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LUANA WALRAVENS BERGAMO
EVOLUÇÃO DO GENE DA ESTERASE E3: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS
DA SELEÇÃO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DE MUTAÇÕES
ASSOCIADAS À RESISTÊNCIA A INSETICIDAS EM Cochliomyia
hominivorax (DIPTERA: CALLIPHORIDAE)
Campinas
2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Bergamo, Luana Walravens,
B452e BerEvolução do gene da esterase E3 : avaliação dos efeitos da seleção e distribuição geográfica de mutações associadas à resistência a inseticidas em Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) / Luana Walravens Bergamo. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
BerOrientador: Ana Maria Lima de Azeredo Espin. BerCoorientador: Pablo Fresia Coronel.
BerDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Ber1. Cochliomyia hominivorax. 2. Miíase. 3. Resistência a inseticidas. 4. Seleção positiva. 5. Estrutura genética. I. Azeredo-Espin, Ana Maria Lima de,1955-. II. Coronel, Pablo Fresia. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Esterase E3 gene evolution : selection effects and geographic distribution of mutations associated to insecticide resistance in Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) Palavras-chave em inglês: Cochliomyia hominivorax Myiasis Insecticide resistance Positive selection Genetic structure
Área de concentração: Genética Animal e Evolução Titulação: Mestra em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Ana Maria Lima de Azeredo-Espin [Orientador] Iderval da Silva Júnior Sobrinho
Karina Lucas da Silva Brandão Data de defesa: 25-03-2014
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
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vii RESUMO
A pecuária é uma importante atividade econômica do Brasil, mas tem sofrido perdas significativas devido ao impacto de parasitas. Neste cenário destaca-se a mosca-da-bicheira, Cochliomyia hominivorax, que é um importante ectoparasita causador de miíase primária e endêmico das Américas. Sua distribuição geográfica sofreu redução a partir da implementação da técnica do inseto estéril (SIT), sendo considerada erradicada nos Estados Unidos e países continentais da América Central. Na América do Sul, o controle desta espécie é realizado através de inseticidas, cujo uso indiscriminado pode acarretar na seleção de indivíduos resistentes. Em estudos anteriores, as mutações denominadas Gly137Asp e Trp251Leu foram observadas no sítio ativo da enzima carboxilesterase E3 e associadas à resistência a inseticidas dietil e dimetil-organofosforados, respectivamente. A caracterização molecular da região desse gene que compreende desde o final do éxon 2 até o final do éxon 4 para C. hominivorax revelou que o íntron I2 apresenta um tamanho maior que em outras espécies de Muscomorpha. A análise da composição nucleotídica e comparações por métodos estatísticos entre modelos de mutação-seleção de sequências do cDNA da carboxilesterase E3 de C. hominivorax e outros Muscomorpha mostraram sinais de seleção restritiva sobre as substituições sinônimas. Porém, o padrão observado não é exclusivo deste gene, sendo observado em outras regiões do transcriptoma. As pressões seletivas que modelaram a evolução do gene E3 do ponto de vista das mutações não-sinônimas foram investigadas a partir de uma estratégia hierárquica, considerando dados interespecíficos e populacionais. Primeiramente, na investigação de resposta à longo prazo, foram utilizadas as sequências dos éxons das espécies C. hominivorax, Cochliomyia macellaria, Chrysomya megacephala e sequências públicas de outros Muscomorpha. Os testes branch-site relaxado e branch-site estrito, em conjunto com o método Bayes Empirical Bayes (BEB), não indicaram sítios sob seleção positiva no ramo de C. hominivorax. A análise pelo método MM01, que leva em conta as propriedades físico-químicas dos aminoácidos, também não detectou nenhum sinal de seleção. Já na investigação com base em dados populacionais, amostras de C. hominivorax de 21 localidades da América do Sul foram sequenciadas para um fragmento do gene E3, previamente caracterizado. Os resultados da AMOVA e Fst-par-a-par indicam que há estruturação entre as localidades quando consideradas as sequências do gene E3 juntamente
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com sequências dos genes mitocondriais CR, COI e COII. Porém, os resultados da SAMOVA mostraram uma baixa correlação entre os dados genéticos e geográficos, indicando que esta espécie apresenta uma complexa estrutura populacional. Através do DAPC foi possível distinguir três grupos genéticos entre as localidades. Testes de desequilíbrio de ligação foram significativos entre as duas mutações que são relacionadas à resistência a inseticidas organofosforados, indicando uma associação negativa entre elas. Uma análise baseada na detecção de locos outliers recuperou um dos sítios do primeiro códon associado à resistência com sinal de seleção positiva.
Palavras-chave: Cochliomyia hominivorax, miíase, resistência a inseticidas, seleção positiva, estrutura genética.
ix ABSTRACT
Livestock production is an important economic activity in Brazil, but has been suffering significant losses due to the impact of parasites. The New World screwworm fly (NWS), Cochliomyia hominivorax, is an important ectoparasite and myiasis causing fly endemic from the Americas, which stands out in this scenario. The geographic distribution of NWS has been reduced after the implementation of the sterile insect technique (SIT), being considered eradicated in North and part of Central America. In South America, NWS is controlled by chemical insecticides, which indiscriminate use can cause the selection of resistant individuals. Previous studies associated the Gly137Asp and Trp251Leu mutations in the active site of carboxylesterase E3 to resistance of diethyl and dimethyl organophosphates, respectively. The molecular characterization of this gene region comprising from the end of exon 2 to the end of exon 4 for C. hominivorax revealed that the intron I2 has a larger size than in other Muscomorpha species. The analysis of nucleotide composition and the comparisons between mutation-selection models by statistical methods of cDNA sequences of carboxylesterase E3 from C. hominivorax and other Muscomorpha showed signs of restrictive selection on synonymous substitutions. However, the observed pattern is not exclusive for this gene, being observed in other regions of the transcriptome. The selective pressures that have shaped E3 gene evolution from the point of view of non-synonymous mutations were investigated from a hierarchical strategy, considering interspecific and populational data. At first, in the investigation of long term response, the sequences of exons of C. hominivorax, Cochliomyia macellaria, Chrysomya megacephala and public sequences from other Muscomorpha were used. The relaxed branch-site and strict branch-site tests, together with the Bayes Empirical Bayes (BEB) method, indicated no sites under positive selection in the C. hominivorax branch. The analysis by MM01 method, which takes into account the physicochemical properties of amino acids, also detected no sign of selection. Secondly, in the investigation based on populational data, samples of C. hominivorax from 21 sites in South America were sequenced for a fragment of E3 gene previously characterized. The results of AMOVA and pairwise Fst indicate that there is structure between sites when considering sequences of E3 gene and CR, COI and COII mitochondrial genes. However, SAMOVA results showed a
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low correlation between genetic and geographic data, indicating that this specie has a complex population structure. Three genetic groups were distinguished between the sites by DAPC. Linkage disequilibrium tests were significant between the two mutations related to organophosphate insecticides resistance, indicating a negative association between them. An analysis based on outlier loci detection recovered sign of positive selection in one of the sites from the first codon associated with resistance.
Key Words: Cochliomyia hominivorax, myiasis, insecticide resistance, positive selection, genetic structure.
xi SUMÁRIO
Dedicatória ... xiii
Agradecimentos ... xv
Lista de Ilustrações ... xix
Lista de Tabelas ... xxi
Lista de Abreviaturas e Siglas ... xxiii
Introdução ... 1 Objetivos ... 11 CAPÍTULO 1 ... 13 Material e Métodos ... 15 Resultados e Discussão ... 17 CAPÍTULO 2 ... 23 Material e Métodos ... 25
1. Investigação de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas ... 25
1.1.Composição nucleotídica e viés no uso de códons ... 26
1.2. Análises de máxima verossimilhança com modelos de substituição de códons...26
1.3. Análises de restrição seletiva em outras regiões do genoma...27
2. Investigação de seleção positiva sobre as substituições não-sinônimas ... 28
Resultados e Discussão ... 32
1. Investigação de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas ... 32
xii CAPÍTULO 3 ... 45 Material e Métodos ... 47 Resultados e Discussão ... 52 Conclusões Gerais ... 73 Referências ... 77 Anexos ... 89
xiii DEDICATÓRIA
“Cellophane flowers of yellow and green Towering over your head Look for the girl with the sun in her eyes And she's gone Lucy in the sky with Diamonds” Beatles (1967)
xv AGRADECIMENTOS
Agradeço à querida professora Ana Maria pela orientação no mestrado, pela confiança, pelas conversas dentro e fora do laboratório, pelo carinho e pelo apoio. Por ter me ensinado a lidar com os contratempos que podem surgir ao longo da pesquisa. Por ter me dado a oportunidade de me apaixonar pela pesquisa e o ensino.
