ANÁLISES

A partir das sequências obtidas usando o sequenciamento , foram realizados alinhamentos múltiplos com o auxilio do programa Clustal W 1.4, utilizando para tais análises a matriz Blossum 62, de acordo com os parâmetros especificados pelo programa (THOMPSON ., 1994). As sequências utilizadas para o alinhamento foram obtidas no banco de dados do Swiss-Prot. Para avaliação dos resultados obtidos por espectrometria de massa, foram utilizados dois programas, & (Bruker Daltonics) e PepSeq (GARRETT e GRISHAM, 1995). O primeiro programa foi utilizado para avaliações iniciais dos espectros obtidos. Já o programa PepSeq foi utilizado para a interpretação dos espectros obtidos. Os parâmetros utilizados foram 0,5 de tolerância para massa molecular e o mesmo valor para a tolerância da fragmentação do íon.

C"

5.1. EPIDERME

No primeiro passo de purificação por cromatografia de exclusão molecular, os componentes do extrato bruto de epiderme de ! foram separados em dez frações (Figura 10). Apenas as seis primeiras frações continham proteínas e peptídeos, esse fator foi comprovado por análise em SDS-PAGE e por espectrometria de massa, MALDI ToF/ToF. Nas frações 1, 2 e 3 foram encontradas proteínas de peso molecular variando de 60

37 a 90 kDa (Figura 11). Já as frações 4, 5 e 6 apresentavam proteínas e peptídeos que variavam na faixa de peso molecular de 25 a 2 kDa (Figura 11).

'2 " Cromatograma de exclusão molecular em Superdex G75 do mioepitélio de . F1 a F10 indicam as frações obtidas após o processo cromatográfico. A absorbância foi monitorada a 216 nm (linha vermelha) e 280 nm (linha azul).

'2 " Gel SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de exclusão molecular de mioepitélio de . MM indica o marcador de peso molecular e F1 a F6 indicam as frações obtidas na cromatografia em Superdex G75.

38 Em um primeiro momento, os esforços para a purificação de peptídeos ou proteínas se concentraram apenas nas frações 4, 5 e 6. Cada uma das três frações foi aplicada em uma coluna de fase reversa analítica C18. Nas frações 4 e 5 foram observadas uma grande quantidade de proteínas nas concentrações em 30 a 50% de acetonitrila (Figuras 12 A e B). Já para a fração 6 foi observada apenas três frações predominantes (Figura 12 C). Todas as frações obtidas por cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrômetria de massa MALDI ToF/ToF e foi observado que muitos peptídeos presentes na fração 6 estavam também presentes na fração 5. Diante deste fato, para trabalhos posteriores, as duas frações foram unidas para realização de cromatografia de fase reversa. Não ocorreram mudanças significativas no perfil cromatográfico da fração 5 quando esta foi unida à fração 6. As análises por espectrometria de massa também revelaram que as proteínas contidas nas frações obtidas após a realização de fase reversa (C18) não estavam purificadas, sendo necessário outro passo cromatográfico para a identificação das proteínas. Assim, a fração escolhida para tal análise foi uma das frações majoritárias da fração 5 que foi, aplicada em cromatografia ultra rápida UFLC. Entretanto, não foi possível realizar o sequenciamento da proteína purificada (Figura 12 D). Para o passo seguinte da purificação das frações 1, 2 e 3 foi utilizada uma coluna de fase reversa de C8.

39

Figura 12" Cromatogramas de mioepitélio de em coluna de fase reversa. (A) Cromatograma da fração 4 em coluna C18

Vydac. (B) Cromatograma da fração 5 em coluna C18 Vydac. O número 1 indica a fração que foi purificada uma proteína de 9kDa. (C) Cromatograma da fração 6 em coluna C18. As setas indicam as frações analizadas por espectometria de massa. A absorbância foi monitora a 216 nm (linha vermelha) e 280 nm (linha azul). A linha preta indica a concentração do solvente ACN-TFA 0,1%. (D) Espectro de massa da fração purificada a partir da fração 5. m/z indica a relação massa/carga.

