I Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Stricto Sensu Ciências Genômicas e Biotecnologia
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS EM TECIDO MIOEPITELIAL E LÍQUIDO DE DEFESA DE
Brasília - DF 2010
II
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em
Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
III Dissertação de autoria de Caroline Donzeli Pereira, intitulada “Caracterização de Proteínas em epiderme e líquido de defesa de ”, para obtenção do grau deMestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 16 de dezembro de 2010, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
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V 1
Primeiramente agradeço à Deus por ter me dado a oportunidade de começar mais essa jornada científica, me dando forças para caminhar e jamais desistir, mesmo diante das maiores dificuldades.
À minha família que sempre me deu apoio e compreensão. Seu encorajamento foi essencial para ter essa conquista.
À minha orientadora e amiga, Dra. Beatriz Simas Magalhães. Além de compartilhar comigo seu grande conhecimento, se dispôs a se aventurar comigo no desejo de conhecer mais sobre os animais marinhos e mesmo diante de algumas dificuldades, sempre me ajudou a ver uma saída. A ela oferto o meu mais sincero obrigada!
Ao meu Co-Orientador, Dr. Octavio Luiz Franco, que foi sempre para mim como um “pai” no mundo científico e me ensinou a ter a paixão pelas proteínas.
À Dra. Simoni Campos Dias que sempre me ofereceu ajuda em momentos de dúvida e permitiu continuar a trabalhar com animais marinhos.
Aos meus amigos, Kalló, Marcos Leandro, Diogo, Fernanda, Daniele, Akemi, Gustavo e Rafael, que sempre me apoiaram e fizeram a minha vida mais divertida.
Aos meus companheiros de laboratório e grandes amigos, Ludovico, Michelle, Elizabete, Simone, Aline e Suzana, que compartilharam seu conhecimento e amizade, dentro e fora do laboratório. Muitos deles também foram meus companheiros nas madrugadas de trabalho e propiciaram muito divertimento em momentos de conversas filosóficas.
Aos amigos que conquistei no Japão, Daíse, Allan, Marcos, Letícia, Carlos e Marina, que me apoiaram em momentos de muitas mudanças em minha vida.
VI “You have come a long way,
Everything is for today!” HYDE- L’Arc En Ciel
✁✂ ✄☎✆
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(Todos os dias que vivi me fizeram o que eu sou hoje. Apenas por não ser fácil é que continuo seguindo em frente)
VII #<# 4*5 : PEREIRA, Caroline Donzeli. $2 ,: Caracterização de proteínas em mioepitélio e líquido de defesa de . Dezembro, 2010. Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2010.
O ecossistema marinho faz parte do maior sistema aquático do planeta. Desde a antiguidade o homem tem realizado estudos a respeito da biodiversidade marinha e em posse desse conhecimento busca desenvolver produtos biotecnológicos e compreender o seu funcionamento. Dentro do grupo dos invertebrados, o filo é o maior filo em questão de indivíduos depois do grupo dos artropódes, com mais de 50 000 espécies conhecidas com formas de vida e morfologia bem diversificadas. Moluscos e demais invertebrados não possuem anticorpos e são bastante dependentes da imunidade inata. Diante desse fator, o molusco foi escolhido para avaliação e caracterização dos mecanismos de defesa presentes no mioepitelio e líquido de defesa produzido por esse molusco. Para tal, foram utilizados processos cromatográficos de exclusão molecular e fase reversa com foco na caracterização protéica. Essas técnicas se mostraram eficientes para a análise e purificação de moléculas presentes em uma amostra complexa. Foram identificadas as proteínas actina, paramiosina, tropomiosina, filamina e calponina na amostra de mioepitelio. Essas proteínas estão envolvidas no processo de contração muscular, mas também desempenham papéis de mediadores de algumas reações do sistema imune. Em relação ao líquido de defesa, sua composição protéica não é bem definida na literatura. Diversos artigos relatam a presença de uma proteína de 60 kDa que possui atividade contra vírus, bactérias e células tumorais. Entretanto o presente estudo demonstra uma maior diversidade de proteínas e peptídeos ainda não descritos. Para a análise desta amostra também foram utilizadas as técnicas de cromatografia de exclusão molecular e fase reversa. Uma proteína de 13 kDa pôde ser purificada utilizando tais processos. Os dados obtidos neste estudo representam uma primeira tentativa de complementar os trabalhos a respeito dos mecanismos moleculares de defesa
presente no molusco .
8 05( 8# = , mioepitélio, líquido de defesa, glândula opalina e
VIII The marine ecosystem is the largest aquatic system on the planet. Thus, men have searched for a better understanding of the marine environment since early civilizations. The Molusca’s phylum is the largest phylum after the Arthropoda’s phylum. More than 50,000 species are known with different ways of life and diverse morphologies. The Gastropoda class is the most common and varied marine life among molluscs. Invertebrates are highly dependent on innate immunity to defend themselves against pathogenic microorganisms. Considering this factor, the mollusk was chosen for the evaluation and characterization of possible protein related defense mechanisms. The protein content of the epithelial tissue and ink produced by the defense mollusk is characterized in this study. To purify these proteins and peptides size exclusion and reverse phase chromatography techniqueswere used. Both methods have been proven successful to analyze and purify molecules present in this complex sample. Actin, tropomyosin, paramyosin, filamin and calponin were identified in the skin sample. These proteins are involved in muscle contraction processes, but also play key roles asimmune system mediators. In relation to the ink defense, the protein composition is not well characterized in the literature. Several articles have been reported a 60 kDa protein that has biological activity against viruses, bacteria and tumor cells. However, the present study shows that there are other proteins and peptides that haven’t been described in the literature. To evaluate this sample, techniques such as size exclusion and reverse-phase chromatography were also employed. A 13 kDa protein was successfully purified using this protocol. These data allow for a better comprehension about the physiological and defense mechanisms present in the mollusk .
>#? @, + : , epithelial tissue, defense liquid, innate immune
IX 1
'2 " Desenho em cerâmica feito por habitantes da Micronésia ilustrando lendas sobre
alguns animais marinhos. ... 1
'2 " Anatomia de um molusco, em que a figura apresenta um representante da classe
Gastropoda como indivíduo modelo...4
'2 A. Exemplares de algumas classes de moluscos ...5
'2 B. Fotos de alguns membros da Classe Gastropoda. ... 7
'2 C" Representação das moléculas de metabólitos secundários isoladas em moluscos do
gênero . . ... 154
'2 D" Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos dos peptídeos com atividade
antimicrobiana do filo Molusca.. ... 176
'2 E. Representação das estruturas tridimensionais de alguns peptídeos com atividade
antimicrobiana encontrados em moluscos.. ... 187
'2 F" Molusco .. ... 23
'2 G. Posicionamento das glândulas opalina e púrpura no corpo da
...26
'2 . Cromatograma de exclusão molecular em Superdex G75. ... 36
'2 . Gel SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de exclusão molecular de
epiderme de .. ... 36
X '2 A. Cromatograma da fração 2 em coluna C8 Vydac...39
'2 B" Alinhamento das sequências de tropomiosina de contra
tropomiosinas alergênicas de outros moluscos, , ,
, . ...41
'2 C. Cromatograma de exclusão molecular numa coluna Superdex G75 do extrato
bruto do líquido de defesa de ... 42
'2 D. Fotografia da coluna de Exclusão Superdex G75 durante o processo
cromatográfico com a amostra de líquido de defesa de . ... 43
'2 E"Gel SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de exclusão molecular do liquido de defesa de .. ... 43
XI 9# . Peptídeos bioativos encontrados em moluscos. ... 21
9# . Principais componentes químicos presentes na glândula opalina e no líquido de defesa produzido por .. ... 30
9# A" Peptídeos e seqüências obtidas a partir do seqüenciamento de proteínas da epiderme de . . ... 41
9# B" Fragmentos trípticos obtidos a partir da fração protéica do líquido de defesa de
XII H
ACN. Acetronitrila
ATP. Adenosina Tri-Fosfato
C1. Molécula 1 do sistema do complemento C3. Molécula 3 do sistema do complemento C5. Molécula 3 do sistema do complemento CaM. Proteína Calmodulina
CH. Domínio da Calponina de ligação a actina cm. Centímetros
cvSI-1. Inibidor de proteases isolado a partir de Cys. Aminoácido cisteína
Da. Dalton
DNA- Ácido desoxirribonucléico DTT. 1,4-Dithioerythritol
g. Gravidade
Gene RAS- Rat Sarcoma genes Gly. Aminoácido glicina Glu. Aminoácido glutamina H1. Isoforma 1 da Calponina H2. Isoforma 2 da Calponina H3. Isoforma 3 da Calponina HCl. Ácido Clorídrico
H2O2. Diidróxido de oxigênio
HPLC (Cromatografia líquida de alta pressão)
IFN- Interferon
IgE. Imunoglobulina E IgG, Imunoglobulina G Intens. Intensidade KCl. Cloreto de Potássio kDa. Quilo Daltons
XIII LPS. Lipopolissacarídeos
LRR. Leucin Rich Repeats (Domínios ricos em leucina) Lys. Aminoácido lisina
M. molar
mA. Miliamperes
MALDI-ToF/ToF. ! " # $ % & (Dessorção/
Ionização a Laser Assistida por Matriz)
MAP-quinase. (Proteíno-quinases ativadas por mitógenos) mAU. Mili Arbitrary Units(Unidade Mili-arbitrária)
Met. Aminoácido metionina
MHC. Cadeia pesada da proteína miosina mg. Miligramas
mol/L. Moléculas por Litro mM. Mili-Molar
mL.min- 1 . Mililitros por minuto µL . Microlitros
µm. Micrômetros
µg.mL-1 Microgramas por Litro MS. Espectrometria de Massa m/z. Razão massa sobre carga
NCBI. National Center for Biotechnology Information NaCl. Cloreto de Sódio
NADPH. Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate-Oxidase (Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato Oxidase)
NK. ' ( (células do sistema imune) nm. Nanômetros
O2Oxigênio reativo 1
O2 . Singleto de oxigênio OHCL. Ácido hipoclorito -OH. Radical hidroxil
pH. Potencial hidrogênio iônico
PDB. !