Agradeço ao Pablo pela co-orientação, sempre com muito entusiasmo e calma. Pela paciência em responder e-mails gigantes com dúvidas e resultados, pelas reuniões, pelas discussões dos problemas e por me ajudar a aprender a ser uma boa cientista.
Agradeço aos amigos do Laboratório de Genética e Evolução Animal (LabGEA), atuais ou anteriores, que sempre tornaram o laboratório um lugar muito agradável: Ana Carolina, Alberto, Felipe, Gabriel, Gisele, Marco Antonio (Palocci), Rogério e Thiago. Nesse grupo também se incluem Luiza e Eduardo, que preferem as borboletas ao invés de moscas. À Rosângela (Ro) por toda ajuda e disposição na hora de resolver os problemas de bancada. Indiscutivelmente, esse projeto não seria o mesmo sem a sua ajuda.
À Salete, a “mãe” das moscas da criação e famosa pelo seu café.
À querida Ana Claudia Lessinger pela ajuda no começo do mestrado, me ajudando a trilhar meu caminho de maneira mais estratégica. E é claro que também sou grata a todas as suas visitas ao laboratório, sempre com várias gostosuras para nos deliciarmos.
À Mari pelo apoio em algumas etapas do projeto, sempre agregando conhecimento e informações novas.
Em especial agradeço ao meu grande amigo e “irmão” Daniel, que me acompanhou em todos os momentos ao longo destes anos. Obrigada pelo compartilhamento e discussões de idéias, tanto no laboratório, quanto na república e no bar. Seu entusiasmo com a ciência e a fascinação pelo mundo da biologia sempre me serviram (e servirão) de exemplo.
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Agradeço aos amigos do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) pelos momentos de discussão, compartilhamento de angústias, cafés, momentos filosóficos e de descontração: Bruna, Camila, Thiago, Letícia, Lucas, Léo, Guilherme, Renato, Pedro, Bruno, Laura, Fúlvia e Natália.
Agradeço à minha família, por todo o suporte e amor.
Aos meus pais, Lúcia e Luis Claudio, que sempre me apoiaram em todas as minhas decisões, às vezes mesmo não compreendendo muito bem, e sempre me inspiraram como exemplo de vida.
À minha irmã Luciana (in memoriam) pelas risadas, brigas, conversas, festas, amor e tudo mais que só um irmão pode proporcionar. E por me mostrar o quão a vida é bela, apesar de frágil, e que devemos aproveitá-la ao máximo.
Aos meus avós Mercedes, Bortholo, Antônio e Teresa, exemplos de garra e perseverança.
Agradeço aos amigos de república pela vivência e trocas de experiência: Flávia, Lívia, Hulk, Javier e Raoni.
Agradeço ao treinador e às meninas do time de vôlei da Liga das Atléticas da Unicamp (LAU) pela adrenalina dos jogos e muitas risadas juntos: Jonas, Priscila, Mari, Isabelle, Luiza, Thaiza, Rani, Nayara, Carol, Luciana, Carol Dal Pozzo, Carol Xavier, Rosi, Tati, Julia, Mônica, Thais, Natasha e Fer. Além também dos nossos agregados Eder, Léo, Lucas e Alexandre.
Agradeço às minhas amigas de Holambra, Diana, Mariella, Ellen, Muriel, Helena e Thaís, pelas conversas e risadas de final de semana na Casa Bela.
Agradeço aos meus amigos de São Carlos que, mesmo com a distância, se mantêm presentes: Renata, Bruna, Luciene, Nhonho, Popinho, Juliana, Naná, Caíto, Juliana e Juliano.
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Agradeço à Tânia e à Sandra, da secretaria do CBMEG, e à Lourdes e demais membros da secretaria da pós-graduação pelas ajudas com os relatórios e burocracias.
Agradeço aos professores Maria Imaculada Zucchi e Iderval da Silva Jr. Sobrinho, e aos pesquisadores doutores Karina Lucas da Silva-Brandão e Marcos Roberto Dias Batista, pela participação e sugestões na banca e/ou pré-banca.
Agradeço à Fapesp pelo auxílio financeiro através da concessão da bolsa de estudo (processo 2011/15739-6).
xix LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação esquemática da região do gene da carboxilesterase E3 amplificada e
sequenciada. Os oligonucleotídeos utilizados para as PCRs e nested-PCRs estão representados pelas flechas azuis e laranjas, respectivamente, indicando as suas posições e a direção das suas amplificações. (página 16)
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação de dois indivíduos de C.
hominivorax com os oligonucleotídeos 7F0-Ch e 7R4-Ch (colunas 1 e 2). L* e L representam os padrões de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen) e 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Na coluna 3 está o controle negativo. (página 18)
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação de dois indivíduos de C.
hominivorax com os oligonucleotídeos 7F0a e RN2 (colunas 1 e 2). L representa o padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Na coluna 3 está o controle negativo. (página 18)
Figura 4. Comparação dos tamanhos dos éxons e íntrons entre os modelos esquemáticos do gene da
carboxilesterase E3 em L. cuprina (A) e C. hominivorax (B). E: éxon. I: íntron. (página 20)
Figura 5. Mapa de agrupamento por correlação dos valores de RSCU de cada códon das sequências
da carboxilesterase E3 para cada uma das 16 espécies. Códons com os maiores valores de RSCU aparecem em cores de preto a vermelho. Asteriscos azuis e vermelhos indicam os códons associados a aminoácidos degenerados four-fold e six-fold, respectivamente. (página 34)
Figura 6. Árvore filogenética construída por Máxima Verossimilhança, utilizada para os testes
branch-site. Os asteriscos (vermelho e azul) indicam os cinco ramos de primeiro plano testados. O asterisco em vermelho indica o único ramo de primeiro plano que apresentou sinais de seleção positiva. Os comprimentos de ramos são apresentados como substituições nucleotídicas por sítio.
