Analitos de caráter básico e neutro

A recuperação para os analitos de caráter básico e neutro foi realizada de acordo com o procedimento anterior, entretanto foi adicionada à amostra de 100 mL de água da Represa Billings contendo os padrões fluoxetina, clofibrato, fenofibrato, propranolol, carbamazepina, trimetoprima, etinilestradiol, estrona e diazepam.

Os valores de recuperação as concentrações adicionadas à amostra estão na Tabela 4.2.

Tabela 4.2. Valores das concentrações adicionadas e valores recuperados

durante os experimentos de extração

Analitos Concentração adicionada (mg L-1₎ Recuperação* (%) Fluoxetina 500 68±10 Clofibrato 500 78±8 Fenofibrato 500 71±9 Propranolol 500 73±11 Carbamazepina 500 81±4 Trimetoprima 500 78±6 Etinilestradiol 500 74±7 Estrona 500 80±6 Diazepam 500 84±4

*(n=3)

A faixa de recuperação para os compostos básicos variou de 68 a 84%. Os menores valores de recuperação para fluoxetina, fenofibrato e propranolol e maiores valores de CV(%) ocorreram devido a instabilidade da linha de base na região onde migram estes analitos, o que causa dificuldade de integração dos picos.

4.4. Considerações finais

Este capítulo abordou o estudo de desenvolvimento de um método de preparo de amostra envolvendo a técnica de extração em fase sólida, e com isso foi possível avaliar parâmetros físico-químicos do processo de extração aplicados a pré-concentração de analitos de caráter ácido, básico e neutro em amostras de água. Foi possível a detecção de uma concentração aproximada de 500 ng L-1

destas substâncias em amostras de água, associando as técnicas extração em fase sólida e enriquecimento em linha utilizando eletroforese capilar. Os valores de recuperação foram favoráveis considerando a natureza da amostra e a presença de substâncias oriundas do aporte de matéria orgânica proveniente da região da coleta.

4.5. Referências bibliográficas

[1] POMPE, S. HEISE, K. H., NITSCHE, H. Capillary electrophoresis for a “finger-

print” characterization of fulvic and humic acids. Journal of Chromatography A, v. 723, n. 1, p. 215-218, feb. 1996.

[2] Polymeric sorbents for sample preparation. Disponível em:

5.1. Introdução

Os p-hidroxibenzoatos de alquila (Figura 5.1), comumente nomeados parabenos, são ésteres derivados do ácido p-hidroxibenzóico, amplamente utilizados como conservantes antimicrobianos, por demonstrarem atividade inibitória frente a fungos e leveduras, sendo empregados em produtos com finalidade cosmética, farmacêutica e alimentícia [1].

OH OH R R O O OH OH R R O O

Figura 5.1. Estrutura da série homóloga dos p-hidroxibenzoato de alquila.

Os parabenos são utilizados há mais de 50 anos, atualmente estima-se que estão presentes em mais de 13200 formulações, individualmente ou em associações. Os parabenos são empregados em diversos produtos utilizados rotineiramente, como hidratantes, cremes dentais, sabonetes, desodorantes e xampus [2,3] na concentração de até 0,4%, conforme estabelecido pela Resolução nº 79, de 28 de agosto de 2000 da ANVISA [4].

Estudos “in vitro” sugerem que os parabenos exibem atividade estrogênica [5], sendo esta dependente da sua estrutura [6], resultando em um provável desenvolvimento de linhagens celulares de adenocarcinoma de mama; outros estudos evidenciam que os parabenos influenciam na expressão de genes estrogênio-dependente [7,8]. Estudos “in vivo”, utilizando roedores, sugerem o aumento do peso do útero após exposição aos parabenos do tipo butílico, isobutílico e benzílico [8]. Roedores masculinos demonstraram diminuição do

R:

(O-CH3) – metil

(O-C2H5) – etil

(O-C3H7) – propil

nível de excreção da testosterona e, alguns, redução do aparelho reprodutor após exposição ao butil e propilparabenos [9], não sendo observados os mesmos efeitos para exposição ao metil e etil parabenos [10].

A determinação dos parabenos no ambiente aquático tem sido alvo de alguns estudos apresentados na literatura, e o monitoramento destas substâncias desperta um crescente interesse devido aos seus efeitos ainda pouco conhecidos [11-13].

Considerando a necessidade de estudos para comprovação da segurança dos parabenos e sua ampla aplicabilidade, é imprescindível o desenvolvimento de técnicas analíticas rápidas e robustas visando a quantificação dos parabenos em amostras de origem ambiental.

A eletroforese capilar mostra-se uma ferramenta analítica apropriada à análise dos parabenos em diferentes matrizes, pois associa alta eficiência, baixo custo por análise e consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes. Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a determinação de parabenos que seja rápida, sensível e eficiente, associando estratégias de enriquecimento “off line” e “on line” para o aumento da detectabilidade do método.