XIV ROS. Espécies reativas de oxigênio
RPM. Rotações por minuto
SDS-PAGE. ! % ) (Gel de Sódio Dodecil Sulfato de
Poliacrilamida)
Sr90- Elemento quimico estrôncio TCA. Ácido Tricloroacético TFA. Ácido Trifluoroacético TPM. Proteína tropomiosina
UFLC. Ultra Fast Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida Ultra Rápida) V. Volts
XV
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. CONHECENDO OS MOLUSCOS ... 3
1.1.1. Classe Gastropoda ... 7
1.2. SISTEMA IMUNE DE GASTROPODA ... 9
1.3. MOLÉCULAS BIOATIVAS EM MOLUSCOS ... 111
1.3.1. Metabólitos secundários... 133
1.3.2. Proteínas e peptídeos ... 166
1.3.2.1. Antimicrobianos protéicos...16
1.3.2.2. Proteínas e peptídeos ativos no sistema nervoso...20
1.3.2.3. Hemaglutinantes...22
1.3.2.4. Proteínas com atividade enzimática...22
1.3.2.5. Inibidores de proteases...23
1.4. MECANISMOS DE DEFESA DE . ... 244
1.4.1. Produção do líquido de defesa ... 266
1.4.2. Composição do líquido de defesa: pigmentos ... 288
1.4.3. Composição do líquido de defesa: compostos nitrogenados ... 299
2. JUSTIFICATIVA ... 311
3. OBJETIVOS ... 322
3.1. OBJETIVOS GERAIS ... 322
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 322
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 322
4.1. COLETA DO ORGANISMO DE ESTUDO ... 322
4.2. RETIRADA DO TECIDO E EXTRAÇÃO PROTÉICA ... 333
4.3. QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA...33
4.4. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR ... 33
4.5. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA ... 344
4.6. ANÁLISE DE MASSA MOLECULAR POR SDS-PAGE ... 34
4.7. ANÁLISES POR ESPECTOMETRIA DE MASSA E SEQUENCIAMENTO ... 355
4.8. ANÁLISES ... 366
5. RESULTADOS ... 36
5.1. EPIDERME ... 36
5.2. LÍQUIDO DE DEFESA ... 43
6. DISCUSSÃO ... 477
7. CONCLUSÕES ... 62
8. PERSPECTIVAS ... 633
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 644
1
"
O ecossistema marinho faz parte do maior sistema aquático do planeta. Esse sistema é composto por oceanos, estuários, recifes de corais e a costa propriamente dita, abrigando milhares de espécies de animais e microrganismos, que representam dois terços da diversidade da Terra (U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 2010, CASTRO E HUBER, 2003, SPONGA * 1999).
Nesse sentido, o desejo de entender o ambiente marinho acompanha o homem desde o surgimento das primeiras civilizações, em que diversos estudos demonstraram como povos antigos ilustravam as práticas e seus conhecimentos sobre organismos marinhos (Figura 1). No Egito, por exemplo, foi encontrada na tumba de um faraó uma advertência quanto ao consumo de baiacu, um peixe venenoso. Mais adiante, Aristóteles descreveu muitas formas de vida marinhas e suas descrições são consideradas precisas até os dias de hoje, por isso ele é tido como um dos primeiros biólogos marinhos. Já um dos mais famosos pesquisadores do ambiente marinho, Charles Darwin, fez importantes contribuições para o entendimento sobre como ocorre à formação dos atóis e sobre a origem dos organismos planctônicos (CASTRO e HUBER, 2003).
2 Hoje, acreditam-se que a biodiversidade presente no ecossistema marinho e descrita desde o início do século passado, é propiciada por diversos fatores, entre eles as correntes marinhas, as variações de temperatura e de salinidade nos mares (U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 2010; CASTRO e HUBER, 2003). As correntes marinhas são produzidas devido à ação dos ventos, e a maior movimentação das águas marinhas ocorre na superfície. Dessa forma a corrente de água assim criada ajuda no transporte de calor e nutrientes. A diversidade marinha também está diretamente relacionada com a variação de temperatura no ambiente marinho. Muitos organismos marinhos estão adaptados a viver em uma determinada faixa de temperatura, como por exemplo, os organismos que residem no ártico. Estes animais possuem enzimas específicas que atuam melhor a baixas temperaturas ao contrário de organismos adaptados a ambientes tropicais (CASTRO e HUBER, 2003).
Estudos realizados no intuito de quantificar a real diversidade marinha mostram que para alguns vertebrados, como os peixes, existem 27 mil espécies ao redor do mundo, das quais 58% seriam residentes em ambiente marinho (CASTRO e HUBER, 2003). Já com relação aos organismos microscópicos existe uma estimativa que na coluna de água ocorram cerca de 105 ou 106 microrganismos por mL de água (BENKENDORFF, 2010). Alguns destes podem se relacionar de maneira positiva ou negativa com os animais residentes no ambeinte marinho. Microrganismos simbiontes podem estar intimamente associados a alguns animais, como no caso do molusco conhecido como teredo, em que a bactéria $ , auxilia na digestão de madeira (CASTRO e HUBER, 2003). No entanto, outros microrganismos podem causar diversas doenças. A bactéria Gram-positiva + * encontrada comumente no ambiente marinho, é causadora de diversas doenças em vertebrados e invertebrados, como sintomas de inflamações no sistema gastrointestinal e epiderme (AUSTIN E ZHANG, 2006). Além disso, moluscos da classe Bivalvia, mostram-se
suscetíveis a ação de protozoários como (, * * ) e
- ., além de muitas bactérias do gênero * * + e
3 O estudo e compreensão do ambiente marinho e seus organismos residentes tem proporcionado importantes informações e descobertas em várias áreas de estudo, como a ecologia, zoologia, geologia, biologia molecular entre outras (MANN e LAZIER, 2006; LI e QUIN, 2005). De forma mais específica, uma das áreas de interesse consiste em compreender como o sistema de defesa de invertebrados atua em face de diversos microrganismos patogênicos presentes em seu ambiente. Moluscos e crustáceos, por exemplo, são amplamente usados como modelos genéticos e moleculares para estudos das reações do sistema imune, pois apresentam reações conservadas e características entre os invertebrados. Estes animais dependem apenas de sua imunidade inata para se defenderem de patógenos (BETTERNCOURT * 2007), e entre as estratégias adotadas está a produção de moléculas capazes, não somente são de ajudar na compreensão do funcionamento desses ecossistemas e sua biogeoquímica, mas também são importantes por possuir um grande potencial biotecnológico para o desenvolvimento de fármacos (KENNEDY * 1988; DEFER * 2009) .