(página 39)
Figura 7. Resultados do teste Bayes Empirical Bayes, indicando as probabilidades a posteriori dos
códons do ramo de primeiro plano estarem evoluindo sob seleção purificadora (0< ω < 1), evolução neutra (ω = 1) e seleção positiva (ω > 1). Os códons 3, 49 e 82, detectados com sinais de seleção positiva (probabilidade > 0,95), estão indicados pelos asteriscos. (página 41)
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Figura 8. Análise por janela deslizante das propriedades físico-químicas que apresentaram valores
positivos e significativos. A) Capacidade de estar na extremidade carboxi de uma alpha-hélice e B) Constante de equilíbrio (ionização do COOH). A linha tracejada representa o limite de significância de 0,001. (página 43)
Figura 9. Resultados do SAMOVA considerando A) CR/COI/COII e B) EST/CR/COI/COI. (página 58)
Figura 10. Resultados do DAPC considerando K=3 para os dados nucleares e mitocondriais em
conjunto (EST/CR/COI/COII). I) formação dos três grupos genéticos distintos; II) Proporções de indivíduos de cada grupo genético em cada localidade de coleta de C. hominivorax. As cores vermelha, azul e verde representam os grupos denominados 1, 2 e 3, respectivamente. Os contornos em laranja, roxo e marrom delimitam os grupos denominados A, B e C, respectivamente; III) Frequência dos polimorfismos nos dois códons associados à resistência a inseticidas nas 21 localidades de coleta. 1 e 2 representam os sítios polimórficos nas segunda e terceira posições do primeiro códon (Gly137Asp); 3 representa o sítio polimórfico na segunda posição do segundo códon (Trp251Leu/Trp251Ser). Em laranja, roxo e marrom estão as localidades que formam os grupos denominados A, B e C, respectivamente. Os valores em azul representam os polimorfismos associados aos tipos mutantes que ocorrem em alta frequência (mais de 50%).(página 60)
Figura 11. SNPs que mais contribuíram para a formação dos três grupos genéticos considerados no
DAPC. O conjunto de dados utilizado foi EST/CR/COI/ COII. (página 63)
Figura 12. Resultado da análise de locos outliers. Locos que aparecem na região vermelha
apresentam sinais de seleção positiva; locos que aparecem na região cinza são neutros; e locos na região amarela estão sob seleção balanceadora. (página 70)
xxi LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição nucleotídica de 16 espécies de Diptera, considerando a porcentagem de
códons raros, a porcentagem de conteúdo GC total, a porcentagem de conteúdo GC nas primeira, segunda e terceira posições dos códons e o número efetivo de códons (NEC). (página 33)
Tabela 2. Resultado do teste de mutação-seleção para inferir restrição seletiva sobre as
substituições sinônimas. np: número de parâmetros; ln: valor de verossimilhança; LRT: teste log da razão de verossimilhança; p-valor: significância do LRT; gl: graus de liberdade. (página 37)
Tabela 3. Parâmetros estimados e valores do logaritmo de máxima verossimilhança (lnL) para os
modelos M1a, MA restrito e MA. (página 40)
Tabela 4. Descrição das localidades de coleta. ID: Identificação do sítio de coleta; N: Número de
indivíduos analisados. (página 48)
Tabela 5. Número de haplótipos (Nhp), diversidade haplotípica (Ĥ) e diversidade nucleotídica (π)
dos genes mitocondriais concatenados e da carboxilesterase E3 nas 21 localidades de coleta. (página 54)
Tabela 6. Valores de ΦST estimados pela AMOVA considerando os diferentes conjuntos de dados,
com os marcadores moleculares em diferentes combinações. (página 56)
Tabela 7. Resultados dos testes de neutralidade baseados no espectro de frequência considerando as
localidades de coleta como uma única população panmítica (1 grupo) e considerando três grupos. Em azul estão os resultados que foram estatisticamente significativos (p < 0,05). (página 65)
Tabela 8. Testes de desequilíbrio de ligação entre as duas mutações que são associadas à
resistência a inseticidas. A: entre A do códon GAC e C códon TCG; B: entre A do códon GAC e T códon TTG. (página 69)
xxiii LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
π: diversidade nucleotídica.
ΦST: parâmetro Phi ST, índice de fixação.
ω: razão das taxas de substituições não sinônimas e sinônimas (dN/dS) ABIEC: Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carne AMOVA: Análise de Variância Molecular.
BEB: Análise Bayes empirical Bayes. cDNA: DNA complementar.
CG: grupo regional de Cuba.
ChαE7: gene da carboxilesterase E3 em Cochliomyia hominivorax. COI: subunidade I da citocromo oxidase c.
COII: subunidade II da citocromo oxidase c. CR: domínio B da região controle.
DAPC: análise discriminatória dos componentes principais. DRG: grupo regional da República Dominicana.
FST: índice de fixação. FCT: índice de fixação. FSC: índice de fixação. Ĥ: diversidade haplotípica.
iHS: em inglês, integrated haplotype test.
Indels: inserções e deleções, sigla em inglês de insertion-deletions. kb = kilobases.
LD: desequilíbrio de ligação, sigla em inglês de Linkage Disequilibrium. LDD: em inglês, linkage disequilibrium decay test.
LRT: testes log da razão de verossimilhança.
NAG: grupo regional do norte da região amazônica. NEC: número efetivo de códons.
pb = pares de bases.
PCR: reação em cadeia da polimerase, sigla em inglês de Polymerase Chain Reaction. nested-PCR: sigla em inglês de nested-Polymerase Chain Reaction.
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pN: relação entre o número de diferenças sinônimas pelo número de sítios não-sinônimos.
pS: relação entre o número de diferenças sinônimas pelo número de sítios sinônimos. rEHH: em inglês, relative extended haplotype homozygosity.
RSCU: Uso relativo de códons sinônimos, sigla em inglês de Relative Synonymous Codon Usage.
SAG: grupo regional do sul da região amazônica. SAMOVA: Análise de variância molecular espacial.
SIT: Técnica do inseto estéril, sigla em inglês de Sterile Insect Technique. SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms
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3 O Brasil ocupa o primeiro lugar no ranking mundial de exportação de carne bovina desde 2004. No ano de 2013, o montante de carne bovina exportada foi o equivalente a R$ 6,66 bilhões (ABIEC, 2013), colocando o país como um dos principais exportadores mundiais de produtos agropecuários.
Apesar da importância do Brasil na pecuária, a presença de ecto e endoparasitas representa um importante obstáculo para a criação animal, uma vez que afeta diretamente a produção de carne, leite e a qualidade do couro, além de levar à mortalidade, redução da fertilidade, perda de peso e gastos com o tratamento dos animais infestados (Otranto & Stevens, 2002; Vargas-Terán et al., 2005; Carvalho, 2010), culminando em consideráveis prejuízos econômicos.
Diferentes famílias dentro da ordem Diptera incluem espécies ectoparasitas de grande importância sanitária e econômica. Destacam-se a mosca-dos-chifres (Haematobia irritans Linnaeus, 1758), a mosca-do-berne (Dermatobia hominis Linnaeus Jr., 1781) e a mosca-da-bicheira (Cochliomyia hominivorax Coquerel, 1859), pertencentes às famílias Muscidae, Oestridae e Calliphoridae, respectivamente.
A família Calliphoridae inclui espécies popularmente conhecidas como moscas varejeiras. Esta família tem aproximadamente 1000 espécies, que apresentam uma ampla distribuição geográfica e ocorrem em diferentes ambientes (Baumgartner & Greenberg, 1984). Na região Neotropical, a fauna de califorídeos compreende cerca de 100 espécies.
Dos representantes da família Calliphoridae, pelo menos 80 espécies são consideradas causadoras de miíases, que é a infestação de animais vertebrados por dípteros que, em algum estágio do seu desenvolvimento, se alimentam de tecidos vivos ou mortos do hospedeiro (Zumpt, 1965). No caso das “bicheiras”, as fêmeas depositam os ovos em
4 lesões de pele e orifícios naturais de animais domésticos e as larvas que então eclodem se alimentam dos tecidos vivos do hospedeiro (Shewell, 1987).
Um importante califorídeo ectoparasita obrigatório causador de miíase das Américas é a mosca-da-bicheira, Cochliomyia hominivorax (Hall & Wall, 1995; Guimarães & Papavero, 1999). Essa espécie infesta todos os vertebrados de sangue quente e é notória principalmente em animais domésticos como o gado bovino, ovino e suínos, além da ocorrência de infestações em animais silvestres, como jaguatirica (Pulgar et al., 2009), lobo-guará (Cansi et al., 2011), tamanduá e bicho-preguiça (Mastrangelo, 2012, comunicação pessoal).
O ciclo de vida completo de C. hominivorax em laboratório compreende aproximadamente três semanas a 25 °C. As fêmeas ovipõem na borda de feridas ou nas mucosas de animais e após 24 horas as larvas eclodem e se alimentam dos fluidos corporais e tecidos vivos do hospedeiro por aproximadamente 4 a 8 dias. Após três estádios, as larvas caem no solo para empupar. O período de pupa dura em média oito dias, mas pode chegar até dois meses dependendo da temperatura, seguido da emergência dos adultos. Após um período de 5 a 10 dias, ocorre a fecundação das fêmeas e em seguida ocorre à oviposição, fechando o ciclo de vida da espécie (Guimarães & Papavero, 1999).