5.2. Procedimentos experimentais

5.2.1 Equipamentos e parâmetros instrumentais

Desenvolvimento do método de análise e “stacking”: os experimentos

foram conduzidos em um sistema de eletroforese capilar (modelo HP3D_CE,

Agilent Technologies, Palo Alto, CA, E.U.A.), equipado com detector de arranjo de diodos e “software” (HP ChemStation, rev A.06.01) para tratamento e aquisição de dados. O aparelho possui sistema de refrigeração do capilar por circulação de ar, e a temperatura foi mantida constante. Foram utilizados capilares de sílica fundida (Polymicro Technology, Phoenix, AZ, E.U.A.),

revestidos externamente com poli-imida, de 50 e 75 mm de diâmetro interno, com 48,5 cm de comprimento total e 40 cm até o detector ou 32 cm e 23,5 cm até o detector.

Determinação da mobilidade efetiva: os experimentos para determinação da

mobilidade efetiva dos p-hidróxibenzoatos de alquila foram realizados em um equipamento de eletroforese capilar modelo P/ACE MDQ (Beckman Instruments, Fullerton, CA, E.U.A.). O capilar utilizado foi de sílica fundida (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, E.U.A.) com 60,2 cm de comprimento total, 50 cm até o detector e 50 mm de diâmetro interno.

Condicionamento dos capilares: as lavagens de condicionamento inicial do capilar, foram realizadas diariamente com 15 minutos de hidróxido de sódio 1 mol L-1_{, seguidos de 15 minutos de água desionizada e 30 minutos de eletrólito}

de corrida. No intervalo entre as corridas o capilar foi recondicionado com lavagens de 2 minutos de eletrólito e no término das análises 15 min de hidróxido de sódio 1 mol L-1 _{e 15 minutos de água desionizada para a limpeza do}

capilar.

5.2.2. Reagentes e soluções

Água desionizada (Milli-Q, Milliporre, Milford, MA, E.U.A.) foi utilizada para o preparo de todas as soluções utilizadas. Solventes metanol, acetona, diclorometano, acetato de etila e acetonitrila foram adiquiridos da Merck (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Todos os reagentes utilizados foram grau analítico. Padrões de butil, propil, etil e metilparabeno e ácido cinâmico foram adquiridos da Aldrich (Milwaukee, WI, E.U.A.). Soluções padrão estoque foram preparadas em metanol com concentração aproximada de 1000 mg mL-1 _{e armazenadas sob}

refrigeração (4 °C). Foram preparadas semanalmente soluções estoque de tampão glicina (Fluka, São Paulo, SP, Brasil), trietilamina (TEA) (Tédia, Rio de

Janeiro, RJ, Brasil) e ácido 2-hidroxi-isobutírico (HIBA) nas concentrações de 100 mmol L-1_{. Os eletrólitos utilizados nas análises foram preparados diariamente.}

5.2.3. Amostras

Para a otimização do método de SPE foram utilizadas alíquotas de 100 mL de amostras de água de torneira, fortificada com os padrões em concentrações apropriadas. O método de extração otimizado foi aplicado em alíquotas de 100 mL de amostras de água coletadas na Represa Billings, localizada na região metropolitana de São Paulo. As amostras foram coletadas com profundidade de 50 cm da superfície, no período da manhã, em recipientes de vidro âmbar, e levadas imediatamente ao laboratório, filtradas e armazenadas sob refrigeração (4 °C) ao abrigo da luz. As amostras coletadas apresentavam pH que variou de 6,8 a 7,2, e estas foram analisadas no prazo máximo de 72 horas após a coleta.

5.2.4. Metodologias

Determinação da mobilidade efetiva: o eletrólito de corrida utilizado para determinação das mobilidades foi constituído por 15 mmol L-1 _{de TEA e 9,6}

mmol L-1 _{de HIBA, pH 10,59, com força iônica de 10,04. Entre as corridas o}

capilar foi recondicionado com o eletrólito de corrida durante 2 minutos. O potencial aplicado, Vprog, foi 10 kV, polaridade positiva e o tempo de separação, tmigr, foi de 4 minutos. A rampa de voltagem aplicada no início e no final das

corridas foi de 0,2 minuto. O seguimento termostatizado do capilar foi mantido a 25 ºC e o tempo de injeção, tinj, foi de 5 segundos.

Injeção convencional: o eletrólito de corrida utilizado para separação simultânea dos parabenos foi constituído por 40 mmol L-1 _{de glicina e 40 mmol}

L-1 _{de TEA; tensão de separação aplicada de 30 kV, com polaridade positiva.}

Amostras e padrões foram injetados hidrodinamicamente com pressão de 50 mbar durante 3 segundos e a detecção monitorada em 297 nm.

“Stacking”:

o eletrólito de corrida utilizado para o “stacking” dos parabenos foi constituído por 40 mmol L-1 _{de glicina e 40 mmol L}-1 _{de TEA; injeção}

hidrodinâmica com pressão de 50 mbar durante 200 segundos e tensão de separação aplicada de 30 kV; a polaridade foi mantida no modo positivo até o alcance de aproximadamente 95% da corrente normal com eletrólito de corrida e logo a polaridade foi invertida para o modo negativo; a aquisição dos dados foi monitorada em 297 nm.

Procedimento de extração em fase sólida: foram utilizados cartuchos de SPE de 6 mL tipo seringa contendo 500 mg de fase polimérica poliestireno- divinilbenzeno (Phenomenex, Torrance, CA, E.U.A.), as etapas do procedimento de extração serão detalhadas a seguir.

5.3. Resultados e discussão

No documento Metodologias para determinação de fármacos, metabólitos e disruptores endócrinos... (páginas 132-139)