1.1. CONHECENDO OS MOLUSCOS
O filo é o maior filo depois do filo do . Mais de 50 000 espécies são conhecidas e estas possuem formas de vida e morfologia bem diversificadas. Podem ser encontrados neste filo desde representantes microscópicos, como a larva do caramujo , até lulas gigantes, do gênero , que podem medir cerca de 20 metros de comprimento. Os moluscos são encontrados em diversos habitats, dos trópicos aos pólos, mas a maioria vive no ambiente marinho e apresenta uma grande diversidade de hábitos de vida (BENKENDORFF, 2010). Estes podem ser comedores de materiais depositados no sedimento, cavadores, perfuradores e pelágicos (HICKMAN ., 2004; RUPERT e BARNES, 1996; BENKENDORFF, 2010).
4 como o manto, que é uma região protetora formada pela projeção de duas pregas da epiderme. Nesta cavidade podem ser encontradas as brânquias ou pulmões e certas glândulas, por isso evolutivamente, muito moluscos desenvolveram conchas para proteger essa região (HICKMAN ., 2004, MOORE, 2006, CASTRO e HUBER, 2003). Outra estrutura característica é a rádula, que possui um formato linguiforme e é protátil, sendo utilizada para raspagem do substrato (HICKMAN ., 2004, MOORE, 2006, CASTRO e HUBER, 2003).
5 vertebrados, esse tecido está presente próximo a glândulas, auxiliando na liberação do produtos das mesmas (GARTHER e HIATT, 2006). De acordo com Garther e Hiatt, as células que compõe o tecido mioepitelial apresentam grande quantidade das proteínas actina e miosina. Nesse tecido também são encontrados outras proteínas relacionadas ao processo de revestimento e proteção, indicando a origem epitelial deste tecido (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
6
'2 A" Exemplares de algumas classes de moluscos. (A) ' ., representante da
7 Os moluscos são representantes do segundo nível trófico da cadeia alimentar e servem como um elo entre os produtores e os grandes consumidores, como peixes e aves (GERÁD
., 2009). Por essa razão, eles costumam ser utilizados para estudos como indicadores ambientais, pois modificações ambientais podem resultar em mudanças na estrutura das comunidades (FRANTSEVICH ., 1996). Em muitos ambientes os moluscos desempenham uma função de engenheiros do ecossistema, ou seja, são capazes de criar ou modificar o habitat para outras espécies. Isso acaba por afetar diretamente a qualidade do ambiente. Estes animais são capazes de retirar partículas suspensas do meio e ajudam no controle a floração de algas (SOKOLOVA, 2009). Os moluscos são capazes de acumular altos níveis de poluentes, como metais pesados e cianotoxinas, adquiridos pela alimentação ou pela absorção via epiderme (GERÁD ., 2009 e FRANTSEVICH ., 1996). Frantsevich (1996) cita em seu trabalho que estudos realizados com moluscos residentes em áreas próximas à usina nuclear de Chernobyl apresentaram modificações na estruturação da concha devido à ação de Sr90, que dificultava a absorção e a cristalização do cálcio para a formação da concha.
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8 Os gastrópodes podem ser divididos em três subclasses: Prosobranchia, Opsithobranchia e Pulmonata. Na primeira classe são encontrados os gastrópodes que realizam respiração branquial, e as brânquias juntamente com o ânus se localizam na parte anterior do corpo (gastrópodes em que a torção do corpo é bem evidente). A segunda classe apresenta uma distorção do corpo, ocorre uma redução da concha e da cavidade do manto, como pode ser observado nas lebres-do-mar e lesmas-do-mar (Figura 4). Já os caracóis fazem parte da terceira subclasse, os Pulmonatas, que também não apresentam torção, não são observadas brânquias e os pulmões deram lugar à cavidade do manto (Figura 4 - RUPERT e BARNES, 1996; MOORE, 2006).
Os Prosobrânquios possuem o sistema de respiração branquial e circulação mais simples dentro da classe Gastropoda. Os Opistobrânquios são uma subclasse predominante marinha. Estes moluscos destorcidos possuem a cavidade do manto e seus órgãos posicionados do lado direito do corpo. Isso é observado em sua morfogênese, em que estes sofrem apenas uma torção de 90º ao invés da torção de 180º graus encontrada nos Prosobrânquios. Essa perda da torção pode estar relacionada à perda da concha e ao desenvolvimento de defesas químicas. Dentro da ordem Cephalaspidea encontra-se o maior número de Opistobrânquios e a ordem Anapsida contém as lebres do mar, os Opistobrânquios que podem assumir o maior tamanho (até 40 cm). Nesses indivíduos a concha reduzida pode ser encontrada dentro do manto ou é inexistente. O corpo apresenta simetria bilateral (RUPERT e BARNES, 1996).
9 1.2. SISTEMA IMUNE DE GASTROPODA
O sistema imune é constituído pelas células e moléculas responsáveis por respostas de defesa. Este sistema pode atuar por dois mecanismos: a imunidade inata e a imunidade adquirida (ABBAS ., 2008). Abbas e colaboradores (2008) definem a imunidade inata como a atuação do sistema imune de maneira inespecífica, com uma baixa capacidade de discernir entre diferentes microrganismos patogênicos e sem especificidade de resposta (BAYNE * 2001). Barreiras físicas e químicas, proteínas e células fagocitárias são os principais agentes do sistema imune inato. Já a imunidade adquirida é caracterizada pela especificidade da forma de atuação contra cada patógeno e a presença de memória imunológica, de maneira que o organismo é capaz de lembrar da exposição ao agente infeccioso e atuar de maneira mais vigorosa sobre ele. Linfócitos e anticorpos, produzidos por essas células, são os principais componentes da imunidade adquirida (ABBAS ., 2008).
O sistema imune teve sua evolução imposta pelos microrganismos infecciosos. Para tal, os organismos multicelulares acabaram por desenvolver mecanismos de defesa para eliminar eficientemente os invasores, protegendo o hospedeiro (MEDZHITOV e JANEWAY, 1997; BARTL ., 2003, SCULENBURG ., 2007). Diante de tal fator, foi proposta a teoria de que existe um mecanismo de co-evolução entre parasita e hospedeiro. Esse mecanismo permitiria a rápida adaptação do parasita às defesas do hospedeiro, mas ao mesmo tempo ocorreria a seleção dos hospedeiros que seriam capazes de produzir respostas de defesa mais específicas (SCHULENBURG ., 2007). O sistema imune inato é essencial para a sobrevivência dos organismos multicelulares. Moluscos da classe Gastropoda, por exemplo, são capazes de sobreviver ao desenvolvimento de cerca de 18 mil espécies de trematódeos. Outros invertebrados encontraram a resposta para garantir a sua sobrevivência realizando simbiose com bactérias, por exemplo. Esses microrganismos, além de serem fonte de compostos ativos, também impedem a colonização de seus hospedeiros por patógenos (LOKER , 2004). Como exemplo disso pode ser citada a relação entre bactérias e esponjas. De acordo com Hochmuth e Piel (2009), cerca de 40% do peso seco desse animal é composto por microrganismos procarióticos simbiontes.