A distribuição atual de C. hominivorax é Neotropical, incluindo Cuba, República Dominicana, Haiti, Jamaica e todos os países da América do Sul, exceto o Chile (Wyss, 2000). Sua distribuição geográfica original se estendia do Sul dos Estados Unidos da América até a Argentina e Uruguai (Hall & Wall, 1995; Guimarães & Papavero, 1999; Wyss, 2000). A redução do território ocorreu devido à implementação de um programa de controle com base na técnica do inseto estéril (SIT- Sterile Insect Technique) (Knipling, 1955; Wyss, 2000), que consiste na liberação de moscas esterilizadas no campo, de modo
5 que os machos estéreis irão competir com os machos selvagens para se acasalar. A redução populacional da espécie ocorre devido a que as fêmeas, que são monógamas, darão origem a uma prole inviável ao se acasalar com um macho estéril.
No Brasil, o controle dos ectoparasitas é realizado através do uso de inseticidas químicos. O uso indiscriminado de inseticidas tem levado ao aumento da frequência de indivíduos resistentes e, consequentemente, à sua menor eficácia (Georghiou, 1990; Feyereisen, 1995). Isto impulsionou diversos estudos para desvendar os mecanismos moleculares da resistência a inseticidas. Atualmente, sabe-se que envolvem a alteração da sensibilidade do sítio alvo para que não seja inibido pelo inseticida ou a desintoxicação metabólica do produto químico antes que atinja o sítio alvo (Hemingway et al., 2004). No segundo caso, mudanças quantitativas e qualitativas na classe das enzimas carboxilesterases têm sido associadas com a resistência a inseticidas organofosforados em determinadas espécies de artrópodes (Hemingway & Karunaratne, 1998). O mecanismo quantitativo é caracterizado por uma superexpressão do gene da carboxilesterase, aumentando a quantidade de enzimas que atuam sequestrando e hidrolizando as moléculas do inseticida. Já o mecanismo qualitativo envolve mudanças estruturais na enzima que resultam em uma habilidade para hidrolisar substratos organofosforados em detrimento dos substratos genéricos, os ésteres alifáticos (Campbell et al., 1998; Cui et al., 2011).
Mudanças na atividade “ali-esterase”, de carboxilesterase para organofosforado-hidrolase, nos dípteros Chrysomya putoria, Musca domestica e Lucilia cuprina foram associadas a dois tipos de resistência a inseticidas organofosforados (Campbell et al., 1997). Estes são atribuídos a duas mutações pontuais no gene da carboxilesterase E3: substituição Gly137Asp no oxyanion hole e substituição Trp251Leu no acyl pocket do sítio ativo da enzima. A primeira mutação confere resistência preferencialmente a
dietil-6 organofosforados (Newcomb et al., 1997a), enquanto a segunda confere em sua maioria resistência a compostos dimetil-organofosforados (Campbell et al., 1998) e parece estar envolvida também com a resistência aos piretróides (Heidari et al., 2005). Tais mutações pontuais na carboxilesterase não são restritas aos dípteros, sendo observadas em outras ordens de insetos (Cui et al., 2011).
Segundo Silva (2009), de todos os mecanismos de resistência já estudados, as mutações no gene da carboxilesterase E3 aparentam ser um dos principais em C. hominivorax. Nesta espécie, foram encontradas essas mesmas duas mutações neste gene, denominado ChαE7 (Carvalho et al., 2006). Esse gene faz parte do cluster dos genes da α-esterase, que é comum entre os Diptera (Oakeshott et al., 1999), e é ortólogo a outros genes já identificados em espécies desta ordem, como Drosophila melanogaster (Robin et al., 2000b), Drosophila buzzatii (Robin et al., 2000a), Musca domestica (Claudianos et al., 1999) e o califorídeo Lucilia cuprina (Newcomb et al., 1997b).
As duas mutações no ChαE7 são associadas à resistência a inseticidas em C. hominivorax devido à sua homologia com mutações comprovadas através de bioensaios como substituições que conferem resistência em outras espécies (Campbell et al., 1997; Newcomb et al., 1997a, Claudianos et al., 1999). Em um bioensaio realizado com C. hominivorax foi observada a associação entre a ocorrência da mutação Gly173Asp e a resistência a inseticidas organofosforados (Carvalho, 2007). Porém tal estudo foi preliminar e apresentou algumas restrições, como o fato de não se conhecer as frequências genotípicas das populações de larvas presentes nas feridas antes da aplicação do inseticida. Adicionalmente, o gado não foi confinado entre o momento da aplicação do inseticida e a coleta das larvas, podendo algumas terem saído da ferida (Carvalho, 2007).
7 A realização de novos bioensaios para comprovar a associação entre as duas mutações e a resistência em C. hominivorax apresenta inúmeras limitações. Bioensaios no campo envolvem dificuldades de manuseio e controle do gado. Bioensaios em laboratório, que tenderiam a ser mais fáceis e com maior controle experimental, são dependentes de uma linhagem susceptível como controle. Até o momento, não há registro de uma linhagem 100% susceptível dessa espécie no Brasil.
Diante disso, uma alternativa para comprovar a associação destas duas mutações com a resistência a inseticidas na mosca-da-bicheira seria investigar sinais de seleção positiva em suas populações de campo. Na literatura, vários estudos descrevem a presença de seleção positiva sobre genes codificadores de proteínas, como genes ligados à diferenciação sexual (Sobrinho & de Brito, 2010; Sobrinho & de Brito, 2012; Parker et al., 2013); genes nucleares envolvidos na cadeia de fosforilação oxidativa (Parmakelis et al., 2013), genes envolvidos na visão, como o pigmento visual rodopsina (Du, 2010); genes codificadores de hormônios, como a leptina (Yu et al., 2011); genes envolvidos na resistência a compostos tóxicos (Reitzel et al., 2014), entre outros. No caso da resistência a inseticidas químicos em insetos, poucos estudos exploram sua relação com sinais de seleção positiva, sem a realização de bioensaios (Lynd et al., 2010; Piiroinen et al., 2013).
Os efeitos da seleção podem ser detectados através de várias estratégias, baseadas em diferentes tipos de dados e em diferentes características.
Os testes estatísticos D de Tajima (Tajima, 1989); D, F, D* e F* de Fu e Li (Fu & Li, 1993), Fs de Fu (Fu, 1997) e H de Fay e Wu (Fay & Wu, 2000) são exemplos de testes de neutralidade baseados no espectro de frequência, que utilizam a informação da frequência das mutações. Existem também os testes de neutralidade que se baseiam nas
8 variabilidades intra e interespecífica, como é o caso dos testes HKA (Hudson et al., 1987) e MK (McDonald & Kreitman, 1991).
Níveis elevados de subdivisão em populações naturais podem ser causados por seleção e, assim, métodos para investigar seleção baseados na diferenciação populacional também foram desenvolvidos, como a detecção de locos específicos outliers com base nos valores de FST (Anisimova & Liberles, 2012).
Um conhecido efeito da seleção é que uma mutação vantajosa aumenta rapidamente sua frequência, sem que haja tempo para a recombinação agir sobre o haplótipo que a contém. Assim, alelos em diferentes locos podem estar correlacionados, positiva ou negativamente, o que é conhecido como “desequilíbrio de ligação” (LD). Uma variedade de testes foram desenvolvidos para detectar LD, como D (Lewontin & Kojima, 1960), D’ (Lewontin, 1964) e r2 (Hill & Robertson, 1968), que medem o desequilíbrio de ligação entre variantes nucleotídicas, ou ainda testes mais recentes e baseados em regiões genômicas mais amplas, como rEHH (relative extended haplotype homozygosity) (Sabeti et al., 2002), iHS (integrated haplotype test) (Voigth et al., 2006) e LDD (linkage disequilibrium decay test) (Wang et al., 2006).
Outra importante assinatura da seleção sobre as sequências é com relação às taxas de mutações sinônimas e não-sinônimas, que são comparadas através da estimativa ω=dN/dS. Métodos baseados em modelos de códons e na estimativa por máxima verossimilhança de ω são robustos principalmente para detectar sinais de seleção a partir de dados interespecíficos (Yang & Nielsen, 2000).
