microRNAs

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs endógenos de fita simples, compostos por aproximadamente 22 nucleotídeos e que não codificam proteínas, são evolutivamente conservados e atuam como reguladores pós-transcricionais da expressão gênica (Bartel 2004). Em humanos estima-se que mais de 50% do transcriptoma está sob o controle de microRNAs (Bartel 2009; Rigoutsos 2009; Pasquinelli 2012).

Em 1993 foi descrito o primeiro miRNA, o lin-4, descoberto no Nemátodo Caenorhabditis Elegans (Lee et al. 1993; Wightman et al. 1993). Depois da descoberta do lin- 4, centenas de outros miRNAs foram identificados em animais, plantas e vírus (Lagos- Quintana et al. 2001; Lau et al. 2001; Lee e Ambros 2001; Berezikov et al. 2006; Ruby et al. 2006; Bushati e Cohen 2007), e, hoje, existem mais de 2.500 microRNAs maduros descritos em humanos (miRBase release 21, junho 2014).

Essas pequenas moléculas são encontradas em células e em vários fluídos corporais, como, sangue, saliva, esperma, urina e podem estar vinculados a proteínas ou incorporados em microvesículas após serem secretados pelas células, impedindo assim, sua degradação (Moreno- Moya et al. 2014). Apresentam grande estabilidade e uma meia-vida acima de 14 horas, com exceção de alguns miRNAs cuja degradação é mais rápida (Hwang et al. 2007; Kim et al. 2009).

Estudos mostram que os miRNAs estão envolvidos na regulação de vários processos biológicos, incluindo desenvolvimento, diferenciação, apoptose, proliferação celular, diferenciação celular (Bartel 2004; Carleton et al., 2007; Tang et al., 2007; Lakshmipathy et al., 2007). Além dos processos biológicos já citados foi visto que os miRNAs também podem participar de processos patológicos como o câncer (Guo et al., 2009; Gilabert-Estelles et al., 2012). A desregulação de miRNAs pode dirigir ou contribuir com a tumorigênese (Croce, 2009).

A regulação pós-transcricional realizada pelos miRNAs pode ocorrer por inibição traducional ou degradação do mRNA alvo. A forma com que o miRNA vai atuar para inibir a tradução do mRNA vai depender do grau de complementariedade do miRNA com seu mRNA alvo. O pareamento perfeito entre o miRNA e seu mRNA alvo levará a degradação do mRNA e o pareamento imperfeito levará a inibição traducional do alvo. O principal mecanismo de atuação dos miRNAs em mamíferos são o de pareamento imperfeito. Sabe-se que um único

miRNA pode regular muitos mRNAs, isso ocorre devido ao fato de possuírem sequencias pequenas e não necessitar do pareamento completo com seu alvo para atuarem (Brennecke et al., 2005).

Os miRNAs são transcritos de regiões genômicas que podem ser regiões codificadoras e não codificadoras de proteínas. Semelhante aos mRNAs os miRNAs possuem uma 7-metil guanosina na extremidade 5' e uma cauda poli (A) na extremidade 3' e na maioria das vezes são transcritos pela enzima RNA polimerase II. (Lee et al., 2004; Shin et al., 2009; Davis e Hata, 2009).

Em humanos a biogênese dos miRNA ocorre em duas etapas, uma que ocorre no núcleo e outra que ocorre no citoplasma. A biogênese inicia com transcrição mediada pela enzima RNA polimerase II, gerando os miRNAs primários (pri-miRNAs), uma molécula com muitos nucleotídeos e estrutura(s) em grapo(s) chamado(s) hairpin(s) (Bushati e Cohen 2007).