10 reconhecimento de estruturas moleculares dos agentes infecciosos (epítopos) e a atividade deste sistema pode ser ampliada elevando-se os níveis de receptores ou combinações de receptores (BETTERNCOURT * 2007 e IWANAGA e LEE, 2005). Geralmente, as reações do sistema imune inato envolvem a produção de compostos reativos de oxigênio (ROS), capazes de eliminar os microrganismos infecciosos. Muitos invertebrados podem também produzir em sua hemolinfa peptídeos biologicamente ativos contra infecções bacterianas (BETTERNCOURT * 2007, DU PASQUIER, 2001). As moléculas presentes nessa hemolinfa servem como barreira para a atuação do patógeno no organismo, de maneira que esses compostos circulantes levam apenas minutos ou poucas horas para eliminarem o invasor (BAYNE * 2001). Há alguns anos, postulava-se que esses mecanismos eram de grande eficiência, mas não possuíam a alta especificidade e a memória imunológica observada em vertebrados (BARTL , 2003). Porém, Schulenburg e colaboradores (2007) demonstraram que invertebrados são capazes de produzir respostas bastante específicas, pois pesquisas realizadas com moluscos e ouriços demonstraram que quanto maior o nível de exposição destes organismos à patógenos, maior será a produção de receptores novos ou putativos para o reconhecimento de microrganismos infecciosos. Mecanismos de sinergismo do hospedeiro, diversificação genética e efeitos de dosagem do parasita, favorecem as interações de parasitas específicos com o pequeno número de moléculas produzidos pelos invertebrados (SCHULENBURG ., 2007).
11 fagocitose (BAYNE * 2001; BECKMANN ., 1992). Foi identificado que os hemócitos apresentam atração citoquímica pelas células bacterianas e de fungos (BECKMANN ., 1992). Quando esse reconhecimento ocorre, os hemócitos rapidamente realizam exocitose de compostos granulares S e L (proteínas de defesa que variam de 8 a 120 kDa - IWANAGA e LEE, 2005; RUSSO , 2007). Em diversos estudos utilizando moluscos, estas células foram caracterizadas como as principais linhas de defesa contra microrganismos (KOSOLOVA, 2009).
A produção de ROS (espécies reativas de oxigênio) pelos hemócitos é dada por um complexo da NADPH oxidase, presente na membrana plasmática dos hemócitos. Esse complexo catalisa a produção do superóxido (O2-), que é utilizado para a produção das demais espécies reativas, como peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (-OH), ácido hipoclórico (OHCL) e singleto de oxigênio (1O2). Cada uma dessas espécies oxidantes pode ter diversificadas propriedades, causando peroxidação de lipídeos, quebras no DNA e inativação de enzimas do patógeno (BAYNE * 2001). De acordo com Kosolova (2009), a eficiência do sistema imune de moluscos foi o que lhes permitiu colonizar uma grande diversidade de habitats. Além do valor econômico da criação de moluscos e desenvolvimento de medicamentos a partir de moléculas produzidas por moluscos, estes animais são vetores de transmissão de alguns patógenos e parasitas para humanos e animais doméstico. Ao entender os mecanismos de defesa de moluscos podem-se compreender os mecanismos de resistência e transmissão a doenças, aumentar a taxa de sobrevivência de moluscos de grande importância econômica, como ostras e caracóis (KOSOLOVA, 2009, OTTAVIANI 2006). Por mais que os mecanismos de defesa de moluscos sejam limitados quando comparados a artrópodes e vertebrados (IJIMA ., 2003), o sistema imune inato e outras formas de defesas desenvolvidas por esse animais marinhos permanecem uma fonte de moléculas biológicas com funções diversas.
1.3. MOLÉCULAS BIOATIVAS EM MOLUSCOS
12 metabólica. Isto propicia que as milhares de espécies de fungos, insetos, plantas e organismos marinhos tornem-se reservatórios biológicos e químicos de moléculas que podem ter uma ampla aplicabilidade biotecnológica (BOHLIN ., 2010). Estudos ecológicos, toxicológicos e filogenéticos são utilizados como ferramentas na prospecção da biodiversidade para a busca de compostos inovadores e esses processos têm aumentado a quantidade de moléculas caracterizadas em animais e que possuem aplicabilidade biotecnológica (BOHLIN ., 2010; FOLMER ., 2008).
Atualmente, grupos de pesquisa direcionam suas forças para a descoberta de novas moléculas com uma atividade biológica que possam ser aplicadas de maneira segura e satisfatória para o tratamento de doenças humanas (SCHNEIDER e BÖHM, 2000). Pesquisas são realizadas no intuito de desenvolver estratégias para a seleção, purificação e caracterização de moléculas que possam se tornar potenciais medicamentos, de maneira a entender seus prováveis alvos e melhorar a atividade destes compostos produzidos pela natureza. Estudos utilizando animais marinhos têm demonstrado que estes animais são capazes de produzir uma grande quantidade de moléculas que podem ter aplicabilidade farmacológica. Essas moléculas possuem atividade contra microrganismo, afetando o crescimento de bactérias, fungos e leveduras. O aumento do número de microrganismos resistentes devido ao uso indiscriminado de antibióticos e a busca por tratamento de doenças infecciosas também têm acelerado o processo para a descoberta de novas moléculas de origem natural ativas contra microrganismos (BOHLIN ., 2010).
Algumas moléculas envolvidas nesses processos têm sido identificadas e caracterizadas, a exemplo de peptídeos, proteínas, terpenos, compostos derivados de ácidos graxos, polipropionatos e esteróis (DEFER * 2009). Muitas dessas moléculas são conservadas em invertebrados e também em vertebrados (OTTAVIANI, 2006; HANCOCK ., 2006). Entender como ocorre à produção e a forma com que estas moléculas atuam são de extrema importância para compreender a função destes compostos no sistema imune destes animais e entender a sua evolução até o grupo dos vertebrados. Nesse aspecto, Otero-González e colaboradores (2010) revisam que muitos peptídeos antimicrobianos obtidos em animais marinhos possuem atividade imunomodulatória em mamíferos, e peptídeos de estrutura semelhantes, além de possuir tal atividade, são capazes de desempenhar funções de quimiotaxia, auxiliar na apoptose, transcrição de genes e produção de citocinas (HANCOCK
13 "A" " #$ 9/ $, #52*+7 ,
Metabólitos secundários são compostos orgânicos que não estão envolvidos diretamente nos processos de reprodução, crescimento, defesa e desenvolvimento dos seres vivos. Isso significa que a ausência desses compostos não ocasiona a morte do organismo, entretanto esta ausência pode afetar a sobrevivência e fecundidade do mesmo (RAVEN ., 2001). Muitos animais, principalmente invertebrados, são capazes de secretar metabólitos secundários produzidos por plantas em beneficio próprio. Estes animais são capazes de acumular em seus tecidos, toxinas adquiridas por meio da dieta e utilizar esses compostos como defesas químicas contra predadores (COELHO , 1998). No caso de moluscos, acredita-se que esses metabólitos venham da assimilação de algas ou também devido a associações com microrganismos simbiontes (IOANNOU ., 2009). Em - , por exemplo, foi isolado um fungo, * presente na pele deste molusco, capaz de produzir um metabólito denominado pericosina (Figura 5A), ativo contra células tumorais (YAMADA , 2007). Os metabólitos secundários têm demonstrado ser de grande importância na defesa contra predadores e na competição interespecífica (RAVEN
., 2001; PAWLIK, 1993). A presença dos metabólitos pode estar relacionada à ausência de defesas físicas, pois uma grande quantidade de compostos é produzida por esponjas, tunicados, cnidários e moluscos (PAWLIK, 1993). Nos ovos do molusco ! * por exemplo, ocorrem metabólitos, sesquiterpenos, que evitam o consumo dos ovos por predadores (GAVAGNIN ., 2001). Muitos dos medicamentos prescritos na atualidade foram produzidos a partir de metabólitos secundários produzidos por plantas, animais marinhos e microrganismos (FOLMER ., 2008). Uma grande fonte de compostos secundários ativos contra células cancerígenas é descrita em moluscos e animais sésseis, que usam a toxicidade dos metabólitos secundários para se defenderem de predadores (FOLMER
., 2008).