Com o surgimento e a disseminação de linhagens resistentes aos inseticidas disponíveis no mercado, o controle das pragas se torna cada vez mais difícil. Como o custo do desenvolvimento de novos inseticidas é muito elevado e novos mecanismos de
9 resistência tendem a surgir a partir do seu uso, o manejo das populações resistentes é cada vez mais fundamental.
No caso de C. hominivorax, seria interessante introduzir programas de controle na América do Sul e região do Caribe, regiões de sua atual distribuição. Porém, mesmo após o sucesso na América do Norte e Central, a implementação de um programa baseado no SIT ainda apresenta algumas limitações (Carvalho, 2010). Um importante fator é a necessidade de uma baixa densidade populacional (Knipling, 1979): a primeira etapa de um programa baseado no SIT é altamente dependente do uso de inseticidas para a diminuição das populações, o que não ocorrerá de maneira efetiva caso as populações estejam resistentes.
Outro importante fator envolvido é a delimitação de regiões e escalas geográficas adequadas (Tabachnick e Black, 1995), que podem ser determinadas a partir de estudos sobre a estrutura genética das populações de interesse. Estudos nesse âmbito para a espécie C. hominivorax têm sido realizados há alguns anos com base em diversos marcadores moleculares e têm dado embasamento para distintas hipóteses sobre a estrutura populacional e a diversidade genética e seus possíveis efeitos nas estratégias de controle (Infante Vargas e Azeredo-Espin, 1995; Infante-Malachias et al., 1999; Lyra et al., 2005; Azeredo-Espin & Lessinger, 2006; Lyra et al., 2009; Torres e Azeredo-Espin, 2009; Fresia, 2011; Fresia et al., 2011; Fresia et al., 2013).
Foi observada estruturação genética ao longo da atual distribuição de C. hominivorax, sendo definidos quatro grupos regionais: (1) Cuba (CG); (2) República Dominicana (DRG); (3) Jamaica, Trinidad e Tobago, Colômbia, Equador e Venezuela, que foi denominado como norte da região amazônica (NAG-North Amazon Group) e (4) sul da região amazônica (SAG-South Amazon Group) (Fresia et al., 2011).
10 O processo de expansão populacional da espécie parece ter se iniciado na região norte, tendo ocorrido uma primeira separação entre o grupo da América do Norte/Central e o grupo da América do sul, após o Último Máximo Glacial, seguida de uma segunda separação entre os grupos regionais do Norte e do Sul da região Amazônica (NAG e SAG) entre o Pleistoceno e o Holoceno (Fresia et al., 2013).
Os grupos NAG e SAG não compartilham haplótipos mitocondriais, indicando o isolamento entre as regiões norte e sul da América do Sul, sugerindo que talvez a região amazônica esteja atuando como barreira geográfica (Fresia et al., 2011). Apesar da grande área amostrada, no grupo SAG foi observada uma baixa diferenciação populacional sem uma correlação geográfica (Fresia et al., 2011), provavelmente devido ao processo de expansão populacional observado (Fresia et al., 2013).
Diante deste cenário, a associação destes trabalhos de genética de populações com estudos sobre as frequências alélicas de genes envolvidos com resistência a inseticidas nesta praga em diferentes localidades são importantes na tentativa de melhorar o entendimento sobre a estrutura genética da espécie e sua distribuição, fornecendo subsídios para o delineamento de um programa de manejo efetivo.
11 OBJETIVOS
Este projeto tem como objetivo geral investigar a evolução molecular do gene da carboxilesterase E3, enzima envolvida no processo de resistência a inseticidas, e analisar a distribuição geográfica da variabilidade genética em populações de C. hominivorax do Brasil, Uruguai, Argentina e Paraguai. Pretende também avaliar o potencial do gene como marcador molecular para investigar o grau de estrutura geográfica das populações desta espécie praga, juntamente com genes mitocondriais, fornecendo dados para auxiliar no planejamento de uma eficiente estratégia de controle.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar um fragmento do gene E3 (ChαE7), que inclui as mutações relacionadas à resistência a inseticidas.
2. Estudar as restrições seletivas sobre as substituições sinônimas do gene da carboxilesterase E3.
3. Estudar a presença de seleção positiva sobre as substituições não-sinônimas no gene da carboxilesterase E3 de C. hominivorax.
4. Investigar a estrutura geográfica de populações de C. hominivorax do Brasil, Uruguai, Argentina e Paraguai empregando o gene nuclear E3 e três genes mitocondriais (CR, COI e COII) como marcadores moleculares.
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15 O primeiro capítulo trata da caracterização de uma parte do gene da carboxilesterase E3 de C. hominivorax, que compreende desde o final do éxon E2 até o final do éxon E4. Para isto, usamos como base a sequência de cDNA da carboxilesterase E3 já conhecida para C. hominivorax (Carvalho et al., 2009) e a sequência do gene completo de Lucilia cuprina (Newcomb et al., 1997b).
Material e Métodos
O DNA genômico total de cinco indivíduos de C. hominivorax coletados em duas localidades do Brasil (Costa Rica - Mato Grosso do Sul e Goiânia - Goiás) e duas do Uruguai (Daymán - Paysandú e San Antonio - Salto), foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio, adaptado para tubos de microcentrífuga (Lyra et al., 2009). O pellet foi ressuspendido em 100 µl de tampão TE e armazenado a -20°C.
Foi amplificado por PCR e nested-PCR o fragmento que compreende o final do éxon 2 (E2), o íntron 2 (I2), o éxon 3 (E3), o íntron 3 (I3) e grande parte do éxon 4 (E4) do gene da carboxilesterase E3 de C. hominivorax (Figura 1). Os íntrons e éxons foram nomeados de acordo com o modelo descrito para Lucilia cuprina (Newcomb et al., 1997b). Para as amplificações via PCR foram utilizados os oligonucleotídeos específicos 7F0-Ch (5´-GGTGTACGTGATTGTTGC-3´), 7R4-Ch (5´-GGATTACTGTTTACACCGATT-3´) e 7F0a (5´-GGTATACCATACGCCCAAC -3´), desenhados com o auxílio do programa Primer3 (Rozen & Skaletsky, 2000) com base na sequência do cDNA do gene E3 de C. hominivorax disponível no GenBank (Carvalho et al., 2009. Número de acesso: FJ969731.1). Também foram utilizados os oligonucleotídeos 7R3a (5´-ATCCTTATCATTATTTTCACCC-3´) e RN2 (5´-AACAGTAATCCCTCGTACG-3´)
16 (Carvalho et al., 2006). Posteriormente, para a amplificação usando a estratégia de nested-PCR, foram desenhados os oligonucleotídeos 7FIn1 (5´-ATTGTGTCTCCCTGCAAGTG-3´) e 7R1aN (5´-CGTTTAGTTTCTGGAGCC-(5´-ATTGTGTCTCCCTGCAAGTG-3´).
Figura 1. Representação esquemática da região do gene da carboxilesterase E3 amplificada e
sequenciada. Os oligonucleotídeos utilizados para as PCRs e nested-PCRs estão representados pelas flechas azuis e laranjas, respectivamente, indicando as suas posições e a direção das suas amplificações.
As condições de amplificação, das PCRs e nested-PCRs, foram otimizadas e padronizadas de acordo com Carvalho et al. (2006 e 2009). As PCRs foram conduzidas em um volume final de 15μl contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM de KCl, 200 mM de cada dNTP, 7,5 μg de BSA (BioLabs), 1,8 mM de MgCl2, 1 mM de cada oligonucleotideo, 1U de Taq polymerase (Invitrogen) e 10-15 ng de DNA. Os ciclos consistiram em um passo inicial de desnaturação de 3 minutos a 96˚C, seguido por 35 ciclos de 1 minuto a 95˚C, 1 minuto a 62˚C e 2 minutos a 72˚C, finalizando com um passo de extensão de 10 minutos a 72˚C usando um termociclador PTC-200 (MJ-Research). As amplificações por nested-PCR foram conduzidas de maneira semelhante, diferindo com relação à concentração de MgCl2 e à temperatura de anelamento, que foram de 2,5 mM e 52˚C, respectivamente. Os produtos das reações foram verificados em gel de agarose 1%, corados com brometo de etídeo e observados em transiluminador UV.