40 Para a fração 2 (Figura 13), ocorreram poucas proteínas e peptídeos sendo observadas apenas três frações abundantes, eluídas a partir de 45% de acetonitrila. Todas as frações coletadas foram submetidas a análises por espectrometria de massa. Entre os peptídeos encontrados nas frações, fragmentos das proteínas paramiosina e beta-actina puderam ser identificados após o seqüenciamento dos peptídeos correspondentes (Tabela 3).

'2 A" Cromatograma da fração 2 em coluna C8 Vydac. Os números indicam as frações em que peptídeos fragmentados puderam ser identificados.

Diante de dificuldades para a purificação de proteínas e peptídeos provenientes da amostra e também devido à baixa concentração destes, após a realização dos diversos passos cromatográficos, foi realizada uma segunda estratégia para a caracterização de peptídeos provenientes da epiderme de . Para isso, as seis frações provenientes da cromatografia de exclusão molecular de sofreram um processo de alquilação e redução (dados não mostrados). Após esse passo, para a retirada da grande quantidade de sais presentes na amostra, estas foram aplicadas em coluna de fase reversa. Para as frações 1, 2 e 3, foi utilizada uma coluna de fase reversa C4 e para as frações 4, 5 e 6, a coluna de fase reversa C18 (dados não mostrados). Para ambas as análises, apenas foram recolhidas as frações eluídas com acetonitrila. Após a cromatografia, essas amostras foram liofilizadas e em seguida tripsinisadas utilizando a tripsina imobilizada. Em seguida, todas as frações foram aplicadas em coluna de fase reversa C18, e as amostras eluídas com acetonitrila analisadas por espectrometria de massa. Uma grande quantidade de peptídeos foi observada em todas as

41 frações coletadas de maneira que muitos desses peptídeos apresentavam massas moleculares muito similares e próximas. Esse fator dificultou a análise dos mesmos e seleção para fragmentação por espectrometria de massa. Entretanto alguns peptídeos presentes em cada fração puderam ser analisados e seqüenciados após aquisição dos espectros de MSMS dos íons correspondentes (Tabela 3). Para alguns peptídeos trípticos, também foi utilizado o processo cromatográfico de UFLC para um maior refinamento da purificação destes (dados não mostrados). Os peptídeos foram identificados por meio do processo de sequenciamento

e as sequências obtidas comparadas com as estruturas primárias presentes no banco de dados do NCBI para moluscos. Por meio desse processo foram caracterizadas apenas proteínas estruturais do tecido muscular, como actina, tropomiosina, calponina, filamina e beta-actina (Tabela 3).

9# A" Sequências dos peptídeos obtidos a partir do sequenciamento de fragmentos de proteínas de mioepitélio de . Todas as sequências representadas apresentam 100% de identidade com os segmentos das seqüências presentes em banco de dados. As frações indicadas com asterisco representam os peptídeos que foram identificados sem o processo de tripsinização, já os demais peptídeos foram obtidos a partir do processo de alquilação, redução e tripsinização.

3), N OPQO #KR4*5 & + +# 1 724,2 HIADIR Calponina 1 852,4 QYDEAAR Tropomiosina 1 966,5 YIAEDAER Tropomiosina 1 1439, 9 GLAEIESETAGLQR Tropomiosina 2* 1667,8 KGKDSYVGDEAQSKR Beta-actina 2* 1354,5 DSYVGDEAQSKR Beta-actina 2* 1343,8 WVAEQNLQTVR Paramiosina 2* 1311,6 DFDSDVSVVR Paramiosina 3 1954, 2 VAPEEHPVLLTEAPLNPK Beta-actina 4 1691,8 SVIECHDNEDGTCR Filamina 4 976,9 QFAGDDAPR Beta-actina