Sesquiterpenos são encontrados em diversos moluscos. Já em 1982 haviam sido reportados mais de 100 metabólitos secundários nesse filo. Em nudibrânquios, como o , , residente na Antártica, foi isolado o sesquiterpeno Hodgnosal (IKEN
14 organização, manutenção e diferenciação das células neuronais (TSUKAMOTO * 2004). No ano de 2010, Yamada e colaboradores isolaram em - mais alguns metabólitos, Aplyronina A e Aplyronina B-H (Figura 5D). Estes compostos são uma mistura de ésteres e aminoácidos e possuem atividade contra células tumorais, como células de linhagem de leucemia e de câncer de pulmão (YAMADA ., 2010).
15 '2 C" Representação das moléculas de metabólitos secundários isoladas em
moluscos do gênero . (A) Pericosina, metabólito produzido pelo fungo
16 "A" " ,$# * # :#:$ +#,
1.3.2.1. Antimicrobianos protéicos
Dentre as proteínas e peptídeos mais descritos em moluscos estão os peptídeos antimicrobianos, que além de causarem lise ao atuar diretamente na membrana lipídica de microrganismos (DUTTON ., 2002 e BATTISON * 2008), estão envolvidos na capacidade de modular o sistema imune inato e adaptativo em muitos invertebrados (HANCOCK e LEHRER, 1998).
A maioria dos peptídeos antimicrobianos tem como característica serem moléculas catiônicas em pH neutro, embora também tenham sido encontrados peptídeos com propriedades bactericidas de carga aniônica ou neutra (DUTTON * 2002). Em relação à estrutura dessas pequenas moléculas, os peptídeos antimicrobianos podem ser divididos em quatro grandes famílias: peptídeos que formam alfa-hélice, peptídeos que contêm folhas ß, peptídeos que possuem resíduos de cisteína e peptídeos com posições não usuais de aminoácidos (como prolina e glicina- LI ., 2008). Dentre esses grupos, os peptídeos antimicrobianos ricos em cisteína, as defensinas, são os mais estudados e caracterizados, por se encontrarem amplamente distribuídos entre os reinos animais e vegetais (LI ., 2008). As pontes dissulfeto presentes nesses peptídeos permitem uma grande estabilidade dessas moléculas e proteção da estrutura protéica contra proteólise (LI ., 2008,– Figuras 6 e 7).
17
18
'2 E. Representação das estruturas tridimensionais de alguns peptídeos com atividade antimicrobiana encontrados em
moluscos. (A) Mitilina- B (PDB 2EE), encontrada no molusco ; (B) Cg-defensina, encontrada no molusco
(PDB 2B68); (C) MDG- 2, antimicrobiano encontrado no molusco (PDB 1FJN);
19 Outros mecanismos de atuação propostos para estas moléculas incluem a capacidade de interagir com o DNA e RNA depois de entrar nas células impedindo a transcrição e tradução (PAN ., 2004). Ainda existe a possibilidade desses peptídeos se ligarem às proteínas intracelulares e alterarem mecanismos da via metabólica do microrganismo (BATTISON
* 2008).
Diversos peptídeos com atividade antibacteriana e antiviral já foram descritos na hemolinfa de moluscos, como os descritos em lebres-do-mar e bivalves (KREIL, 1997; DEFER , 2009). O peptídeo sintético Mitilina B (Tabela 1), derivado de
, apresenta atividade contra o vírus WSSV (White Spot Syndrome Vírus – DEFER , 2009). Atividade anti-HIV também foi descrita nos moluscos ,
e na secreção de defesa produzida por , (RAJAGANAPATHI ., 2002). Essa proteína observada em , * possui 60 kDa e é chamada de Bursatellanina-P. Ela é capaz de inibir a ação da enzima transcriptase reversa de vírus (RAJAGANAPATHI ., 2002; MAYER * 2007). Não só atividade antiviral tem sido encontrada em moléculas isoladas de moluscos como também atividade antifúngica e antineoplasmática (MAYER * 2007). A exemplo disso nas lebres-do-mar, !
e - , foram isolados compostos protéicos com estas atividades a partir das células do fluido celômico. Em ! foi descrito o peptídeo dollabelina (Figura 6 e Tabela 1) que possui 100% de inibição do crescimento de , , % # e + % (MAYER * 2007). Já no muco do caramujo gigante africano, % , foi observada a presença de uma glicoproteína com atividade bactericida (TINCU, 2004). Outro peptídeo obtido em ! é a dolastina 10 (MAYER * 2007), primeiramente designada com atividade anti-câncer, pois é capaz de inibir a síntese de tubulina. Entretanto esse peptídeo tem se mostrado mais eficiente que os medicamentos atualmente utilizados para o tratamento de câncer (MEYER * 2007; MAYER e GUSTAFSON, 2008). Também foi observado que essa molécula também impede o desenvolvimento da malária, inibindo o desenvolvimento de & (MAYER * 2007). Esse processo se dá, pois o peptídeo impede o desenvolvimento do parasita dentro do eritrócito, pois as fases iniciais de desenvolvimento desse microrganismo são dependentes de
tubulina (MAYER * 2007). A partir do molusco , também foi
20 $ (MAYER * 2007). Mayer e colaboradores (2007) apresentam que o peptídeo de . ) é capaz de se ligar a membrana plasmática do parasita e alterar a sua fluidez.
1.3.2.2. Proteínas e peptídeos ativos no sistema nervoso
Um grande número de artigos cita a produção de toxinas por animais marinhos. Cerca de 10.000 espécies de caramujos são conhecidas por produzir toxinas que são utilizadas para a caça e defesa (HERALD III , 2008). Moluscos do gênero são capazes de produzir grandes quantidades de neurotoxinas. Essas toxinas são capazes de bloquear canais iônicos e a passagem de estímulos nervosos de um neurônio a outro (JIMENEZ ., 2003). Uma vez a presa encontrada, o molusco rapidamente injeta o veneno e este ocasiona uma rápida despolarização dos axônios presentes no local em que o veneno foi injetado (JIMENEZ ., 2003). Esse processo é ocasionado pela inativação dos canais de sódio e potássio (JIMENEZ ., 2003). A partir do peptídeo isolado de , foi produzido um peptídeo sintético o ziconotídeo, que é um poderoso analgésico, pois atua diretamente nos canais de voltagem tipo-N sensíveis a cálcio, nos dendritos e sinapses, impedindo a passagem de neurotransmissores nociceptivos (STAATS * 2004). Atualmente esse peptídeo foi aprovado para uso clínico. Esse é o primeiro medicamentos derivado de compostos provenientes de animais marinhos (BENKENDORFF, 2010). Em também foi isolado um peptídeo citolítico, melitina, similar ao veneno produzido pelas abelhas ( 0% ) que é utilizado em sua defesa (BIGGS ., 2004). Peptídeos neuroativos foram observados também no caramujo gigante % , capazes de controlar a contração muscular nestes moluscos (KREIL, 1997).
21
9# "Peptídeos bioativos encontrados em moluscos.
,$# * I :#:$ +#, :J5 #
&, #52 - .
$ 8 + +# , /' 5
$ 2$2 #<# 4*5
Dolabellanina B2 ! 3872 Antibacteriana,
Antifúngica
Folhas –β, pontes dissulfeto, sulfoxido
de metionina
MITTA ., 2000.
Defensina A 4314 Antibacteriana Folha –β e α-hélice GESTAL ., 2007.
Defensina B 4392 Antibacteriana Folha –β e α-hélice GESTAL ., 2007.
Mitilina A 3774 Antibacteriana Folha –β e α-hélice GESTAL ., 2007.
Mitilina B 3974 Antibacteriana Folha –β e α-hélice GESTAL ., 2007.
MGD-1 4416 Antibacteriana,
Antifúngica
Folha –β e α-hélice KANG ., 2006.
MGD-2 4343 Antibacteriana,
Antifúngica
Folha –β e α-hélice KANG ., 2006.
Cg-Def 4638 Antibacteriana,
(G+) (G-), Antifúngica
Cys7- estabilizando
motivos α-β
ALTINCICEK ., 2007.
