Analise dos microRNAs

Vários estudos demostram a importância dos miRNAs no controle pós-transcricional de vários processos de desenvolvimento celular incluindo a espermatogênese (Papaioannou & Nef, 2010; Yu, Raabe, & Hecht, 2005). Até o presente momento poucos estudos foram realizados em tecido testicular de homens inférteis com diferentes histopatologias (Abu- Halima et al., 2014; Muñoz, Mata, Bassas, & Larriba, 2015).

Estudos realizados em tecido testicular demonstram que a expressão dos miRNAs se alteram dependendo da fase da espermatogênese (Buchold et al., 2010; J. Guo et al., 2009; Yan et al., 2007, 2009) e a meiose tardia e as células germinativas haploides são a principal fonte de miRNAs durante a espermatogênese(Bouhallier et al., 2010; X. Guo et al., 2009; Ro, Park, Sanders, McCarrey, & Yan, 2007).

Os estudos realizados com miRNAs mostram claramente o desempenho destas moléculas no desenvolvimento e/ou regulação da espermatogênese e que a alteração na expressão dos miRNAs contribui para a falha na espermatogênese. Estes estudos também sugerem que estes miRNAs desregulados podem ser utilizados como biomarcadores para o diagnóstico da infertilidade masculina (Abu-Halima et al., 2013; Gillis et al., 2007; Lian et al., 2009; Wang et al., 2011).

Nossos dados mostram que os pacientes com SCOS apresentam um padrão de expressão de miRNAs em biopsia testicular de homens inférteis com diferentes padrões histopatológicos. Os resultados obtidos mostram que os pacientes com parada de maturação e síndrome de células de Sertoli Only, apresentam uma assinatura na expressão dos miRNAs diferente quando comparados ao controle. A condição SCOS versus Ctrl apresentou 82miRNAs diferencialmente expressos quando comparado ao controle (196 miRNAs), indicando que uma maior modulação de miRNAs também apresenta efeito na severidade da doença. A condição MA apresentou 81miRNAs diferencialmente expressos quando comparado ao controle. As duas condições também compartilharam miRNAs, ao todo foram 30 miRNAs diferencialmente expressos compartilhados entre as duas condições (Figura 24 e Tabela 21). Os resultados apontam então uma possível relação dos miRNAs na maturação das células germinativas, como já visto na literatura.

Um estudo realizado com amostras de tecido testicular de pacientes inférteis com Parada de Maturação e Síndrome de células de Sertoli Only também identificou um perfil transcricional diferente em cada condição e miRNAs compartilhados nas duas condições. Este estudo identificou duas famílias de miRNAs diferencialmente expressos, a família miR-

449 (miR-449a, miR-449b*) e família miR-34 family (miR-34b*, miR-34b, miR-34c-5p)(Abu- Halima et al., 2014). Estas duas famílias são preferencialmente expressas no testículo (Bao et al., 2012; Bouhallier et al., 2010; Landgraf et al., 2007; Luo et al., 2010; Ro et al., 2007).

Nosso estudo também identificou a presença destas duas famílias. Os pacientes com síndrome de Células de Sertoli Only e Parada de Maturação quando comparados com o controle apresentaram os miRNA destas famílias hipoexpressos. Os miRNAs destas duas famílias citadas também foram relatados como hipoexpressos em pacientes com oligozoospermia, astenozoospermia e oligoastenozoospermia (Abu-Halima et al., 2013; Wang et al., 2011).

Nossos dados mostram que os pacientes com SCOS apresentam um padrão de expressão de miRNAs mais alterado do que os pacientes com MA. Estes resultados podem refletir as diferenças na composição do tipo de células germinativas presente nos pacientes, uma vez que se sabe que os pacientes com SCOS apresentam ausência das células germinativas nos testículos. Um estudo realizado com homens inférteis com diferentes histopatologias testiculares também obteve como resultado assinaturas de miRNA diferentes em cada condição (Muñoz et al., 2015).

O padrão de assinatura de cada condição histopatológica pode ser responsável pelas diferenças observadas na expressão de miRNAs entre os grupos MA e SCOS em comparação com o controle. As diferentes assinaturas de miRNAs encontradas nos pacientes SCOS e MA podem vir a servir para diferenciar um paciente azoospérmico do outro. Uma vez que o paciente com azoospermia e Parada de Maturação apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferente do padrão do paciente com azoospermia e Síndrome de Células de Sertoli Only. Já os miRNAs compartilhados entre as duas condições pode vir a ser utilizados para identificar pacientes azoospérmicos. Uma vez que a assinatura compartilhada destes miRNAs levam a azoospermia nos dois grupos. Estudos realizados com pacientes com SCOS e MA também identificaram padrões de expressão de miRNA diferentes entre as duas condições e miRNAs compartilhados assim como os nossos resultados (Abu-Halima et al., 2014). Estudos com miRNAs em pacientes inférteis revelam que eles podem ser um potencial biomarcador para o diagnóstico de infertilidade (Khazaie & Nasr Esfahani, 2014).