17 Os produtos das PCRs e nested-PCRs foram purificados utilizando o Kit de Purificação illustraTM GFXTM PCR DNA e Gel Band, conforme o protocolo do fornecedor (GE Healthcare, Reino Unido), e clonados no plasmídeo vector pGEM-T (Promega Corp). Os vetores foram utilizados para transformar células de Escherichia coli, que foram cultivadas em meio LB sólido com ampicilina (50 g/mL) e X-Gal (0,8 mg em cada placa). Após a seleção das colônias, o DNA do plasmídeo foi isolado (Sambrook et al., 1989) e os clones sequenciados utilizando os oligonucleotídeos M13 direto e reverso (M13D e M13R, respectivamente). As reações de sequenciamento foram executadas em um sequenciador de DNA automático ABI 3700 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA) com o Big Dye Terminator Cycle Sequencing ABI Kit versão 3.1. Os cromatogramas resultantes do sequenciamento foram avaliados no programa FinchTV versão 1.4.0 (Geospiza Research Team) visualmente e com base nos valores de Phred (Ewing et al. 1998a, b), e as regiões de baixa qualidade descartadas. As seqüências bidirecionais de cada indivíduo foram montadas em contigs no programa Cap3 (Huang & Madan, 1999), levando em consideração os valores de qualidade de cada base. As sequências obtidas foram alinhadas com base nos algoritmos implementados nos programas ClustalX (Thompson, 1997) e Muscle (Edgar, 2004).
Resultados e Discussão
As primeiras amplificações do gene da carboxilesterase E3 com os oligonucleotídeos 7F0-Ch e 7R4-Ch resultaram em bandas inespecíficas mesmo após diversas tentativas de otimização (Figura 2).
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Figura 2. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação de dois indivíduos de C.
hominivorax com os oligonucleotídeos 7F0-Ch e 7R4-Ch (colunas 1 e 2). L* e L representam os padrões de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen) e 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Na coluna 3 está o controle negativo.
Na tentativa de obter a amplificação dos fragmentos corretos, foi desenhado outro oligonucleotídeo, denominado 7F0a, que foi utilizado junto ao oligonucleotídeo RN2. Após a otimização e padronização das reações de PCR com este par de oligonucleotídeos, foi possível obter bandas com aproximadamente 3 kb (Figura 3).
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação de dois indivíduos de C.
hominivorax com os oligonucleotídeos 7F0a e RN2 (colunas 1 e 2). L representa o padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Na coluna 3 está o controle negativo.
19 Em princípio, considerando a homologia deste gene com o descrito para L. cuprina (Newcomb et al., 1997b), o tamanho esperado para esse fragmento é próximo de 1100 pb. Devido ao grande tamanho dos fragmentos amplificados para C. hominivorax, foi possível obter sequências confiáveis apenas para as extremidades, de modo que a sequência obtida com o oligonucleotídeo M13D compreendeu o final do éxon E2 e o começo do íntron I2, enquanto a sequência obtida com M13R compreendeu do final do éxon E4 até o final do íntron I2, incluindo assim o íntron I3 e o éxon E3. O grande tamanho do fragmento amplificado era devido ao tamanho do íntron I2, que apresenta em torno de 2 kb.
O íntron I2 representou um desafio na caracterização desse fragmento da carboxilesterase E3. Devido ao grande tamanho da região a ser amplificada e sequenciada, foi necessário utilizar adicionalmente a técnica de nested-PCR. Para tal foram desenhados os oligonucleotídeos 7FIn1 e 7R1aN com base nas sequências previamente obtidas das extremidades dos fragmentos, de modo que o primeiro oligonucleotídeo se anelava no íntron I2 e o segundo no começo do éxon 3 (ver Figura 1).
O alinhamento das sequências das cinco amostras obtidas nesta etapa de caracterização do fragmento do gene da esterase E3 pode ser visualizado no Anexo 1. Foi possível recuperar 111 pb do éxon E2, aproximadamente 2000 pb do íntron I2 (esse tamanho apresenta uma variação entre as amostras devido a inúmeros indels), 150 pb do éxon E3, 63 pb do íntron I3 e 321 pb do éxon E4. As duas mutações associadas a resistência à inseticidas, Gly173Asp e Trp251Leu, situam-se nos éxons E3 e E4, respectivamente.
Em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b) o tamanho do íntron I2 é de 280 pb, ou seja, em torno de sete vezes menor que o observado para C. hominivorax (Figura 4). Em Drosophila melanogaster o I2 consiste de 85 pb (Robin et al., 1996) e em Musca domestica
20 é de 63 pb (Claudianos et al., 1999). Portanto, foi verificado que o tamanho desse íntron varia consideravelmente entre diferentes espécies pertencentes ao grupo Muscomorpha.
Figura 4. Comparação dos tamanhos dos éxons e íntrons entre os modelos esquemáticos do gene da
carboxilesterase E3 em L. cuprina (A) e C. hominivorax (B). E: éxon. I: íntron.
Já o íntron 3, que também faz parte da região caracterizada do gene, apresentou uma varibilidade de tamanho menor nestas mesmas espécies: em C. hominivorax é de 63 pb, em L. cuprina é de 56 pb (Newcomb et al., 1997b), em D. melanogaster é de 58 pb (Robin et al., 1996) e em M. domestica é de 62 pb (Claudianos et al., 1999).
Mount e colaboradores (1992) definiram duas classes para os íntrons de Drosophila, de acordo com o seu tamanho: íntrons pequenos, com 80 pb ou menos, e íntrons grandes, com mais de 80 pb. Em seu estudo com o gene da metalotioneína (Mtn), Stephan e colaboradores (1994) discutem evidências que indicam que a mudança de tamanho do íntron do gene Mtn é um importante evento evolutivo. Transições de uma classe de tamanho para outra parecem ser raras, não tendo sido observadas dentro do grupo melanogaster. Dentro desse grupo, inserções e deleções são frequentes nos íntrons grandes, enquanto no caso dos íntrons pequenos o tamanho se mantém conservado. Apenas quando
21 o grupo melanogaster foi comparado com outros grupos, como obscura, foi possível observar íntrons que mudaram de classe de tamanho.
Considerando a classe dos íntrons grandes (maiores que 80 pb), Moriyama e colaboradores (1998) verificaram que na espécie Drosophila virilis os genes tendem a possuir íntrons maiores em relação à Drosophila melanogaster, enquanto Drosophila pseudoobscura não apresenta diferenças significativas, e que essa diferença é proporcional à diferença no tamanho total do genoma das espécies.
Na espécie D. melanogaster, Carvalho e Clark (1999) observaram que íntrons grandes apresentam uma taxa de recombinação menor que íntrons pequenos, ou seja, estão correlacionados negativamente. No caso da classe dos íntrons grandes, não há uma correlação entre o tamanho do íntron e a taxa de recombinação, indicando que todos os íntrons pertencentes a essa classe são afetados de maneira semelhante pela recombinação, independente do seu tamanho. Já no caso da classe dos íntrons pequenos, há uma correlação positiva entre o tamanho do íntron e a taxa de recombinação, indicando que íntrons muito pequenos são deletérios. Assim, os autores sugerem um papel da seleção natural sobre o tamanho dos íntrons, excluindo a possibilidade de que essa seja uma característica neutra, uma vez que tanto íntrons grandes quanto íntrons muito pequenos estão associados a regiões de baixa recombinação, nas quais a seleção natural é menos efetiva.