CmPI-II 5576 e 5469 Inibidor de
proteinases
Pontes dissulfeto, Folha –β e α-hélice
GONZÁLEZ ., 2007
Omega-conotoxina MVIIC
3071 Neurotoxina Pontes dissulfeto e
Folhas –β
22 1.3.2.3. Hemaglutinantes
Foram observadas em moluscos a presença de proteínas com características hemaglutinantes (MELO * 2000; WEIS * 1998). Dentre essas proteínas estão as lectinas. Lectinas já foram descritas em diversos organismos, como plantas, animais e microrganismos (KHEEREE ., 2010). Essas proteínas são de origem não-imune e são capazes de reconhecer carboidratos e se ligarem a estes açúcares (DIAS, 2006; WEIS * 1998; KHEEREE ., 2010). Essa ligação é específica é de alta afinidade, e para tal não é necessária nenhuma modificação química no processo (DIAS, 2006; KHEEREE ., 2010). Entretanto essa ligação é reversível (DIAS, 2006). O processo de aglutinação ocorre, pois as lectinas são capazes de interagir com os glicoconjugados presentes na superfície da membrana celular, promovendo a ligação cruzadas entre as células presentes no meio (DIAS, 2006). As lectinas estão presentes em muitos tecidos de animais (WEIS * 1998) e são de grande importância nas respostas imunes, pois ajudam no reconhecimento e neutralização do patógeno em tecidos e em fluidos corporais, pois são capazes de discernir entre o próprio e o não-próprio (WEIS * 1998; KHEEREE ., 2010). Outras proteínas com atividade hemaglutinante também foram descritas no bivalve % . No plasma desse molusco foi isolada uma proteína que além de possuir atividade de opsonização, é capaz de aglutinar hemócitos de coelhos (YANG e YOSHINO, 1990).
1.3.2.4. Proteínas com atividade enzimática
23 concentrações de metabólitos presentes no meio (LUKASHEVA E BEREZOV, 2005). Contudo, foi observado experimentalmente por Lukasheva e Berezov (2005) que uma maior concentração de LAO no meio era capaz de inibir a síntese de DNA, RNA e proteínas em células de leucemia, células de carcinoma de ovário e células de linfoma de Burkitt. Isso ocorre devido aos produtos da reação enzimática da LAO, pois os compostos produzidos afetam o crescimento das células cancerosas (LUKASHEVA E BEREZOV, 2005).
1.3.2.5. Inibidores de proteinases
24 uma rigidez na estrutura tridimensional, que permite conformação correta para a inibição das proteases (KANOST* 1999).
1.4. MECANISMOS DE DEFESA DE
(Rang, 1828- Figura 8) é um molusco marinho representante da classe Gastropoda Opistobranquia, que ocorre em regiões ao longo de toda a maré e costa brasileira, sendo também encontrado em zonas oceânicas do sul da Florida, nos EUA, e ao oeste da Índia (RIOS, 1985; MELO ., 2000). Essas lebres-do-mar possuem uma coloração críptica, são largas em tamanho e também são capazes de produzir muco e uma tinta escura para defesa (MELO ., 2000; NUSNBAUM e DERBY, 2010). MacCol e colaboradores (1990) afirmam que a liberação do líquido defesa produzido por esse animal, ocorre apenas em casos extremos e quando a cabeça ou cauda sofrem fortes estímulos (MACCOL ., 1990; PRINCE ., 1998).
25 Os moluscos apresentam uma infinidade de predadores como peixes, crustáceos, anêmonas, estrelas do mar, pássaros, entre outros. Para sua sobrevivência, estes animais acabam por adotar diversos mecanismos de defesa, como barreiras químicas e físicas (EINSTHRN e ISAACS, 2005; DERBY, 2007). Alguns moluscos desenvolveram conchas e defesas químicas (DERBY, 2007). Dentre os moluscos que desenvolveram defesas químicas polvos, lulas e lebres-do-mar são bastante lembrados por terem a capacidade de produzir uma tinta escura que é lançada quando estes são ameaçados por predadores (DERBY * 2007). Estudos realizados por Derby e colaboradores (2007) demonstram que a tinta produzida por esses animais possui três utilidades, além de auxiliar na fuga, atua como deterrente químico, causando a interrupção sensorial e também ajudando a inibir a predação. Um predador que é exposto a esse líquido de defesa, acaba por soltar a presa imediatamente ou ainda regurgitá-la (PRINCE ., 1998). Os deterrentes químicos fazem com que o animal seja impalatável ou tóxico. Esse mecanismo de defesa pode estar presente também nos ovos evitando a predação dos mesmos (DERBY, 2007). Por outro lado, a interrupção sensorial é causada pela inibição dos quimioreceptores do predador causando confusão momentânea e cessando assim o ataque do predador. O fagomimetismo ocorre quando a secreção liberada é capaz de estimular o sistema sensorial do predador de forma que ele entenda que a secreção é um alimento auxiliando assim a fuga da presa (DERBY , 2007 e JOHNSON ., 2006).
26 % é capaz de assimilar por meio da alimentação compostos halogenados e acumular estes em sua pele e órgãos, tornando assim, o animal impalatável aos seus predadores (IOANNOU ., 2009). As lebres-do-mar e outros opistobrânquios possuem glândulas ácidas que são capazes de lançar seus produtos na epiderme (SHABANI ., 2007). O molusco * por exemplo, é capaz de lançar ácido sulfúrico no muco, que pode atingir o pH 2 (SHABANI ., 2007). Já o muco de % pode atingir o pH de 4,0 (SHABANI ., 2007). Alguns desses compostos químicos já foram identificados, como alcalóides e diterpenos, que também possuem atividade contra tumores (JONHSON
., 2006; MELO ., 2000; FUSETANI, 2000; SCHMITZ, 1982). Em %
já foram descritas aglutininas naturais contra bactérias marinhas que também possuíam atividade contra células de vertebrados (COOPER e LEMMI, 1981). Já o líquido de defesa produzido por este molusco tem sido estudado por Jonhson e colaboradores (2006) em
% e também por Melo e colaboradores (2000) em . Foi observado, por exemplo, que para % , seu líquido de defesa era capaz de atuar como deterrente químico sobre o caranguejo azul, * (KAMIO * 2010) As moléculas presentes no líquido de defesa são capazes de atuar sobre os quimioreceptores relacionados ao comportamento de alimentação, de maneira que a movimentação para a captura da presa, o olfato e o processo de ingestão são prejudicados (KAMIO * 2010). Estudos realizados por Kicklighter e colaborados (2007) demonstraram que a liberação deste líquido de defesa também serve como alarme para outros indivíduos sobre a presença de predadores. Esse sinal de perigo é dado pela presença dos nucleosídeos uracil, citidina e uridina. Até quando altamente diluídos (1:500) esses compostos servem como sinalização de perigo, em que até mesmo indivíduos juvenis detectam a presença da tinta de defesa no ambiente e iniciam a fuga. O mecanismo de reconhecimento desses nucleosídeos ainda não é bem compreendido, mas os experimentos revelam que a exposição dos animais a esses três compostos é suficiente para incitar ações de fuga por outros animais.
"B" " ,+23), +, K2 +, +# +#<#
27 mecanismo de defesa de fagomimetismo, pois foi observado que lagostas eram atraídas pelo líquido de defesa de quando este se encontra em pHs mais baixos, pois os quimioreceptores desses crustáceos são estimulados em faixas de baixo pH (SHABANI ., 2007; DERBY, 2007). Já em anêmonas são observados comportamentos evasivos após a exposição ao líquido de defesa, com a observação da retração dos tentáculos ou reversão gastrovascular (DERBY, 2007).
A glândula opalina é encontrada em todos os membros da ordem, já a glândula de tinta não está presente em todas as lebres-do-mar (PRINCE * 2007). A glândula opalina é capaz de produzir uma secreção transparente que é lançada juntamente com a tinta e este composto quando em contato com a água, acaba por se polimerizar e torna-se viscoso (DERBY, 2007; JONHSON , 2006). Já a glândula púrpura produz uma secreção viscosa. Essas duas secreções são armazenadas no manto, e na presença de um predador, simultaneamente bombeadas pelo sifão para o meio ambiente (JONHSON , 2006; DERBY ., 2007). Podem também, existir divergências entre as duas glândulas em diferentes espécies de lebres do mar. Em algumas poucas espécies a glândula opalina e de
'2 G" Posicionamento das glândulas opalina e púrpura no corpo da . Figura
28 tinta tem a mesma cor e neste caso, a glândula de tinta produz uma tinta branca (PRINCE* 2007).