A biogênese dos miRNAs pode ocorrer pela via canônica e via não canônica. Na via canônica, os pri-miRNAs são clivados no núcleo por um complexo que compreende a enzima RNaseIII, a ribonuclease Drosha e a proteína DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region protein 8) produzindo os precursores dos miRNAs, os pré-miRNAs. Na via não canônica, os pré-miRNAs são formados a partir de mirtrons (pequenos miRNAs intrônicos) nos spliceossomos. Os pré-miRNAs são transportados do núcleo para o citoplasma pela proteína Exportina para serem processados pela enzima Dicer formando duplex miRNA/miRNA*. O duplex miRNA formado por Dicer é desenrolado para que uma das fitas seja selecionada e atue como miRNA maduro (Finnegan e Pasquinelli 2013). A fita selecionada se associa ao complexo RISC (RNA-Induced Silencing Complex) que é formado pela enzima Dicer, proteína Argonauta e TRBP (Trans-activator RNA Binding Protein). O miRNA e o complexo RISC interagem com a região 3’ UTR do mRNA alvo regulando a sua expressão. O anelamento perfeito entre o miRNA e seu mRNA alvo resulta na repressão dos genes alvos e na clivagem do mRNA (Figura 5) (Faraoni et al., 2009; Dai & Ahmed, 2011).

Figura 5: Biogênese dos microRNAs. Via canônica - Os pri-microRNAs são transcritos e processados no núcleo em pre-

microRNAs. Via não canônica - os pre-microRNAs são derivados de splicing. Os pre-microRNAs são exportados para o citoplasma, através da Exportina 5, onde são clivados em um duplex de microRNA, sendo uma das fitas incorporada ao complexo miRISC para guiar esse complexo proteico a sequências. Fonte: Filipowicz et al. 2008 adaptado Takahashi, 2014.

Achava-se que a fita não selecionada, denominada passageira ou fita estrela (*), era rapidamente degradada, mas estudos demostram que em algumas situações, as fitas passageiras podem ser selecionadas e direcionar a repressão dos seus alvos (Okamura et al. 2008; Finnegan e Pasquinelli 2013). A fita guia é selecionada durante a ligação da proteína Argonauta na formação do complexo RISC, seguindo as bases da estabilidade termodinâmica das duas porções finais do duplex de miRNA. A fita com um terminal relativamente instável na porção 5’ é tipicamente selecionada como a fita guia (Khvorova et al. 2003; Finnegan e Pasquinelli 2013).

O crescente número de estudos com miRNAs vem revelando o importante desempenho destes pequenos RNAs em diversos processos biológicos. Além disso, através da regulação global da expressão gênica e associação a diferentes funções, torna-se evidente que os miRNAs possam alterar a progressão de diversas patologias. Assim, como nova e

importante peça do processo de regulação gênica, os microRNAs apresentam diversas e cruciais funções biológicas nas células animais e tem sido alvo de muito interesse para estudo nos últimos anos.

1.6 microRNAs e a Espermatogênese

Recentemente estudos têm demonstrado que os miRNAs desempenham um papel importante no controle das funções reprodutivas como ovulação, desenvolvimento do corpo lúteo, implantação do embrião e na espermatogênese (Imbar e Eisenberg, 2012; Kotaja, 2014).

Uma revisão da literatura feita por Kotaja, 2014 mostra que os miRNAs contribuem para a regulação dos perfis de expressão de genes durante espermatogênese. Os miRNAs são expressos em tipos de células especificas durante a espermatogênese e participam do controle de etapas especificas da diferenciação das células germinativas masculinas. O seu papel na expressão espacial e temporal correta de genes específicos das células germinativas é fundamental para a produção viável e saudável dos espermatozóides. Curiosamente os andrógenos parecem controlar eventos espermatogênicos através de mecanismos dependentes de miRNA. Estudos relatam que a expressão testicular dos miRNAs muda dependendo do estágio da espermatogênese (Hayashi et al., 2008; Maatouk et al., 2008). A análise de 28 miRNAs isolados de várias populações celulares como espermatogônias, Células de Sertoli, espermatócitos, espermátides redondas e em alongamento de espermatozóides, sugerem que as células germinativas são a principal fonte de produção de miRNA durante espermatogênese (Ro et al., 2007; Bouhallier et al., 2010).

Um estudo recente relatou que a inativação de Drosha ou Dicer em células espermatogênicas reduz espermatócitos e espermátides nos testículos e leva a oligoteratozoospermia ou azoospermia, indicando desse modo que a via canônica de miRNA dependente de Dosha ou de Dicer é criticamente importante para desenvolvimento de células germinativas masculinas (Wu et al., 2012).