Comeron e Kreitman (2000) observaram a mesma correlação negativa entre o tamanho dos íntrons e a taxa de recombinação em Drosophila melanogaster e sugerem que ela seja resultado de um complexo cenário em que mutação, seleção e deriva genética estejam atuando em um equilíbrio dinâmico. Os íntrons pequenos, diferentemente do observado por Carvalho e Clark (1999), foram mais comumente observados em regiões de alta recombinação, o que sugere que o tamanho mínimo do íntron está sob alta pressão de
22 seleção em Drosophila. Comeron e Kreitman (2000) discutem ainda o tipo de seleção que estaria atuando, descartando a hipótese de que a seleção estaria reduzindo o tempo de transcrição e do custo energético deste processo. Para os autores a hipótese de que os íntrons longos seriam mantidos por minimizarem o efeito Hill-Robertson (interferência entre mutações ligadas), aumentando a taxa de recombinação entre mutações seletivas em diferentes éxons, é mais plausível.
Tendo em vista esse complexo cenário proposto e ainda muito discutido para a evolução dos íntrons, podemos especular que o tamanho do íntron I3 seja menor e mais conservado entre as espécies investigadas pelo fato de estar sob uma forte pressão de seleção, associada aos éxons próximos. Em contrapartida o grande íntron I2 estaria sob pressão de seleção fraca, aumentando a taxa de recombinação entre os éxons adjacentes, ou estaria evoluindo de forma neutra, uma vez que há uma diferença visualmente grande no tamanho dos íntrons entre espécies da mesma família (Neste caso, Calliphoridae: C. hominivorax e L.cuprina, com ~2000 pb e 280 pb, respectivamente).
Após a obtenção da região do gene da carboxilesterase E3 que compreende do final do éxon E2 ao final do éxon E4 em C. hominivorax, a composição nucleotídica e o uso de códons neste gene foram investigados no Capítulo 2. Adicionalmente, a busca por sinais de seleção positiva foi realizada através de uma estratégia hierárquica, sendo considerados tanto os dados interespecíficos, também abordados no Capítulo 2, quanto os dados intraespecíficos, discutidos no Capítulo 3. No caso das análises com base nos dados populacionais, a caracterização apresentada no presente capítulo foi essencial, pois permitiu escolher a região a ser utilizada, que incluiu um trecho do íntron I2, o éxon E3, o íntron I3 e o éxon E4. O trecho do íntron I2 foi incluído na região analisada com o intuito de ser utilizado comparativamente com os éxons, sendo avaliado como um marcador neutro.
23
25 Neste capítulo serão abordados os efeitos da seleção em nível filogenético, a partir de dados interespecíficos, considerando tanto as restrições seletivas (seleção purificadora) sobre as substituições sinônimas quanto os sinais de seleção positiva das substituições não-sinônimas.
Material e Métodos
1. Investigação de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas
Primeiramente foi realizada a análise da composição nucleotídica de sequências do gene da carboxilesterase E3, para verificar se há uso enviesado de códons. Uma vez detectado viés no uso de códons, análises de máxima verossimilhança entre modelos de substituição de códons foram utilizadas para investigar possíveis sinais de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas, que é definida aqui como o produto da ação de seleção purificadora.
Sequências completas do cDNA da carboxilesterase E3 disponíveis no GenBank foram obtidas para cinco espécies de Muscomorpha: C. hominivorax (FJ969731.1) L. cuprina (U56636.1), Musca domestica (AF133341.1), Haematobia irritans (AF139082.1) e Ceratitis capitata (EU130782.1). A recente caracterização e disponibilidade dos 12 genomas de Drosophila (Drosophila 12 Genomes Consortium: FlyBase; http://flybase.org) permitiu também utilizarmos as sequências do gene da carboxilesterase dessas espécies: Drosophila melanogaster (CG1112), Drosophila simulans (GD19475), Drosophila sechellia (GM10474), Drosophila erecta (GG25127), Drosophila persimilis (GL12171), Drosophila ananassae (GF17298), Drosophila virilis (GJ10232), Drosophila mojavensis
26 (GI23478), Drosophila willistoni (GK11077), Drosophila grimshawi (GH19269) e Drosophila pseudoobscura (GA10768). Drosophila yakuba foi excluída das análises por sua sequência ser muito divergente das demais, diminuindo a confiabilidade do seu alinhamento.
1.1. Composição nucleotídica e viés no uso de códons
Com o auxílio do servidor CAICal (Puigbo et al., 2008) e o programa DnaSP 5.0 (Librado & Rozas, 2009) foi possível calcular os seguintes parâmetros para cada sequência de cada espécie: a quantidade de cada tipo de códon, a quantidade de cada aminoácido, a porcentagem de códons raros, o conteúdo de G+C, tanto geral quanto para cada posição do códon (1ª, 2ª e 3ª posições), o número efetivo de códons (NEC) e os valores de Relative Synonymous Codon Usage (RSCU) de cada códon. Estes últimos foram visualizados de maneira gráfica com o uso do aplicativo CIMMiner (http://discover.nci.nih.gov/cimminer) (Weinstein et al., 1997), excluindo os códons de terminação.
1.2. Análises de máxima verossimilhança com modelos de substituição de códons
As dezesseis sequências foram alinhadas usando o programa Muscle (Edgar, 2004). Os métodos MaxChi (Maynard, 1992), Geneconv (Padidam et al., 1999) e RDP (Martin & Rybicki, 2000), implementados no programa RDP4.16 (Heath et al., 2006), foram utilizados para identificar sinais de recombinação, que interferem nas inferências filogenéticas. Após a detecção das sequências recombinantes, que foram eliminadas das análises, as restantes foram utilizadas para a reconstrução filogenética por máxima
27 verossimilhança com o programa Phyml 3.0 (Guindon & Gascuel, 2003). As árvores foram construídas a partir de cinco árvores randômicas iniciais, com o operador de busca BEST, e o suporte dos ramos foi dado através do bootstrap, com 1000 replicatas (Anexo 2). O modelo ótimo de substituição nucleotídica utilizado foi SYM+I+G, selecionado nos programas jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008; Guindon & Gascuel, 2003) e mrAIC (Nylander, 2004) considerando os critérios de informação de Akaike (AIC), Akaike corrigido (AICc) e Bayesiano (BIC). Tanto o alinhamento quanto a árvore gerada foram utilizados para testar modelos de mutação-seleção implementados no programa Codeml, do pacote Paml 4.6 (Yang, 2007; Yang & Nielsen, 2008). A comparação par a par dos modelos FMutSel0-M0 e FMutSel-M0 foi realizada com um teste log da razão de verossimilhança (LRT), cuja significância foi verificada com a distribuição chi-quadrado.
1.3. Análises de restrição seletiva em outras regiões do genoma
As mesmas análises de RSCU e de máxima verossimilhança com modelos de substituição de códons apontadas nos itens 1.1 e 1.2 foram efetuadas para outras doze regiões gênicas considerando C. hominivorax e espécies de Drosophila. Essas regiões foram escolhidas a partir da anotação funcional do transcriptoma de C. hominivorax (Carvalho et al., 2010) com o programa Blast2GO (Conesa et al., 2005), selecionando sequências com mais de 100 pb, E-values mínimos menores que 1e−5 e presença de ortólogos conhecidos (Anexo 3).
28 2. Investigação de seleção positiva sobre as substituições não-sinônimas
O DNA genômico de um indivíduo de C. hominivorax, um de Cochliomyia macellaria e um de Chrysomya megacephala foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio, adaptado para tubos de microcentrífuga (Lyra et al., 2009), e o pellet ressuspendido em 100 µl de tampão TE e armazenado a -20°C. A região que abrange os dois éxons (E3 e E4), que possuem as mutações Gly137Asp e Trp251Leu no gene da carboxilesterase E3, foi amplificada usando os oligonucleotídeos 7F1a (5'-GGCTCCAGAAACTAAACG-3'), 7R3a e RN2 (Carvalho et al., 2006). A amplificação do fragmento, verificação em gel de agarose 1%, purificação, sequenciamento, análise dos cromatogramas e montagem dos contigs foram realizados como descrito no Capítulo 1. Sequências de DNA dessa região da carboxilesterase de outros Muscomorpha disponíveis no GenBank e no Flybase foram obtidas: L. cuprina (U56636.1), Lucilia sericata (AY691501.1), M. domestica (AF133341.1), Haematobia irritans (AF139082.1), D. melanogaster (CG1112), D. simulans (GD19475), D. sechellia (GM10474), D. erecta (GG25127), D. persimilis (GL12171), D. ananassae (GF17298), D. yakuba (GE25784), D. virilis (GJ10232), D. mojavensis (GI23478), D. willistoni (GK11077), D. grimshawi (GH19269), D. pseudoobscura (GA10768) e Ceratitis capitata (EU130782.1), esta última utilizada como grupo externo nas reconstruções filogenéticas.