"B" " ,&:, 3), +, K2 +, +# +#<# = : '&#*$,
29 estudos que moluscos da espécie % que se alimentam apenas de algas verdes são incapazes de formar a tinta púrpura, no entanto a produção da glândula opalina não é afetada.
Smith e colaboradores (2010) apresentam que os pigmentos produzidos por muitos invertebrados além de ajudar na fuga, podem apresentar outras funções para seus produtores, como proteção contra raios ultravioleta e contra a colonização de microrganismos invasores. Muitos dos pigmentos presentes na circulação são capazes de evitar a colonização e proliferação de patógenos em tecidos e órgãos (SMITH ., 2010). Na literatura tem sido demonstrado que fragmentos de hemocianina, pigmento presente na hemolinfa, podem apresentar atividade antimicrobiana, contra bactérias Gram-Negativas, Positivas e fungos (SMITH ., 2010).
"B"A" ,&:, 3), +, K2 +, +# +#<# = 5,&:, $, * $ ,'#* +,
30 9# " Principais componentes químicos presentes na glândula opalina e no líquido de
defesa produzido por . Tabela formada a partir dos dados obtidos pelo estudo de Kickligther e colaboradores (2005) realizado com % .
Em relação ao conteúdo proteico do líquido de defesa, em % foi descrita a existência de proteínas de alto peso molecular, que não são derivadas das algas vermelhas, pois estas apresentam peso molecular maior do que as biliproteínas encontradas nas algas vermelhas (MACOL ., 1990; PRINCE e JOHNSON, 2006; PRINCE ., 1998). Prince e colaboradores (1998) propõem que essas proteínas seriam produzidas pelas células do retículo endoplasmático rugoso, organela mais abundante na glândula púrpura. Uma dessas proteínas, de 60 kDa foi caracterizada em diferentes espécies de . Escapina, Dactylomelina, Aplysina-P, Julianina-S, são exemplos dessa proteína isoladas em
% , - , , / , respectivamente (PRINCE e JOHNSON,
2006). Atividades antimicrobiana e anti-tumoral foram observadas em cultura de células para a proteína Escapina. Derby (2007) apresenta em seu estudo que a Escapina pode apresentar também uma atividade de L-aminoácido oxidase, de maneira que quando a glândula de tinta libera a secreção, a Escapina realiza a oxidação da L-lisina que está presente em pequenas quantidades na glândula (KAMIO ., 2010). Essa reação pode gerar dois produtos: peróxido de hidrogênio e alfa-ceto-ácidos de lisina (KAMIO ., 2010). Imina, enamina e intermediários de escapina (produtos solúveis em meio aquoso) são os derivados de
alfa-ceto-Líquido de defesa Concentração na amostra (mM)
31 ácidos encontrados em quantidades similares após a degradação da lisina. Estes produtos, podem ainda reagir com o peróxido de hidrogênio e produzir outros compostos que também são deterrentes contra predadores (KAMIO ., 2010). Já a proteína Dactylomelina foi caracterizada com uma quimerolectina, uma proteína com domínios de ligação com carboidratos e outro domínio que possui atividade biológica distinta e independente do primeiro domínio (MELO ., 2000). Para a proteína Aplysina-P foi descrita atividade anti-tumoral, citólitica e também a inibição da síntese de compostos moleculares como DNA e RNA (KISUGI, 1987).
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32
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3.1. OBJETIVOS GERAIS
Caracterizar o conteúdo protéico do tecido mioepitelial e secreção de defesa de de forma a compreender a função dessas proteínas na espécie de estudo.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Propor um protocolo de purificação de peptídeos e proteínas de mioepitélio e líquido de defesa de utilizando técnicas de cromatografia de exclusão molecular e fase reversa.
- Utilizar técnicas de sequenciamento para identificar as proteínas e peptídeos purificados.
- Relacionar as sequências de proteínas identificadas com a possível atividade biológica.
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4.1. COLETA DO ORGANISMO DE ESTUDO
Os animais foram coletados no Parque Municipal Marinho de Recife de Fora (Arraial d’Ajuda - BA- Licença do IBAMA número 16942-1). Os indivíduos de
33 4.2. RETIRADA DO TECIDO E EXTRAÇÃO PROTÉICA
O líquido de defesa produzido pela foi coletado para posterior análise. Para tal, o molusco foi gentilmente massageado na região dorsal até a liberação da tinta. Este líquido foi recolhido em uma placa de Petri e depois armazenado a 4ºC para o transporte e depois a -20ºC até o uso. Não foi utilizado inibidor de proteases nas amostras. Para excisão do tecido mioepitelial do molusco, foi primeiramente aplicado em , uma solução anestésica isotônica de cloreto de magnésio. Em seguida o mesmo foi mantido a uma temperatura de 4ºC por um período de 2 horas. Após tal processo o tecido foi retirado e lavado em etanol 70% para retirada de qualquer contaminante. O mioepitélio foi lavado em água destilada, mantido a 4ºC para o transporte e em seguida congelado a -20ºC até o uso. Parte do tecido foi macerado na presença de tampão fosfato de sódio 0,02 M, pH 7,0 contendo 0,05 M de cloreto de sódio. O extrato bruto foi então centrifugado a 3000 g, por um período de 10 minutos a 4 ºC, para retirada de restos celulares. O sobrenadante foi recolhido e filtrado a 0,45 µm.
4.3. QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA
Para o processo de purificação, primeiramente foi realizado o processo de quantificação de proteínas e peptídeos presentes nas amostras. Para tal processo, foram utilizados três métodos de quantificação, Bradford (1976), RCDR (Bio-Rad) e Qubit (Invitrogen). Para os testes Bradford e RCDC, as amostras foram avaliadas em triplicata, sendo seguidos os métodos propostos pelos fabricantes.
4.4. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR
34 de cloreto de sódio. As frações obtidas nesse processo foram liofilizadas e dialisadas contra água destilada ( %% 1 kDa). Um procedimento semelhante foi realizado para o líquido de defesa produzido pela . Um mililitro do líquido de defesa foi aplicado na coluna Superdex G-75 e para eluição das proteínas e pigmentos, também foi utilizado o tampão fosfato de sódio 0.02 M pH 7,0, contendo 0,05M de cloreto de sódio. As frações protéicas e de pigmentos foram recolhidos e liofilizados.
4.5. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA
As frações obtidas na cromatografia de exclusão molecular de mioepitélio e da fração protéica do líquido de defesa foram purificadas por uma etapa adicional de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As amostras de mioepitélio e liquido de defesa contendo cerca de 400 µg.mL-1 de proteína foram ressuspendidas em solução de água ultra-pura e pareador iônico, ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e aplicadas em colunas analíticas de fase-reversa, NST C4, Vydac C8 e Vydac C-18TP 522. As frações foram eluídas usando gradiente linear de acetonitrila (5-95%) e fluxo de 1,0mL.min- 1 para a coluna C18 e C8, e o fluxo de 0,8 mL.min- 1 para a coluna C4. Seguiu-se um passo cromatográfico, utilizando um equipamento de cromatografia líquida ultra-rápida, UFLC Prominence (Shimadzu®) associado a uma coluna analítica C18 (Shim Pak). Para tal processo cromatográfico, foram utilizados os seguintes parâmetros: gradiente linear de acetonitrila (5-95%), fluxo de 0,4 mL.min- 1 a uma temperatura de 40ºC.
4.6. ANÁLISE DE MASSA MOLECULAR POR SDS-PAGE
35 novamente centrifugados por 15 min a 3000 g. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas em 20 µL de tampão de amostra, contendo tris-HCl 20 mM pH 6,8, SDS 0,2%, azul de bromofenol 0,04%, glicerol 10% e β-mercaptoetanol 0,04%, para então, serem fervidas por 10 minutos. A corrida de eletroforese foi realizada utilizando os seguintes parâmetros: 200 V e 20 mA, por aproximadamente 1 hora. Os géis foram corados com prata (Blum, 1987).
