qual analisaram mais de 6000 genes ortólogos.

No caso das espécies de Drosophila, excluindo D. willistoni, há uma relação entre os códons mais abundantes e a presença de uma citosina na terceira posição do códon no caso dos aminoácidos degenerados four-fold e six-fold (evidenciados por asteriscos azuis e vermelhos na Figura 5), característica essa já observada anteriormente para Drosophila (Vicario et al.,2007).

Figura 5. Mapa de agrupamento por correlação dos valores de RSCU de cada códon das sequências

da carboxilesterase E3 para cada uma das 16 espécies. Códons com os maiores valores de RSCU aparecem em cores de preto a vermelho. Asteriscos azuis e vermelhos indicam os códons associados a aminoácidos degenerados four-fold e six-fold, respectivamente.

35 Uma análise comparativa do uso de códons em genomas de 22 espécies de Diptera e Hymenoptera mostrou uma preferência de códons com conteúdo G ou C na terceira posição no caso dos Diptera, enquanto em Hymenoptera há uma preferência por códons terminados em A ou T (Behura & Severson, 2012). Assim, observando os valores de RSCU no caso do gene da carboxilesterase E3, verifica-se que as espécies que não pertencem ao gênero Drosophila apresentam um padrão de uso de códons mais próximo do observado para as espécies de Hymenoptera, com preferência pelo uso de códons com A ou T na terceira posição.

Com a disponibilidade cada vez maior de genomas para diferentes espécies, as análises do uso de viés de códon têm sido cada vez mais amplas. Um exemplo disto é a comparação dos valores de RSCU dos genomas das três espécies de mosquitos Anopheles gambiae (Holt et al., 2002), Aedes aegypti (Nene et al., 2007) e Culex quinquefasciatus (Arensburger et al., 2010), que mostrou que em torno de metade dos códons tem um viés maior de uso em A. gambiae, enquanto a outra metade tem um viés maior nas outras duas espécies (Behura & Severson, 2013).

Behura & Severson (2013) fizeram uma revisão sobre os trabalhos que buscam investigar o viés do uso de códons, discutindo acerca dos diversos fatores que podem contribuir para a sua evolução, como o nível de expressão gênica, o conteúdo GC da sequência, a estabilidade do RNA mensageiro, o tamanho do gene, estresse ambiental, entre outros. Como a análise feita no presente trabalho foi descritiva com relação à composição nucleotídica de apenas alguns genes codificadores de proteínas, uma vez que o genoma de C. hominivorax ainda não foi obtido com boa cobertura e qualidade, é difícil associar a diferença no padrão de uso de códons observado entre os drosofilídeos e as demais espécies com algum fator evolutivo.

36 Os testes de recombinação detectaram um fragmento de sequência recombinante em H. irritans, o que poderia interferir nas inferências filogenéticas. Portanto, essa sequência foi excluída das análises seguintes. O teste de verossimilhança entre os modelos de mutação-seleção foi estatisticamente significativo (Tabela 2), indicando que apenas um viés mutacional não é suficiente para explicar as substituições sinônimas observadas, mas a seleção deve ter um papel importante na sua evolução.

O teste log da razão de verossimilhança entre os modelos FMutSel e FMutSel0 foi feito considerando o modelo M0, em que assume-se apenas uma categoria de ω. No modelo FMutSel, os 61 códons do código genético universal têm seus valores adaptativos estimados, enquanto no modelo nulo FMutSel0, os códons sinônimos são considerados como tendo o mesmo valor adaptativo e as diferenças nas frequências de uso de cada um deles se dão por causa do viés mutacional. Dessa maneira, através do teste de verossimilhança testa-se a hipótese nula de que o uso de códons é devido apenas a um viés mutacional.

37

Tabela 2. Resultado do teste de mutação-seleção para inferir restrição seletiva sobre as

substituições sinônimas. np: número de parâmetros; ln: valor de verossimilhança; LRT: teste log da razão de verossimilhança; p-valor: significância do LRT; gl: graus de liberdade.

Modelo np ln LRT p-valor (gl) FMutSel-M0 92 -12439,027120 424,0368 0,000 (df=41) FMutSel0-M0 51 -12651,045514

Os resultados das análises de composição nucleotídica e do teste dos modelos de mutação-seleção indicam, portanto, que deve ter ocorrido uma restrição seletiva sob as substituições sinônimas nas sequências da carboxilesterase E3 nas espécies consideradas.