42 Diante de tais resultados e busca na literatura, foi observado que a proteína tropomiosina é descrita como possuindo atividade alergênica. Assim, foi realizado um alinhamento múltiplo dos fragmentos de tropomiosina de e tropomiosinas isoladas a partir de outros moluscos que são descritas em bancos de dados de proteínas como possuindo atividade alergênica (Figura 14). Foi observada similaridade entre os fragmentos de tropomiosinas identificados em e as moléculas de tropomiosina descritas alergênicas dos

moluscos , * e

'2 B" Alinhamento das sequências de tropomiosina de com

tropomiosinas alergênicas de outros moluscos, , , ,

. Alinhamento obtido pelo programa BioEdit 7.0.9. Números de acesso da seqüência no banco de dados SwissProt: sp_Q9GZ71, sp_Q9GZ69, sp_Q9GZ70 e tr_O96701, respectivamente. As cores indicam os aminoácidos idênticos encontrados nas seqüencias do banco de dados e da amostra em estudo. Vermelho indica o aminoácido aspártico, verde claro indica o aminoácido glutâmico, rosa indica a asparagina, azul indica arginina, verde escuro indica leucina e isoleucina, lilás indica o aminoácido tirosina, a cor amarela indica o aminoácido glutamina, cinza escuro indica o aminoácido glicina, a cor cinza claro indica o aminoácido lisina e azul claro indica o aminoácido serina.

43 5.2. LÍQUIDO DE DEFESA

A determinação da concentração protéica do extrato bruto de secreção de

não foi realizada satisfatoriamente. Vários métodos de quantificação foram utilizados, como Bradford, RCDC e Qubit. Entretanto independente do método empregado para quantificação era observada a interferência dos pigmentos com reagentes de quantificação, de maneira que o resultado real era mascarado pela coloração da amostra. Diante de tais fatores, 1mL da amostra foi aplicado na coluna de exclusão molecular, Superdex G75. Por esse processo foi observada uma separação eficiente das proteínas e pigmentos presentes na amostra. O perfil cromatográfico apresentou diversas frações (Figura 15), mas apenas as frações iniciais apresentavam proteínas (frações 8 a 13). Visualmente foram observados diversos pigmentos separados pelo processo cromatográfico (Figura 16). Por meio de eletroforese unidimensional (Figura 17) foram visualizadas proteínas e peptídeos nas frações iniciais, variando de 80 a 9 kDa. Já as demais frações não foram observadas proteínas ou peptídeos.

'2 C" Cromatograma de exclusão molecular da coluna Superdex G75 do extrato bruto do líquido de defesa de . A absorbância foi monitorada a 216 nm (linha vermelha) e 280 nm (linha azul).

44 '2 D" Fotografia da coluna de Exclusão Superdex G75 durante o processo cromatográfico com a amostra de líquido de defesa de . Na figura estão evidenciados os pigmentos que foram separados pelo processo cromatográfico.

'2 E" Gel SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de exclusão molecular do líquido de defesa de . MM indica o marcador de massa molecular e F8 a F13 indicam as frações obtidas na cromatografia em Superdex G75.

45 Diante da baixa concentração de proteínas em cada fração, foi feito um de todas as frações e as mesmas foram aplicadas em uma coluna de fase reversa, C4 analítica (NST). Após esse passo de purificação foi observada a presença de diversas frações no perfil cromatográfico, mas a maior concentração de proteínas foi eluída com uma concentração de acetonitrila acima de 40% (Figura 18 A). Uma fração majoritária indicada na Figura 18 (A) foi eluída a 70% de acetonitrila. Nesta fração foi observado por espectrometria de massa, MALDI ToF/ToF, a presença de duas proteínas, uma de massa molecular de 13995 Da e outra de massa de 9086 Da. Para separação destas duas proteínas, foi realizado um terceiro passo de purificação utilizando um UFLC Shimadzu®. Com este processo, as proteínas foram separadas em duas frações (Figura 18 B), entretanto a fração contendo a proteína de 9 kDa ainda não se encontrava totalmente purificada, pois ainda eram observados peptídeos de tamanhos menores na amostra. Entretanto esse processo de purificação se mostrou eficiente para a proteína de 13 kDa, pois esta se encontrava purificada após esse procedimento (Figura 18 C). Devido à baixa concentração de proteínas e peptídeos na fração protéica, inicialmente não puderam ser avaliadas por espectrometria de massa outras proteínas e peptídeos além das proteínas de 13 e 9 kDa.

