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A doença de Chagas faz parte do grupo de doenças infecciosas consideradas “extremamente negligenciadas”, afetando milhões de pessoas em toda a América Latina. Embora recentes avanços tenham sido alcançados no controle da transmissão vetorial e tranfusional nos países da América do Sul, ainda existem problemas críticos, incluindo um tratamento efetivo para os casos crônicos da doença. Após quase um século do descobrimento da doença de Chagas e, apesar do grande volume de trabalhos científicos envolvendo a biologia, imunologia e genética do T. cruzi, ainda não foi possível desenvolver novas e eficazes ferramentas terapêuticas para as pessoas afetadas em diferentes pontos do continente Americano. As duas drogas existentes para o tratamento da moléstia de Chagas, o Nfx e o Bz, são eficazes apenas no tratamento das fases aguda e crônica recente da infecção pelo T. cruzi, apresentando limitações por seus efeitos colaterais, sua utilização prolongada e variação na sensibilidade entre as populações do parasito.
Após a introdução do Nfx e do Bz poucos compostos foram avaliados em ensaios clínicas como o (Allopurinol, Cetoconazol, Fluconazol e Itraconazol), porém os resultados destes ensaios foram contraditórios, sendo observada, na maioria dos estudos, uma baixa eficácia terapêutica (Brener et al., 1993; Apt et al., 2003). Apesar de não terem sido capazes de erradicar a infecção em animais ou humanos, sabe-se que o mecanismo de ação destes compostos certamente produz profundas alterações no protozoário. Especificamente, a terapêutica com o Itz tem mostrado resultados promissores na regressão e prevenção da evolução clínica da doença de Chagas (Apt et al., 2003).
De fato, os investimentos para o desenvolvimento de medicamentos para a doença de Chagas são quase exclusivamente em pesquisa pré-clínica, embora estudos clínicos de fase II para o Posaconazol e um pró-fármaco do Ravuconazol estejam sendo planejados (Buckner e Navabi et al., 2010). Além disso, dados clínicos têm demonstrado um efeito positivo do Posaconazol na terapia de uma paciente chagásica crônica com lúpus eritematoso sistêmico (Pinazo et al., 2010). No entanto, o elevado custo deste fármaco pode prejudicar seu uso. Esse baixo número de ensaios clínicos podem estar relacionados com (i) a pequena quantidade de investimentos pelas indústrias farmacêuticas devido à perspectiva de retornos financeiros insuficientes, (ii)
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conceitos equivocados em relação à ausência do parasitismo durante a fase crônica, e (iii) a falta de procedimentos padrão para a triagem de drogas (de Castro et al., 2011).
A maioria das doenças negligenciadas é excluída das metas dos programas de pesquisa e desenvolvimento das indústrias farmacêuticas, estando, portanto, fora do mercado farmacêutico, apesar de aproximadamente 14 milhões de pessoas viverem em países em desenvolvimento e morrerem, a cada ano, por doenças infecto-parasitárias. Entre 1975 e 2004, entre as 1556 novas moléculas de drogas comercializadas no mundo, apenas 21 eram direcionadas para doenças negligenciadas (8 para malária, 3 para tuberculose e 10 para todas as outras doenças negligenciadas) (Chung et al., 2008). Essa realidade persiste até hoje reforçando a necessidade pelo desígnio e síntese de novos compostos, bem como pela identificação de novos alvos terapêuticos e/ou estratégias para o tratamento dessas doenças. Além disso, a garantia do desenvolvimento, disponibilidade e acessibilidade de medicamentos essenciais para o tratamento das doenças negligenciadas exigem, ainda, uma reorientação das prioridades políticas para o desenvolvimento de “novos fármacos” e para a proteção à saúde da população. Porém, como a disponibilidade de “novos fármacos” ainda é reduzida para as doenças negligenciadas, abre-se um campo de estudo voltado para a avaliação de drogas já existentes no mercado e suas possíveis combinações farmacológicas, visando a melhoria da atividade e a redução da toxicidade.
A politerapia para o tratamento da doença de Chagas foi primeiramente testada na infecção experimental em camundongos por Araújo et al. (2000), sendo demonstrado um efeito sinérgico positivo da combinação do Benznidazol com Cetoconazol para os isolados de cepas Y e Cl do T. cruzi, parcialmente resistentes e sensível, respectivamente, ao nitroderivado. Mais recentemente, Benaim et al (2006) mostraram que a atividade anti-T. cruzi do composto antiarrítmico Amiodarone é potencializado pelo Posaconazol. Estes resultados enfatizam a importância de identificar compostos disponíveis comercialmente para explorar o seu potencial em combinação para o tratamento específico da doença de Chagas.
Considerando estes aspectos, o objetivo dessa proposta foi verificar a ocorrência do efeito sinérgico da utilização do fármaco correntemente utilizado no tratamento da doença de Chagas, o Benznidazol, em combinação com o Itraconazol, inibidor da biossíntese do ergosterol.