Porém, o padrão observado de uso de códons nestas sequências pode não ser exclusivo deste gene, mas ser um padrão comum ao genoma. Com o objetivo de discernir entre estes dois cenários, outras 12 regiões do transcriptoma de C. hominivorax foram escolhidas e alinhadas com seus ortólogos nas espécies de Drosophila. Os valores de RSCU foram agrupados graficamente considerando a mesma sequência de códons da Figura 5 (Anexo 7). Por comparação visual entre os mapas de agrupamento destas 12 regiões e o mapa de agrupamento da carboxilesterase E3 é possível verificar uma repetição do padrão do uso de códons na maioria dos casos. Os testes dos modelos mutação-seleção foram significativos para todas as regiões analisadas, exceto para a região 8 (Anexo 8). Assim, pode-se concluir que os indícios de restrição seletiva observados para o gene da carboxilesterase E3 parecem ser comuns ao genoma como um todo, e não uma exclusividade deste gene.

38 2. Investigação de seleção positiva sobre as substituições não-sinônimas

As sequências obtidas para as espécies C. hominivorax, C. macellaria e C. megacephala apresentaram um tamanho de 495 pb após a edição, sendo 123 pb do éxon E3, 63 pb do íntron I3 e 309 pb do éxon E4. A região compreendida pelo íntron I3 foi excluída das análises, por não fazer parte da região codificante. O alinhamento destas sequências dos éxons E3 e E4 com as sequências ortólogas dos outros Muscomorpha apresentou um tamanho final de 435 pb (Anexo 4).

Os métodos de detecção de recombinação indicaram novamente que a sequência de H. irritans possui um fragmento recombinante, tendo sido excluída das análises posteriores. As árvores construídas por máxima verossimilhança e inferência bayesiana apresentaram a mesma topologia e altos valores de suporte de ramos (Anexo 5) e, assim, os testes branch- site foram feitos com base na árvore de máxima verossimilhança e os seus valores estimados de comprimento de ramo. Para ambos os testes branch-site, relaxado e estrito, foram detectados sinais de seleção positiva apenas quando o ramo que inclui M. domestica e os califorídeos foi considerado como ramo de primeiro plano (Figura 6).

O resultado do teste de saturação (Anexo 6) mostrou que a partir de uma distância evolutiva de 0,2 substituições nucleotídicas por sítio começa a haver saturação das substituições sinônimas. A saturação das substituições sinônimas leva a subestimar os valores de dS e, consequentemente, a superestimar os valores de ω (dN/dS). Como os ramos de primeiro plano nas análises branch-site apresentam distâncias menores que 0,2, não há viés devido à saturação das substituições sinônimas. Gharib & Robinson-Rechavi (2013) mostraram que os testes branch-site são considerados robustos mesmo quando

39 utilizados dados muito divergentes, sendo que o teste perde ~50% do poder quando as substituições sinônimas apresentam uma taxa elevada (dS > 0,4).

Figura 6. Árvore filogenética construída por Máxima Verossimilhança, utilizada para os testes

branch-site. Os asteriscos (vermelho e azul) indicam os cinco ramos de primeiro plano testados. O asterisco em vermelho indica o único ramo de primeiro plano que apresentou sinais de seleção positiva. Os comprimentos de ramos são apresentados como substituições nucleotídicas por sítio.

Os parâmetros estimados para os modelos nulos M1a e MA restrito e para o modelo alternativo MA, considerando o ramo indicado na Figura 6 com um asterisco vermelho como sendo o ramo de primeiro plano, são apresentados na Tabela 3.

40

Tabela 3. Parâmetros estimados e valores do logaritmo de máxima verossimilhança (lnL) para os

modelos M1a, MA restrito e MA.