No intuito de identificar as proteínas presentes nesse líquido de defesa, a fração protéica também foi submetida ao processo de redução, alquilação e tripsinização. O processo realizado foi semelhante ao preparado para análises das amostras do mioepitélio. Ao ser realizada a análise por espectrometria de massa desses fragmentos, a baixa concentração de peptídeos dificultou as análises, de maneira que poucos espectros de MSMS puderam ser obtidos. Nesse caso, foram identificadas parcialmente duas sequências, no entanto não foi encontrada similaridade destas contra o banco de dados de sequência protéicas de moluscos (Tabela 4).

46

'2 F. Cromatogramas do líquido de defesa de . (A) Cromatograma da fração protéica do líquido de defesa em coluna de fase reversa C4 NST. A seta indica a fração em que foram encontradas duas proteínas, uma de 9kDa e outra de 13 kDa. (B) Cromatograma de UFLC da fração indicada no gráfico (A) em coluna de fase reversa C18. A seta indica a fração em que a proteína de 13 kDa estava purificada. A absorbância foi monitorada a 216 nm (linha vermelha) e 280 nm (linha azul). A linha preta indica a concentração do solvente ACN-0,1% TFA. (C) Espectro de massa da proteína de 13kDa. m/z indica a relação massa e carga.

47 9# B" Fragmentos trípticos obtidos a partir da fração protéica do líquido de defesa de

A sequência do peptídeo com m/z 2098,5 foi apenas parcialmente caracterizada. As sequências apresentadas não possuem similaridade com nenhuma proteína apresentada no banco de dados de proteínas de moluscos.

D"

Moluscos são colonizados por uma diversidade de microrganismos, tanto externamente quanto internamente, nas cavidades corporais e hemolinfa (GONZALEZ ., 2007). Diante de tal fato, o sistema imune desses animais deve ser eficiente para assegurar a homeostase do organismo, promovendo o balanço entre microrganismos comensais e patogênicos (GONZALEZ ., 2007). Na literatura são descritos diversos trabalhos apresentando proteínas com aplicabilidade biotecnológica e envolvidas em mecanismos de defesa no mioepetélio de invertebrados marinhos. Por esses motivos, esse tecido foi escolhido para o desenvolvimento do presente estudo. Outros trabalhos como o realizado por Changzhong e colaboradores (2009) isolaram a partir de vários tecidos do molusco bivalve % , uma proteína designada calcineurina, envolvida no processo de contração muscular e também responsável pela ativação das células T em vertebrados. Outra pesquisa foi capaz de caracterizar uma proteína com atividade antimicrobiana, chamada BPI (

) capaz reconhecer o LPS (lipopolissacarídeo) bacteriano e atuar em tecidos que sofreram injúrias (GONZALEZ ., 2007).

No estudo utilizando foram caracterizadas apenas proteínas relacionadas à contração muscular no tecido mioepitelial (Tabela 3). Diversos trabalhos têm sido apresentados no intuito de se avaliar proteínas envolvidas no processo de contração muscular e compreender seu mecanismo de ação em diferentes classes de animais. Isso se deve a aplicabilidade destes dados para humanos, pois o ancestral comum de vertebrados e

Massa Molecular (Da) Sequência

1363,8 SWDLPPFVDCK

48 invertebrados também possuía músculos, por isso muitas proteínas e genes relacionados ao tecido muscular são extremamente conservados entre os dois grupos (MOTOYAMA * 2006). Ainda pode-se relacionar o incentivo desses estudos ao fato de que muitas doenças musculares estarem relacionadas à estruturação de proteínas musculares, e o estudo destas proteínas utilizando invertebrados como modelo pode auxiliar na compreensão do mecanismo de ocorrência de algumas doenças (HOOPER e THUMA, 2005).