Hayashi, 2008 e colaboradores mostraram que os clusters mir-17-92 e mir-290-295 eram altamente expressos em células germinativas primordiais e espermatogônias de ratos. Eles também descobriram que os níveis de miR-141, miR-200a, miR-200c, e miR-323 são

reduzidos com a progressão do desenvolvimento das células germinativas primordiais, mas a família let-7 miRNA são altamente expressos, sugerindo fortemente que estes miRNAs podem desempenhar papéis na espermatogênese em mamíferos.

Além disso, estudos têm apontado os papéis dos vários miRNAs em diferentes etapas da espermatogênese em mamíferos. Um destes estudos mostrou que miR-21, miR-34c, miR-182, miR-183, and miR-146a foram abundantes em células tronco espermatogoniais de ratos. Curiosamente o mir-21 é controlado por ETV5, um fator de transcrição para a manutenção do auto renovação das células tronco espermatogoniais, que desempenham um importante papel na homeostase destas células (Niu et al., 2011). Outro estudo mostrou que a etapa chave para a espermatogênese e diferenciação espermatogonial tem sido modulado por vários miRNAs. Dois cluster de miRNAs o mir-17-92 e mir-106b-25 são down regulados na diferenciação espermatogonial induzida por ácido retinóico. Como resultado seus alvos que são importantes para o desenvolvimento da espermatogênese e são upregulados pelo ácido retinóico na espermatogênese, sugerindo que seus miRNAs podem regular a diferenciação da espermatogonia de ratos (Oatley et al., 2010; Tong et al., 2012).

Um estudo realizado em pacientes inférteis identificou miRNAs diferencialmente expressos onde 154 eram down regulados e 19 up regulados entre um grupo com Azoospermia não obstrutiva e um grupo controle (Lian et al.,2009). Wang et al., 2011 relatou 19 miRNAs com expressão alterada no plasma seminal e sugeriu que os miRNAs poderiam ser utilizados para diagnosticar infertilidade masculina. A identificação de 68 miRNAs pela tecnologia de microarray em espermatozóides humanos indica que o perfil de espermatozoides pode ser usado para identificar especificamente homens inférteis (Ostermeier et al., 2005).

Apesar dos vários estudos feitos para elucidar o papel dos miRNAs na espermatogênese são necessários mais estudos para entender melhor o papel destas moléculas na espermatogênese e na infertilidade masculina.

2. Hipótese do Trabalho

A literatura nos mostra que os genes presentes na região AZF do cromossomo Y, bem como alguns genes presentes em cromossomos autossômicos e no cromossomo X, são responsáveis pela formação do epitélio germinativo e o processo de espermatogênese.

Neste trabalho pretende-se testar a hipótese de que alterações no número de copias destes genes bem como a alterações no perfil transcricional do pool dos miRNAs do tecido germinativo podem estar envolvidos com a infertilidade idiopática nos homens.

3. Objetivos

Objetivo geral:

O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia.

Objetivos específicos:

1. Detectar CNVs em pacientes com Azoospermia por meio da utilização da técnica de CytoScan HDTM com chips de DNA de alta densidade;

2. Analisar as CNVs encontradas no grupo de indivíduos investigados de acordo com seu tipo, localização, tamanho, genes presentes, presença na população e estimar o seu potencial patogênico;

3. Identificar os perfis de expressão de miRNAs em amostras de biopsia testicular de pacientes com parada de maturação das células germinativas (MA) e pacientes com síndrome de células de Sertoli Only (SCOS) utilizando a tecnologia de microarrays;

4. Comparar o perfil transcricional entre parada de maturação das células germinativas e síndrome de células de Sertoli Only,visando verificar se há perfis diferenciais entre estes tipos de alterações do epitélio germinativo.

4. Aspectos Éticos

O projeto para elaboração do presente trabalho: “ Análise da expressão de mRNA e miRNA da Região AZF em Yq11 em Tecido Testicular de Homens inférteis com Azoospermia” foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCFMRP/USP, sob processo nº 42353015.2.0000.5440. As amostras deste estudo foram colhidas após o paciente ter assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1).

5. Material e Métodos