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Para a determinação da atividade anti-T.cruzi in vivo de novos compostos ou de combinações de drogas é necessário a identificação de um modelo experimental apropriado para cada etapa do estudo. O T. cruzi pode infectar um grande número de mamíferos, incluindo um grande número de espécies comumente utilizadas como modelo experimental na quimioterapia de doenças infecciosas. O camundongo é, entre eles, o melhor modelo por mimetizar as características da doença de Chagas aguda, com um grande número de parasitos no sangue periférico e nos tecidos (Brener et al., 2000), bem como por mimetizar vários aspectos da fase crônica da doença (Garcia et al., 2005, Caldas et al., 2008).
Para a realização desse estudo, foi utilizada a cepa Y do T. cruzi. Esta cepa foi escolhida por apresentar algumas particularidades como a indução de alta parasitemia e 100% de mortalidade na infecção murina, facilitando, neste caso, a avaliação da atividade tripanocida das diferentes doses de cada composto administradas isoladamente ou em combinação. Além disso, deve ser considerado que esta cepa é parcialmente resistente ao Bz (Filardi e Brener, 1987).
Inicialmente, foi avaliada a eficácia do tratamento de camundongos infectados pela cepa Y do T. cruzi com Bz ou Itz administrados em monoterapia. As três doses selecionadas foram: (i) a dose capaz de induzir cura parasitológica na infecção murina (Filardi e Brener, 1987; Toledo et al., 2003), (ii) três quartos da dose curativa e (iii) metade da dose curativa. Nossos resultados demonstraram que os tratamentos realizados com Bz, independente da dose utilizada foram capazes de induzir a supressão da parasitemia e da mortalidade em 100% dos animais. No entanto, após o tratamento, foi detectada a reativação da parasitemia em 30% dos animais tratados com 100mpk e em 100% daqueles que receberam 50 ou 75mpk de Bz. Em relação aos animais tratados com Itz foi detectada 100% de supressão da parasitemia nos animais tratados com 100mpk, enquanto nos animais tratados com 75mpk foi detectada apenas em 30% (3 de 10), não sendo observada a supressão da parasitemia entre os animais que receberam 50mpk de Itz. De forma semelhante, a mortalidade foi suprimida apenas nos animais tratados com 100mpk de Itz, sendo detectado 60% (6 de 10) de mortalidade entre os animais tratados com 50 e 75 mpk até o 30o dia após o tratamento.
Para confirmar a eficácia do tratamento em induzir cura parasitológica, os animais que não apresentaram reativação da parasitemia pelo exame de sangue a fresco
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até 30 dias após o tratamento, foram submetidos à imunossupressão com Ciclofosfamida (Cy) e avaliados diariamente durante a imunossupressão e até 10 dias após seu fim para detectar a ocorrência da reativação da parasitemia. Esta metodologia foi eficiente no controle de cura, pois a imunossupressão induziu a reativação da parasitemia em grande parte dos animais não curados, permitindo uma avaliação mais rápida da eficácia do tratamento além de minimizar a necessidade de realização da qPCR. Segundo Calebrese (1999) após a cura clínica evidenciada na fase aguda da doença de Chagas, o equilíbrio entre os parasitos remanescentes e o hospedeiro pode ser rompido com o uso de drogas imunossupressoras, o que então facilita a identificação das falhas terapêuticas.
A Cy faz parte de um subgrupo de substâncias designadas como agentes alquilantes, são fármacos citotóxicos ou citostáticos, também conhecidos como anti- neoplásicos. O seu mecanismo de ação consiste em provocar danos em alvos celulares, induzindo ligação cruzada e/ou fragmentação das hélices de DNA impedindo a divisão celular, afetando as células em todas as fases do ciclo celular de forma inespecífica. Este fármaco possui também atividade imunossupressora (Cupps et al., 1982), afetando várias funções imunológicas (Calabrese et al., 1996). Em infecções agudas no modelo murino ou canino a utilização de Cy tem demonstrado que este composto é capaz de modular a inflamação cardíaca e dependendo do esquema terapêutico e da dose utilizada, pode induzir aumento da miocardite e do parasitismo tecidual (Calabrese et al., 2003; Andrade et al., 1987, Silva e Rossi, 1990). No entanto, estudos realizados por Santos et al. (2010) demonstraram que quando os animais foram imunossuprimidos após 60 dias de infecção e eutanasiados com 84 dias de infecção não houve diferença significativa na intensidade do processo inflamatório detectado no coração dos animais imunossuprimidos em relação aos não imunossuprimidos. Diferentes estudos demonstraram que as características da reativação da parasitemia são variáveis, e que podem estar relacionadas com a população do parasito e com a fase da infecção (Pereira et al., 1996, Santos et al., 2010).