Na atualidade centenas de projetos e pesquisas são iniciados visando descobrir e entender moléculas produzidas pela diversidade biológica. Diante de tal fato, são necessários métodos eficientes para avaliar a eficácia e o uso de tais compostos, como também compreender o papel desempenhado por cada uma desses compostos na natureza (BOHLIN

., 2009; WIELEN e CABATINGAN, 1999). Estudos realizados a partir de moléculas produzidas na natureza têm apresentado uma série de dificuldades a respeito dos processos de purificação e teste de atividade para essas moléculas (WIELEN e CABATINGAN, 1999). A exemplo disso, diversas estratégias têm sido aplicadas para o isolamento de proteínas e peptídeos em invertebrados marinhos. A escolha do método de extração é de grande importância para o isolamento e caracterização de proteínas presentes na amostra, pois o método aplicado pode afetar a solubilização dos compostos da amostra e também realizar a seleção de proteínas com determinadas características físico-químicas no estudo (DEWITT

., 2002).

Para o presente trabalho foi utilizado de tampão fosfato de sódio, juntamente com NaCl para as análises referentes ao tecido mioepitelial de . Esse processo se mostrou eficiente para a observação de proteínas abundantes no tecido mioepitelial do molusco, proteínas de ação muscular. O mesmo processo foi aplicado nos estudos realizados por Motoyama e colaboradores (2007). Nesse trabalho, os referidos autores utilizaram o tampão fosfato acompanhado de 0,6 M de KCl para análise de proteínas como actina e miosina de alguns cefalópodes, como . O uso deste tampão se mostrou benéfico para a avaliação das proteínas de em instrumentos de espectrometria, pois como foi descrito por Teng e colaboradores (2010), a extração de proteínas de tecidos e conservação das mesmas é auxiliada pela utilizando tampão fosfato. No mesmo trabalho ainda são realizadas comparações entre a utilização do tampão fosfato e outros tampões para a extração de proteínas e os dados obtidos confirmam os benefícios da aplicabilidade deste tampão para a extração de proteínas (Teng ., 2010). As vantagens do uso deste tampão também foram ressaltadas por Dewitt e colaboradores (2002), que realizaram um estudo com

49 proteínas musculares de mamíferos. Nesse trabalho foi observado que proteínas musculares apresentavam carga negativa em pH neutro e a utilização do tampão fosfato, juntamente com o sal auxiliam na estabilização das mesmas. Diante de tais fatos, pode-se sugerir que a escolha do tampão fosfato pode ter proporcionado a solubilização de proteínas musculares, que são abundantes no tecido em estudo, e sua seleção na amostra de .

Outras estratégias também têm sido difundidas para o estudo de proteínas em animais marinhos. Como exemplo disso, algumas moléculas têm se mostrado altamente lipossolúveis ou apresentando média solubilidade em meio aquoso. Shimizu relata em seu estudo que no ano de 1985 já haviam sido descritas cerca de 300 compostos derivados de animais marinhos, mas destes apenas seis eram compostos hidrofílicos. Por isso, muitos peptídeos derivados de animais marinhos têm sido isolados a partir de extrações utilizando solventes orgânicos e passos de cromatografia (SHIMIZU, 1985). A exemplo disso, Huang e colaboradores (2004) fizeram uso do solvente acetonitrila para a purificação de peptídeos antimicrobianos em diversas partes (pé, brânquias, manto, e hemócitos) do molusco bivalve . Por meio desta técnica, o extrato bruto é separado em fases, uma fase orgânica, em que são encontrados compostos hidrofóbicos e uma segunda fase, a fase aquosa, em que são encontrados compostos hidrofílicos. Foi observada atividade antimicrobiana em todos os tecidos testados para a bactéria ) (HUANG ., 2004). Iijima e colaboradores (2003) usando esse mesmo tipo de extração, com acetonitrila 60% (v/v) e TFA 0,1% puderam isolar o peptídeo com atividade antimicrobiana e citotóxica dollabelanina B2 dos tecidos de !

