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18 3.1. Parasito
Foi utilizada a cepa Y do T. cruzi - DTUII (Zingales et al., 2009). Isolada de um paciente na fase aguda da doença de Chagas por Pereira de Freitas, em 1950, em Marília, São Paulo e posteriormente estudada e descrita por Silva e Nussenzweig (1953). Esta cepa é considerada parcialmente resistente ao tratamento com Bz (Filardi e Brener, 1987).
3.2. Modelo Animal
Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas, com idade entre 28 a 30 dias, pesando entre 18 e 22 g. Os animais foram fornecidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os experimentos e protocolos experimentais foram conduzidos de acordo as diretrizes para o uso de animais em pesquisa do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFOP (número 2009/17).
3.3. Fármacos
A estrutura química dos fármacos utilizados para o tratamento dos animais, isoladamente ou em combinação estão mostradas nas figuras 1 e 2.
Figura 1 - Benznidazol (Bz): N-benzyl-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)acetamida (Rochagan®, Roche). .
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Figura 2 – Itraconazol (Itz): 4-(4-(4-(4-((2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol- 1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy)phenyl)-1-piperazinyl)phenyl)-2,4-dihydro-2- (1-methylpropyl) (Brainfarma).
3.4. Infecção e Esquema de Tratamento
Os animais foram inoculados intraperitonealmente com 5 x 103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y. Os animais infectados foram divididos em grupos de 10 animais, os quais foram tratados com diferentes doses de Bz e Itz em monoterapia e com diferentes combinações destes compostos. Os fármacos foram suspensos em água destilada utilizando-se 4% metilcelulose (Sigma®) e cada animal recebeu, de acordo com seu peso corporal, a suspensão da droga por gavagem.
Os grupos experimentais utilizados para a avaliação da monoterapia foram:
i. 50 mg de Bz por quilo de peso ii. 75 mg de Bz por quilo de peso iii. 100 mg de Bz por quilo de peso
iv. 50 mg de Itz por quilo de peso v. 75 mg de Itz por quilo de peso vi. 100 mg de Itz por quilo de peso
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Os grupos experimentais utilizados para a avaliação do efeito da terapia combinada foram:
vii. 100 mg de Bz por quilo de peso + 100 mg de Itz por quilo de peso viii. 100 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso
ix. 75 mg de Bz por quilo de peso + 75 mg de Itz por quilo de peso x. 75 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso xi. 50 mg de Bz por quilo de peso + 100 mg de Itz por quilo de peso xii. 50 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso
O tratamento foi iniciado imediatamente após a detecção de parasitemia patente (quatro dias após a inoculação dos animais). O tratamento foi administrado por 20 dias consecutivos para todos os grupos. Foram utilizados como grupos controle animais não infectados e não tratados (n=5) e infectados e não tratados (n=10).
3.5. Controle de cura
A cura parasitológica foi determinada de acordo com a metodologia padronizada por Caldas et al. (2008) baseada em 2 testes independentes: exame de sangue a fresco antes e após imunossupressão com Ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha), seguida pelo teste de PCR em tempo real (qPCR) realizado no 1o e no 6o mês após o tratamento no sangue de camundongos com resultados negativos no exame de sangue a fresco. Os animais foram considerados curados quando apresentaram resultados negativos em todos os testes realizados. A parasitemia foi avaliada durante e até 30 dias após o tratamento para detectar a ocorrência da supressão e da reativação natural da parasitemia após o término do tratamento (Exame de Sangue a Fresco). Os animais que não apresentaram a reativação da parasitemia após a tratamento foram submetidos a 3 ciclos de 50mpk de Ciclofosfamida (Cy), sendo cada ciclo de 4 dias consecutivos, com intervalo de 3 dias entre cada. A parasitemia foi avaliada diariamente durante a imunossupressão e até 10 dias após seu fim (Figura 3).
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Figura 3 - Representação cronológica do experimento utilizado para avaliação de cura: exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com Ciclofosfamida e da qPCR realizada no 1o e no 6o mês após o tratamento
3.5.1. Exame de sangue fresco
O exame de sangue a fresco foi realizado no sangue coletado da veia caudal dos camundongos. A quantificação dos parasitos foi realizada segundo a técnica descrita por Brener (1962).