Muños et al., (2015) avaliou a expressão diferencial dos miRNAs em amostras de tecido testicular com diferentes histopatologias. O estudo revelou um padrão diferencial na expressão dos miRNAs nas diferentes amostras de tecido. Eles centraram o estudo na correlação do padrão

de expressão dos miRNAs com o número de células germinativas maduras combinando ao valor de expressão de três miRNAs (miR-449a, miR-34c-5p e miR-122) como um teste preditivo para identificar a presença de células germinativas maduras na biópsia testicular, uma vez que estes miRNAs apresentaram níveis de expressão diferentes em cada condição histopatológica. Os nossos resultados também mostram que miR-449a, miR-34c-5p e miR-122 também apresentaram valores diferentes na expressão destes miRNAs em nossos pacientes. Os pacientes com SCOS apresentaram um fold change mais baixo que os pacientes com MA. Estes resultados evidenciam que de acordo com o grau de maturação das células germinativas podemos ter uma expressão aumentada ou diminuída destes miRNAs.

As alterações dos miRNAs das famílias miR-449, miR-34 sugerem um papel importante na reprodução masculina (Abu-Halima et al., 2014). A Alta expressão das duas famílias em SCOS e MA é possivelmente devido a expressão semelhante miR-449, miR-34 durante o desenvolvimento testicular e na espermatogênese do adulto. Notadamente as duas famílias de miRNAs estão localizadas no mesmo tipo de células germinativas (espermátides e espermatócitos) (Bao et al., 2012; Bouhallier et al., 2010; X. Guo et al., 2009).

Buscando relacionar funcionalmente a modulação dos miRNAs estudados, fizemos uma busca baseada, em banco de dados, dos possíveis mRNAs alvos dos miRNAS mais diferencialmente expressos em cada condição e então realizamos o enriquecimento funcional destes mRNAs alvos, esta análise nos permitiu avaliar quais processos biológicos estariam mais alterados nas patologias do aparelho reprodutor masculino estudadas. As figuras 25 a 27 ilustram estes resultados, nas quais observamos que notavelmente a maioria dos processos enriquecidos estão relacionados à progressão do ciclo celular, em geral divisão e crescimento celular, e a expressão gênica, seja na fase de transcrição ou tradução. Tais processos são imprescindíveis na germinação e maturação dos espermatozoides e nossos resultados mostram que a modulação dos miRNAs leva a desregulação dos mesmos, visto que a expressão anormal destes miRNAs reflete no controle pós transcricional de seus mRNAs alvos, os quais podem ter um impacto significante na infertilidade masculina, como visto nos estudos de Abu-Halima et al. (2014).

As expressões de miR-449a e miR-449b são reguladas pelo fator de transcrição E2F 1 (E2F1), que promove a progressão do ciclo celular e induz a apoptose em células danificadas. A hiperexpressão de E2F1 leva ao aumento da apoptose de espermatócitos (Holmberg, Helin, Sehested, & Karlström, 1998; Marcet et al., 2011). A ausência do fator E2F1 provoca a

redução da proliferação das espermatogonias levando a atrofia testicular (60). Os miR-449a e miR-449b promovem a apoptose de uma maneira independente de p53 em linhagens celulares tumorais (Bou Kheir et al., 2011; Mciver, Roman, Nixon, & Mclaughlin, 2012; Yang et al., 2009), a desregulação destes miRNAs observados em pacientes com deficiência da espermatogénese pode ter contribuído para o aumento da apoptose no tecido gonadal (Lian et al., 2009; Novotny et al., 2007; Voorhoeve et al., 2006).

Contudo, o efeito exato da alteração da expressão destes miRNAs encontrado neste trabalho será melhor elucidado posteriormente, quando cruzarmos os dados de expressão dos miRNAs e dos mRNAs destas mesmas amostras.

Ainda em relação à anotação funcional dos miRNAs diferencialmente expressos, encontramos, através do banco de dados HMDD v2, miRNAs associados à patologias do aparelho reprodutor masculino (Tabela 22).

Um estudo realizado em pacientes com azoospermia obstrutiva identificou o cluster miR-371, 2 e 3 hipoexpressos nestes pacientes. O estudo sugere que o miRNA-372 e miR-373 pode contribuir para o aumento da apoptose nos testículos destes pacientes, uma vez que sabe-se que estes miRNAs pode regular negativamente genes de apoptose, tendo um papel na inibição desse processo (Lian et al., 2009). Um dos processos biológicos enriquecido foi a apoptose, corroborando com os achados da literatura.

O levantamento feito no banco de dados HMDD v2 revelou que 13 miRNAs diferencialmente expressos em nossos pacientes também foram encontrados em estudos envolvendo câncer de próstata e testículo. Um estudo sugere que a infertilidade masculina pode ser um fator de risco para o desenvolvimento de câncer de Próstata (Fábio Escórcio Almeida, Severino Ribeiro, & Avelino Fraga, 2012).

O miR-125b foi diferencialmente expresso em células dependentes de andrógenos e células de câncer de próstata sugerindo que este miRNA atua como um oncogênese que contribui para a patogenicidade do câncer de próstata (Shi et al., 2007).

O estudo realizado com células de câncer de próstata mostrou que o cluster miR-99a, let-7c, miR-125b-2 estão envolvidos na regulação de genes induzidos por andrógenos. Este estudo validou nove mRNA alvos regulados negativamente por este cluster (D. Sun et al., 2014). Tanto o miRNA-125b e miRNA-99a, foram hipoexpressos na condição SCOS.

A condição SCOS apresentou miRNAs envolvidos com azoospermia, câncer de próstata e câncer de testículo, a condição MA apresentou miRNAs envolvidos apenas com

azoospermia e câncer de testículo. Estes resultados mostram a representatividade maior de miRNAs associados à doenças do aparelho reprodutor masculino no grupo de miRNAS diferencialmente expressos em SCOS.