.

Um terceiro protocolo proposto para a extração de proteínas em animais marinhos são as extrações ácidas. Diversos pesquisadores têm abordado essa técnica visando a purificação de peptídeos antimicrobianos. Por meio desse processo são favorecidos na amostra compostos carregados ou solúveis em baixos pHs. Ovchinnikova e colaboradores (2006) usaram ácido acetico 5% para a purificação de um peptídeo antimicrobiano de .

Outro passo-chave para a caracterização de proteínas é o processo de separação das moléculas de interesse dos demais produtos presentes na amostra em análise (KIM e MENDIS, 2006). Para a separação de amostras complexas (com grande quantidade de componentes) têm sido aplicados processos cromatográficos como a cromatografia de exclusão molecular. Assim, para o estudo do tecido mioepitelial e o líquido de defesa de

foi utilizada a coluna Superdex G75 (Figura 10 e Figura 14, respectivamente). O processo de gel filtração é um passo preparativo para a purificação de proteínas, entretanto

50 pode fornecer informações importantes para análises, como massa molecular, estado de agregação dos compostos e a cinética dos mesmos (SNYDER , 2010). Esse processo cromatográfico foi capaz de separar diversas proteínas e contaminantes (moléculas que não eram de interesse para a análise) presentes na amostra de tecido de Foi observado por espectrometria de massa e SDS-PAGE que proteínas foram segregadas em frações distintas de acordo com a sua massa molecular. Nas frações iniciais puderam ser observadas proteínas de massa molecular elevada, enquanto nas frações subjacentes a massa de proteínas presentes eram menores (Figura 11). Esse fato possibilitou o direcionamento inicial do trabalho para as frações 4 a 6, que apresentavam apenas peptídeos em sua composição. A utilização da resina Superdex G75 tem se mostrado eficiente para a separação de proteínas de massas moleculares maiores, como de proteínas musculares em peixes e também tem sido aplicada para o isolamento de outras proteínas presentes em tecidos cardíacos, como a mioglobina (RAO e GERDAY, 1973; JOHNSON e READ, 1971). O perfil de eluição observado neste estudo para as proteínas presentes no tecido epitelial de

apresenta semelhança com os perfis cromatográficos observados para outras amostras teciduais, das regiões do manto e pé de moluscos, em que foram identificadas proteínas musculares nas frações iniciais do processo cromatográfico (RAO e GERDAY, 1973).

Alguns trabalhos têm usado a associação de diferentes tipos de resinas cromatográficas para a purificação de proteínas teciduais. O trabalho realizado por Arita e colaboradores (2001), por exemplo, caracterizou a toxina produzida nos tecidos musculares do bivalve / , e para tal foram usadas resinas hidrofóbicas, Phenyl Sepharose e Phenyl Superose, em associação com a cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200. Já para a purificação de tropomiosinas no molusco # , foi usada a resina de troca iônica, Mono Q e a resina de interação hidrofóbica Phenyl TSKgel (Owaza ., 2010). Após o processo cromatográfico de gel filtração, a amostra de

apresentava uma grande diversidade de peptídeos e proteínas em cada fração, fator que dificultava a identificação dos mesmos. A estratégia escolhida para dar continuidade ao trabalho fez uso da cromatografia de fase reversa, com matrizes hidrofóbicas de 4, 8 e 18 carbonos. Cada uma das colunas cromatográficas foi selecionada de acordo com as massas moleculares das proteínas e peptídeos presentes em cada fração. Para as proteínas, presentes