3.5.2. Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real (qPCR)
Para a realização da qPCR, foram coletados aproximadamente 200 µL de sangue pelo plexo venoso retro-orbital dos animais e adicionados a 35 μL de solução de citrato de sódio com concentração de 129mM. O material coletado permanecia armazenado a 4-8ºC até o momento da extração, realizada no mesmo dia. Foi realizada a quantificação da carga parasitária das amostras coletadas no 6o mês após o tratamento. A seguir, encontra-se a descrição sucinta de cada etapa desta reação:
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22 i ) Extração do DNA
A extração de DNA genômico do sangue total dos animais infectados pelo T. cruzi foi realizada utilizando-se o kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega. Foram transferidos 200 μL do sangue coletado de cada animal infectado para microtubos de 1,5 mL contendo 600 μL de Cell Lysis Solution. O conteúdo dos tubos foi homogeneizado por inversão (5-6 vezes) e mantido a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida os microtubos foram centrifugados por 20 segundos a 13.000 x g e o sobrenadante removido, restando apenas 10-20 μL de líquido residual, os quais foram levados ao vórtex por 15 segundos, para a ressuspensão das células brancas do sangue. Posteriormente foram adicionados 200 μL de solução de lise nucléica aos microtubos, os quais foram incubados por 45 minutos em banho-maria a 37 oC. Ao atingir a temperatura ambiente, foram adicionados 67 μL da solução de precipitação protéica aos microtubos que foram homogeneizados em vórtex por 15 segundos e centrifugados por 3 minutos a 13.000 x g. O sobrenadante de cada amostra, contendo o DNA, foi transferido para um microtubo de 0,6 mL, contendo 200 μL de isopropanol. Os microtubos foram invertidos várias vezes para a precipitação do DNA e centrifugados por 1 minuto a 13.000 x g. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados 300 μL de etanol 70% seguido de centrifugação por 1 minuto a 13.000 x g. Após o descarte do sobrenadante, o microtubo foi invertido sobre papel absorvente para secagem por 20 minutos, sendo o DNA reidratado em seguida com 67 μL da solução de reidratação e incubado a 4o C por 48 horas.
ii) Quantificação do DNA e geração da curva padrão da qPCR
Os ácidos nucléicos extraídos foram quantificados pelo espectrofotômetro NanoVue PlusTM (GE Healthcare) e as concentrações de DNA ajustadas para 25 ng/µL. A curva padrão foi gerada com 5 diluições seriadas em água do DNA proveniente do padrão sanguíneo contendo 5 x 106 parasitos/0,1 mL de sangue. O termo “padrão sanguíneo” refere- se ao DNA extraído de padronizadas quantidades de sangue proveniente de camundongos saudáveis acrescidos de quantidades conhecidas de parasitos.
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23 iii) Amplificação do DNA
Para cada amostra, analisada em duplicata, a reação de PCR continha 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,35 μM de oligonucleotídeos iniciadores específicos para a repetição de 195 pares de bases (pb) do DNA do T. cruzi, TCZ-F 5’- GCTCTTGCCCACAMGGGTGC-3’, onde M = A ou C (Invitrogen), e TCZ-R 5’- CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3’, (Moser et al., 1989, modificado por Cummings e Tarleton, 2003) o qual amplifica um produto de 182 pb, 5 μL de Sybr®Green PCR Mastermix, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. Separadamente, para cada amostra era também realizada uma reação em duplicata para dosar o TNF-α, utilizado como controle endógeno normalizador contendo 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,50 μM de oligonucleotídeos iniciadores TNF-5241 5’-
TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA-3’ e TNF-5411 5’-CAGCA
AGCATCTATGCACTTAGACCCC-3’ (Cummings e Tarleton, 2003), o qual amplifica um produto de 170 pb, 5 μL de “Sybr® Green PCR Mastermix”, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. As reações foram distribuídas em placas de 96 poços (Fast 96-Well Reaction Plate, 0,1 mL, MicroAmp™) e levadas ao termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems). O programa de termociclagem consistia de aquecimento a 95o C por 10 minutos, 40 ciclos de 94o C por 15 segundos e 64,3o C por 1 minuto, com aquisição da fluorescência a 64,3o C. A amplificação foi imediatamente seguida por um estágio de dissociação em que há uma desnaturação inicial a 95o C por 15 segundos, resfriamento a 60o C por 1 minuto e aumento gradual de temperatura de 0,3o C/s até 95o C. Cada placa continha um controle negativo da extração (proveniente de camundongo normal) em duplicata, e um controle negativo da PCR, em duplicata, com água no lugar de DNA, para a reação com oligonucleotídeos iniciadores do T. cruzi e do TNF-α. A média dos valores obtidos para o T. cruzi foi normalizada pela sua divisão com a média dos valores obtidos para o TNF-α, após a mensuração por sobreposição às curvas padrão de T. cruzi e TNF-α. As eficiências de amplificação foram determinadas pela fórmula: Eficiência (E) =
10(−1/slope), onde slope corresponde à inclinação da curva padrão (Stordeur et al.,
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24 3.6. Mortalidade
A taxa de mortalidade foi calculada contando-se todos os animais que morreram durante o período de 30 dias após o término do tratamento. Os resultados foram expressos em percentagens.
3.7. Avaliação sorológica
Foram coletados aproximadamente 500µL de sangue não heparinizado do seio venoso retro-orbital dos camundongos e transferido para tubos eppendorf de 1,5mL, sendo estes centrifugados a 3500rpm por 10 minutos. Os soros foram armazenados em novos tubos e estocados a -80°C. A coleta foi realizada no 30o dia após o fim do tratamento.
Foram utilizados antígenos da forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi, obtidos de cultivo acelular em meio LIT. Como conjugado foram utilizadas anti- imunoglobulinas de camundongo IgG marcadas com peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery, USA).
O ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) foi realizado segundo a metodologia descrita por Voller et al., (1976), modificada de acordo com o protocolo descrito a seguir. O teste foi executado em placas de poliestireno com 96 poços de fundo chato. Cada poço da placa foi tratado com extrato antigênico de epimastigotas, na concentração definida previamente por titulação em bloco, diluído em solução tampão carbonato. As placas foram incubadas a 4oC por 18h e após este intervalo de tempo foram bloqueadas com PBS + SFB e incubadas a 37ºC. A próxima etapa consistiu na adição de soro de cada animal, e incubação a 37ºC.
Posteriormente foi adicionado o conjugado, diluído em PBS-Tween, conforme titulação prévia, e as placas foram novamente incubadas a 37ºC. Finalmente, foi adicionada a solução de substrato (O-fenilenodiamino-OPD, solução de ácido cítrico e H202) e posteriormente a reação foi interrompida com a adição de ácido sulfúrico. A
leitura foi realizada em leitor de microplaca (BIO RAD, Modelo 3550) com filtro de 490nm. Em cada placa foram adicionados 10 soros controles negativos e quatro controles positivos. A absorbância discriminante, em cada placa, foi calculada tomando-
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se a média da absorbância dos 10 soros negativos somados a dois desvios padrões. Posteriormente foi calculado o índice de reatividade, dividindo o valor da absorbância de cada amostra encontrada pela absorbância discriminante, sendo os valores encontrados entre 0.9 e 1.1 considerados duvidosos, valores abaixo de 0.9, negativos e acima de 1.1, considerados positivos.
3.8. Necrópsia
Os animais foram necropsiados seis meses após o término do tratamento. A eutanásia foi realizada através do deslocamento cervical, e posteriormente foi realizada uma incisão ventral, para a retirada do coração. Os corações destes animais foram coletados, conservados em gelo e fixados em solução tamponada de formol 10%.
3.9. Avaliação da presença de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco Para avaliação da presença de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco, os corações fixados em formalina, foram desidratados e embebidos em parafina. Os blocos formados foram cortados em secções de 4 µm de diâmetro, corados pela Hematoxilina & Eosina e pelo Tricrômico de Masson para o exame morfométrico da inflamação e fibrose cardíaca, respectivamente.
3.9.1. Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)
Para evidenciação do infiltrado inflamatório, cortes seriados de fragmentos cardíacos foram desparafinizados em dois banhos de xilol, 15min cada, hidratados em soluções alcoólicas de concentrações decrescentes de álcool (100%, 90%, 80% e 70%), 10min cada, e lavados em água corrente por 10min e em tampão fosfato (PBS) pH 7,2 por cinco minutos. Em seguida, os cortes foram corados pela hematoxilina por 10 minutos, lavados em água corrente e diferenciados rapidamente em álcool acidulado, novamente lavados em água corrente e corados pela Eosina durante um minuto. Após o último processo de lavagem em água corrente, foram levados até a estufa 56oC para secagem. Posteriormente colocados em banho de xilol durante 6min, e então, montadas as lâminas com auxílio de entellan.
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Os núcleos celulares presentes nas lâminas confeccionadas com o coração dos camundongos foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida igual a 1,49 106 m2). As imagens visualizadas pela objetiva de 40 foram
digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3.
3.9.2. Técnica de Tricrômico de Masson
Para a observação de tecido conjuntivo fibroso e determinação da fibrose, fragmentos cardíacos foram corados pela técnica de Tricrômico de Masson. Após a desparafinização e a hidratação dos cortes, estes foram corados com hematoxilina por dois minutos, lavados em água corrente e corados durante cinco minutos pela solução número 1 (90ml Sudam 1% em solução alcoólica, 10ml fucsina ácida 1% em solução aquosa e 1ml de ácido acético glacial). Posteriormente foram lavados em água corrente e corados durante 10 minutos pela solução número 2 (2,5g ácido fosfotúngstico, 2,5g ácido fosfomolíbdico em 100ml de água destilada), novamente lavados. Em seguida, corados por 5 minutos pela solução número 3 (2,5g azul de anilina, 2ml ac. acético glacial em 100ml água destilada), lavados e submetidos à solução de água acética 10% durante cinco minutos. Realizado o último processo de lavagem, os cortes foram desidratados, secados em estufa (56oC) e colocados em xilol por 30min, seguindo-se a montagem das lâminas com auxílio de entellan.
Utilizando o analisador de imagens, foram obtidas 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida igual a 1,49 106 m2) de cada fragmento cardíaco. As
imagens visualizadas pela objetiva de 40 foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3.
3.10. Análise Estatística
Os resultados dos níveis de parasitemia, de anticorpos e da análise morfométrica foram expressos como a média + o desvio padrão para cada teste. Estas variáveis foram analisadas pelo teste Mann-Whitney. A verificação do efeito dose-dependente na
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redução da parasitemia foi realizada utilizando-se o Coeficiente de Correlação de Pearson. Os dados foram considerados significativos quando a probabilidade de erro foi menor que 5% (p< 0,05).
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