As sequências obtidas dos éxons de C. hominivorax, C. macellaria e C. megacephala e as dos táxons mais distantes obtidas nos bancos de dados foram traduzidas a fim de realizar o alinhamento dos aminoácidos no Muscle (Edgar, 2004), o qual serviu como referência para corrigir o alinhamento das sequências de nucleotídeos. Testes de recombinação foram feitos a fim de verificar a presença de possíveis sequências
29 recombinantes, devido à sua influência nas inferências filogenéticas (Schierup & Hein, 2000). Os testes utilizados foram MaxChi (Maynard, 1992), Geneconv (Padidam et al., 1999) e RDP (Martin & Rybicki, 2000), disponíveis no programa RDP4.16 (Heath et al., 2006).
As relações filogenéticas das sequências dos éxons foram reconstruídas por máxima verossimilhança usando o programa Phyml 3.0 (Guindon & Gascuel, 2003) e através do modelo bayesiano implementado no programa MrBayes 3.1 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). O modelo ótimo de substituição nucleotídica SYM+I+G foi selecionado nos programas jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008; Guindon & Gascuel, 2003) e mrAIC (Nylander, 2004), considerando os critérios de informação de Akaike (AIC), Akaike corrigido (AICc) e Bayesiano (BIC). A árvore de máxima verossimilhança foi construída a partir de cinco árvores randômicas iniciais, com o operador de busca de topologia de árvores BEST e suporte dos ramos dado através do bootstrap (número de replicatas = 1.000). A árvore de inferência bayesiana foi construída a partir de duas análises independentes, por 100.000 gerações, com amostragem dos parâmetros e das árvores a cada 100 gerações. Após a convergência das cadeias foi realizado o descarte das 25% primeiras árvores amostradas e a construção da árvore consenso, cujos suportes de ramos são dados pelas suas probabilidades posteriores.
A partir das árvores filogenéticas obtidas, as pressões seletivas que modelaram a evolução do fragmento do gene E3 foram investigadas usando o software Codeml, implementado no programa Paml 4.6 (Yang, 2007). Foram usados os testes branch-site relaxado e branch-site estrito (Yang & Nielsen, 2002; Zhang et al., 2005), que levam em conta a taxa de substituições não-sinônimas/sinônimas (dN/dS=ω). A fim de verificar se as estimativas de ω não estavam enviesadas por conta de um excesso de substituições
30 sinônimas, foi realizado um teste de saturação das substituições sinônimas e não-sinônimas plotando a relação entre o número de diferenças sinônimas pelo número de sítios sinônimos (pS) e a relação entre o número de diferenças sinônimas pelo número de sítios não-sinônimos (pN) contra a distância genética entre pares de taxa (Anexo 6). Os valores de pS, pN e distância entre as sequências foram calculados pelo método Nei-Gojobori (Nei & Gojobori, 1986), com uma taxa de transição/transversão de 1,5 no programa Mega 5.0 (Tamura et al., 2011).
Para os testes branch-site, foram definidos dois tipos de ramos: ramos de primeiro plano, em que foi testada a hipótese de seleção positiva, e ramos de fundo. Foram considerados cinco diferentes ramos de primeiro plano: (a) apenas o ramo de C. hominivorax; (b) o ramo que dá origem a C. hominivorax e C. macellaria; (c) o ramo que dá origem ao grupo que contém C. hominivorax, C. macellaria e C. megacephala; (d) o ramo dos califorídeos (C. hominivorax, C. macellaria, C. megacephala, L. cuprina e L. sericata) e (e) o ramo que dá origem ao grupo califorídeos + M. domestica. Os ramos de primeiro plano foram então contrastados com os ramos de fundo, constituídos pelas linhagens de Drosophila e demais espécies que não foram incluídas nos ramos de primeiro plano.
Tanto o teste branch-site relaxado como o teste branch-site estrito usam o modelo MA como modelo alternativo. Neste modelo é permitido que os códons nos ramos de primeiro plano tenham ω > 1, enquanto os códons nos ramos de fundo apresentam valores ω ≤ 1. O modelo nulo do teste branch-site relaxado, denominado M1a, assume as mesmas taxas de evolução para todos os sítios e ramos, com 0 < ω ≤ 1. Já o modelo nulo do teste branch-site estrito, denominado MA restrito, fixa a categoria ω > 1 em 1, forçando todos os códons com ω > 1 a evoluir de forma neutra (ω = 1). Um valor de verossimilhança é
31 associado a cada modelo e um teste log da razão de verossimilhança (LRT) significativo desses valores, verificado por um teste qui-quadrado, indica seleção positiva ou seleção purificadora relaxada, no caso do primeiro teste (M1a X MA), e seleção positiva, no caso do segundo teste (MA relaxado X MA). Devido aos múltiplos testes com o mesmo conjunto de dados, foi feita a correção de Bonferroni para os níveis de significância. Uma vez detectado um ramo com sinal de seleção positiva, o método Bayes empirical Bayes (BEB) (Yang et al., 2005) foi utilizado para estimar que sítios estavam sob a influência da seleção positiva, considerando probabilidade posterior maior que 95%.
A seleção positiva também foi investigada através do método MM01 de McClellan et al. (2005), com o programa TreeSAAP 3.2 (McClellan & McCracken, 2001; Woolley et al., 2003; McClellan et al., 2005), que avalia se as substituições não-sinônimas favorecem ou não mudanças estruturais ou funcionais na proteína. As mudanças nas propriedades físico-químicas devido a cada substituição não-sinônima são consideradas, criando uma escala que vai de substituições conservadoras a muito radicais (McClellan et al., 2005). McClellan et al. (2005) definiram seleção estabilizadora como aquela que tende a manter os atributos bioquímicos originais da proteína e seleção desestabilizadora como aquela que favorece mudanças estruturais e funcionais em uma região da proteína. Inicialmente a análise foi feita com base no comprimento total das sequências para detectar quais propriedades físico-químicas apresentam sinais de seleção positiva, com a significância estatística dada pelos valores de escore-z (escore padrão). Uma vez apontadas as propriedades dos aminoácidos que mostraram mudanças significativas, foi realizada uma análise de janela deslizante, de 20 aminoácidos de comprimento, para verificar quais regiões específicas foram afetadas por seleção positiva desestabilizadora, que representaria uma evidência de adaptação molecular.
32 Resultados e Discussão
1. Investigação de restrição seletiva sobre as substituições sinônimas
As sequências de cDNA obtidas nos bancos de dados apresentaram um tamanho de 1545 pb após a edição do alinhamento.
A análise de composição nucleotídica para as 16 espécies consideradas mostrou uma porcentagem de conteúdo GC que variou de 36,87 a 55, 81%, sendo que a terceira posição dos códons nas espécies de drosofilídeos apresentou uma porcentagem mais elevada (>58%), com exceção de D. willistoni. (Tabela 1).
O número efetivo de códons (NEC) é um índice usado para inferir um viés de uso de códons sem a necessidade de utilizar dados de genes de referência. Os valores do NEC variam de 20, em que um códon é exclusivamente usado para cada aminoácido, a 61, em que o uso dos códons sinônimos é igualmente provável (Wright, 1990). Na Tabela 1 pode-se notar que os valores de NEC são um pouco menores que 61, de modo que em C. hominivorax e L. cuprina estes valores são os menores, indicando que nestas espécies há uma preferência um pouco maior por alguns códons em relação às demais espécies. Porém, de forma geral, a especificidade não é demasiado alta.