Modelo Parâmetros lnL

Modelo nulo M1a ω0 = 0,043 ω1 = 1 -3607,761 p0 = 0,990 p1 = 0,010

Modelo nulo MA restrito ω0 = 0,042 ω1 = 1 ω2a = 1 ω2b = 1 -3602,465 p0 = 0,918 p1 = 0,010 p2a + p2b= 0,072

Modelo alternativo MA ω0 = 0,045 ω1 = 1 ω2a = 999 ω2b = 999 -3596,382 p0 = 0, 940 p1 = 0, 012 p2a + p2b= 0,048

A comparação entre os valores dos logaritmos de máxima verossimilhança entre os modelos M1a e MA (2 graus de liberdade) resultou em um LRT igual a 22,756, que foi significativo (p < 0,01). Isso indica que alguns sítios do ramo de primeiro plano testado evoluíram por seleção positiva ou por seleção purificadora relaxada. Para discernir entre essas duas hipóteses, foram contrastados os modelos MA restrito e MA (1 grau de liberdade), cuja comparação dos valores dos logaritmos de máxima verossimilhança resultou em um LRT significativo (p < 0,01) de 12,165, indicando assim que os sítios detectados no teste anterior estariam evoluindo por seleção positiva.

O método Bayes Empirical Bayes detectou três sítios evoluindo sob pressão de seleção positiva, com probabilidade posterior maior que 95%: códons 3, 49 e 82 (Figura 7). Estes três códons não coincidem com nenhuma das duas mutações Gly173Asp e Trp251Leu (ou Trp251Ser) associadas à resistência a organofosforados, que estão localizadas nas posições 8 e 122, respectivamente. Os três códons com sinal de seleção positiva também não coincidem com nenhum dos resíduos da catalytic triad e do oxyanion

41 hole, que compõem o sítio ativo da enzima, e também com nenhum dos resíduos altamente conservados descritos para 29 carboxil/colinesterases (Cygler et al., 1993).

Figura 7. Resultados do teste Bayes Empirical Bayes, indicando as probabilidades a posteriori dos

códons do ramo de primeiro plano estarem evoluindo sob seleção purificadora (0< ω < 1), evolução neutra (ω = 1) e seleção positiva (ω > 1). Os códons 3, 49 e 82, detectados com sinais de seleção positiva (probabilidade > 0,95), estão indicados pelos asteriscos.

Apesar dos códons 3, 49 e 82 estarem sob seleção positiva no ramo “califorídeos + M. domestica” de acordo com os modelos de substituição de códons e por inferência bayesiana, as substituições não-sinônimas detectadas com ω > 1 não necessariamente acarretam em uma mudança considerável na função da proteína. Isso porque um aminoácido pode ter sido substituído por outro com propriedades físico-químicas semelhantes, o que indicaria um processo de seleção purificadora ao invés de seleção positiva.

42 Para confirmar os sinais de seleção previamente detectados, foi realizada uma análise que considera as mudanças nas propriedades físico-químicas dos aminoácidos devido a cada substituição não-sinônima observada.

Quando consideradas 8 categorias de substituição, o método MM01 (McClellan et al., 2005) detectou escores z positivos e significativos para mudanças radicais (categorias 6 a 8), indicando assim seleção positiva desestabilizadora, para duas propriedades físico- químicas: Capacidade de estar na extremidade carboxi de uma alpha-hélice e Constante de equilíbrio (ionização do COOH). A análise por janela deslizante (tamanho = 20 códons) mostrou que os aminoácidos que apresentam sinais de seleção positiva para a primeira propriedade estão localizados na porção mais central da região estudada, enquanto para a segunda propriedade estão localizados principalmente na porção 5’ (Figura 8). Esses sinais de seleção positiva são concordantes com duas da três substituições detectadas pelos modelos de substituição de códons: o códon 3 apresentou mudanças radicais para a propriedade “Constante de equilíbro (ionização do COOH)”, enquanto o códon 82 apresentou mudanças radicais para a propriedade “Capacidade de estar na extremidade carboxi de uma alpha-hélice”.

43 A)

B)

Figura 8. Análise por janela deslizante das propriedades físico-químicas que apresentaram valores

positivos e significativos. A) Capacidade de estar na extremidade carboxi de uma alpha-hélice e B) Constante de equilíbrio (ionização do COOH). A linha tracejada representa o limite de significância de 0,001.

Apesar da detecção de sítios que estariam sob seleção positiva com base nas propriedades dos aminoácidos apresentada acima, McClellan e Ellison (2010) sugerem a utilização de um número menor de categorias para evitar a detecção de falsos positivos. Assim, as análises com base nas mudanças das propriedades físico-químicas dos