4.7. ANÁLISES POR ESPECTOMETRIA DE MASSA E SEQUENCIAMENTO
36 em água ultra-pura e misturadas em uma solução saturada de uma matriz constituída de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (1:3), depositada na placa de MALDI. Alguns íons foram selecionados para fragmentação por MSMS. O padrão de fragmentação dos peptídeos foi gerado no modo LIFT de aquisição com calibração externa. Os dados obtidos por meio de sequenciamento foram então analisados por comparações contra bancos de dados no NCBI.
4.8. ANÁLISES
A partir das sequências obtidas usando o sequenciamento , foram realizados alinhamentos múltiplos com o auxilio do programa Clustal W 1.4, utilizando para tais análises a matriz Blossum 62, de acordo com os parâmetros especificados pelo programa (THOMPSON ., 1994). As sequências utilizadas para o alinhamento foram obtidas no banco de dados do Swiss-Prot. Para avaliação dos resultados obtidos por espectrometria de massa, foram utilizados dois programas, & (Bruker Daltonics) e PepSeq (GARRETT e GRISHAM, 1995). O primeiro programa foi utilizado para avaliações iniciais dos espectros obtidos. Já o programa PepSeq foi utilizado para a interpretação dos espectros obtidos. Os parâmetros utilizados foram 0,5 de tolerância para massa molecular e o mesmo valor para a tolerância da fragmentação do íon.
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5.1. EPIDERME
37 a 90 kDa (Figura 11). Já as frações 4, 5 e 6 apresentavam proteínas e peptídeos que variavam na faixa de peso molecular de 25 a 2 kDa (Figura 11).
'2 " Cromatograma de exclusão molecular em Superdex G75 do mioepitélio de . F1 a F10 indicam as frações obtidas após o processo cromatográfico. A absorbância foi monitorada a 216 nm (linha vermelha) e 280 nm (linha azul).
'2 " Gel SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de exclusão molecular de
39
Figura 12" Cromatogramas de mioepitélio de em coluna de fase reversa. (A) Cromatograma da fração 4 em coluna C18
40 Para a fração 2 (Figura 13), ocorreram poucas proteínas e peptídeos sendo observadas apenas três frações abundantes, eluídas a partir de 45% de acetonitrila. Todas as frações coletadas foram submetidas a análises por espectrometria de massa. Entre os peptídeos encontrados nas frações, fragmentos das proteínas paramiosina e beta-actina puderam ser identificados após o seqüenciamento dos peptídeos correspondentes (Tabela 3).
'2 A" Cromatograma da fração 2 em coluna C8 Vydac. Os números indicam as
frações em que peptídeos fragmentados puderam ser identificados.
41 frações coletadas de maneira que muitos desses peptídeos apresentavam massas moleculares muito similares e próximas. Esse fator dificultou a análise dos mesmos e seleção para fragmentação por espectrometria de massa. Entretanto alguns peptídeos presentes em cada fração puderam ser analisados e seqüenciados após aquisição dos espectros de MSMS dos íons correspondentes (Tabela 3). Para alguns peptídeos trípticos, também foi utilizado o processo cromatográfico de UFLC para um maior refinamento da purificação destes (dados não mostrados). Os peptídeos foram identificados por meio do processo de sequenciamento
e as sequências obtidas comparadas com as estruturas primárias presentes no banco de dados do NCBI para moluscos. Por meio desse processo foram caracterizadas apenas proteínas estruturais do tecido muscular, como actina, tropomiosina, calponina, filamina e beta-actina (Tabela 3).
9# A" Sequências dos peptídeos obtidos a partir do sequenciamento de
fragmentos de proteínas de mioepitélio de . Todas as sequências representadas apresentam 100% de identidade com os segmentos das seqüências presentes em banco de dados. As frações indicadas com asterisco representam os peptídeos que foram identificados sem o processo de tripsinização, já os demais peptídeos foram obtidos a partir do processo de alquilação, redução e tripsinização.
3), N OPQO #KR4*5 & + +#
1 724,2 HIADIR Calponina
1 852,4 QYDEAAR Tropomiosina
1 966,5 YIAEDAER Tropomiosina
1 1439, 9 GLAEIESETAGLQR Tropomiosina
2* 1667,8 KGKDSYVGDEAQSKR Beta-actina
2* 1354,5 DSYVGDEAQSKR Beta-actina
2* 1343,8 WVAEQNLQTVR Paramiosina
2* 1311,6 DFDSDVSVVR Paramiosina
3 1954, 2 VAPEEHPVLLTEAPLNPK Beta-actina
4 1691,8 SVIECHDNEDGTCR Filamina
42 Diante de tais resultados e busca na literatura, foi observado que a proteína tropomiosina é descrita como possuindo atividade alergênica. Assim, foi realizado um alinhamento múltiplo dos fragmentos de tropomiosina de e tropomiosinas isoladas a partir de outros moluscos que são descritas em bancos de dados de proteínas como possuindo atividade alergênica (Figura 14). Foi observada similaridade entre os fragmentos de tropomiosinas identificados em e as moléculas de tropomiosina descritas alergênicas dos
moluscos , * e
'2 B" Alinhamento das sequências de tropomiosina de com
tropomiosinas alergênicas de outros moluscos, , , ,
43 5.2. LÍQUIDO DE DEFESA
A determinação da concentração protéica do extrato bruto de secreção de
não foi realizada satisfatoriamente. Vários métodos de quantificação foram utilizados, como Bradford, RCDC e Qubit. Entretanto independente do método empregado para quantificação era observada a interferência dos pigmentos com reagentes de quantificação, de maneira que o resultado real era mascarado pela coloração da amostra. Diante de tais fatores, 1mL da amostra foi aplicado na coluna de exclusão molecular, Superdex G75. Por esse processo foi observada uma separação eficiente das proteínas e pigmentos presentes na amostra. O perfil cromatográfico apresentou diversas frações (Figura 15), mas apenas as frações iniciais apresentavam proteínas (frações 8 a 13). Visualmente foram observados diversos pigmentos separados pelo processo cromatográfico (Figura 16). Por meio de eletroforese unidimensional (Figura 17) foram visualizadas proteínas e peptídeos nas frações iniciais, variando de 80 a 9 kDa. Já as demais frações não foram observadas proteínas ou peptídeos.
'2 C" Cromatograma de exclusão molecular da coluna Superdex G75 do extrato bruto
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'2 D" Fotografia da coluna de Exclusão Superdex G75 durante o processo
cromatográfico com a amostra de líquido de defesa de . Na figura estão evidenciados os pigmentos que foram separados pelo processo cromatográfico.
45 Diante da baixa concentração de proteínas em cada fração, foi feito um de todas as frações e as mesmas foram aplicadas em uma coluna de fase reversa, C4 analítica (NST). Após esse passo de purificação foi observada a presença de diversas frações no perfil cromatográfico, mas a maior concentração de proteínas foi eluída com uma concentração de acetonitrila acima de 40% (Figura 18 A). Uma fração majoritária indicada na Figura 18 (A) foi eluída a 70% de acetonitrila. Nesta fração foi observado por espectrometria de massa, MALDI ToF/ToF, a presença de duas proteínas, uma de massa molecular de 13995 Da e outra de massa de 9086 Da. Para separação destas duas proteínas, foi realizado um terceiro passo de purificação utilizando um UFLC Shimadzu®. Com este processo, as proteínas foram separadas em duas frações (Figura 18 B), entretanto a fração contendo a proteína de 9 kDa ainda não se encontrava totalmente purificada, pois ainda eram observados peptídeos de tamanhos menores na amostra. Entretanto esse processo de purificação se mostrou eficiente para a proteína de 13 kDa, pois esta se encontrava purificada após esse procedimento (Figura 18 C). Devido à baixa concentração de proteínas e peptídeos na fração protéica, inicialmente não puderam ser avaliadas por espectrometria de massa outras proteínas e peptídeos além das proteínas de 13 e 9 kDa.
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'2 F. Cromatogramas do líquido de defesa de . (A) Cromatograma da fração protéica do líquido de defesa em coluna de