Naqueles animais que não apresentaram o exame de sangue a fresco positivo após a imunossupressão com Cy, foi realizada a coleta de sangue no 1o e no 6o mês após o tratamento para a realização da qPCR. Os animais que apresentaram todos os testes negativos foram considerados curados.
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A PCR tem sido utilizada com mais freqüência nos últimos anos por demonstrar elevada sensibilidade na detecção do DNA do T. cruzi. Vários estudos têm demonstrado a grande sensibilidade desta técnica, variando de 45 a 100% (Brito et al, 1995a e b; Gomes et al.,1998; Ávila et al.,1993, Veloso et al., 2008). Esta variação na sensibilidade da PCR pode ser explicada, ao menos parcialmente, pela intermitente presença e pela quantidade de parasitos circulantes no momento da coleta do sangue, pelos iniciadores utilizados, pela variabilidade genética entre as populações do parasito, que pode influenciar na eficiência da amplificação, pelo método de extração do DNA utilizado, dentre outros (Schijman et al., 2011). A PCR convencional apresenta algumas desvantagens como: o longo tempo necessário para a realização da técnica, o alto risco de resultados falso positivos, já que o produto de amplificação deve ser manipulado para a visualização em géis de agarose ou poliacrilamida e a impossibilidade de se realizar análises quantitativas com precisão, uma vez que o cálculo do produto amplificado é limitado ao plateau da curva de amplificação (Piron et al., 2007). Em contraste, a qPCR usa corantes ou sondas fluorescentes permitindo o contínuo monitoramento da reação durante o processo de amplificação. Suas principais vantagens são o processamento rápido de resultados (amplificação e detecção em apenas uma etapa) e o risco reduzido de contaminação (manipulação mínima de amostras). Uma vez que a amplificação do ácido nucléico e as etapas de detecção são realizadas em um mesmo tubo, o risco de liberação de ácidos nucléicos amplificados para o ambiente e a contaminação das reações seguintes é muito baixo comparado ao risco proporcionado pela PCR convencional (Bankowski e Anderson S.M, 2004; Cockerill, III, 2003; Mackay, 2004). De acordo com Duffy et al (2009), a qPCR é altamente eficiente no monitoramento da recrudescência da parasitemia em indivíduos imunossuprimidos e na avaliação da resposta ao tratamento específico em indivíduos chagásicos transplantados que receberam a quimioterapia imunossupressora. Neste contexto, qPCR emerge como uma ferramenta molecular necessária e devidamente apropriada para monitorar a carga parasitária em infecções experimentais.
De acordo com os resultados dos testes parasitológicos e molecular utilizados no controle de cura dos animais tratados em monoterapia, foi observado que apenas o tratamento realizado com Bz na concentração de 100mpk foi capaz de induzir cura parasitológica, que foi de 70%. No entanto, todos os tratamentos com Bz ou Itz foram
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capazes de induzir redução significativa da parasitemia em relação ao controle infectado e não tratado, sendo observado para ambas as drogas, um efeito dose-dependente, demonstrada pela análise de correlação de Pearson. Em concordância com nossos resultados, Ferraz et al. (2007) observaram que o Bz foi capaz de suprimir a proliferação de parasitos durante o tratamento de camundongos experimentalmente infectados com a cepa Y do T.cruzi. McCabe et al (1986) também observaram supressão da parasitemia induzida pelo tratamento com Itz in vitro e in vivo na fase aguda. Recentemente, Almeida et al (2009) demonstraram efeito positivo do Itz na terapia de um paciente chagásico co-infectado pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), uma vez que o medicamento foi eficaz na redução da parasitemia do T. cruzi, prevenindo a morbidade.
Resultados melhores foram observados quando os dois fármacos foram usados em combinação. Todas as associações induziram supressão da parasitemia com um menor número de doses administradas quando comparado às maiores doses dos compostos administrados em monoterapia, 100mpk. Além disso, os animais que receberam a terapia combinada com Bz nas concentrações de 100 e 75 mpk tiveram uma taxa de sobrevivência de 100%, semelhante aos animais que receberam o tratamento com as doses isoladas de Itz e Bz nas concentrações de 100mpk.
O melhor efeito tripanocida obtido pela combinação Itz/Bz foi comprovado pelas maiores reduções na carga parasitária observadas pela técnica de exame de exame de sangue a fresco (antes e após imunossupressão com Cy) e pela quantificação da parasitemia realizada através da qPCR, 6 mês após o tratamento. Todas as combinações induziram maiores reduções nos níveis de parasitemia quando comparado ao tratamento realizado em monoterapia com Itz 100mpk, com exceção de Bz/Itz 50/100mpk, sendo importante destacar as combinações Bz/Itz 100/100, 100/50 e 75/75mpk, as quais induziram reduções maiores que o tratamento realizado com Bz 100mpk.
Levando em consideração os resultados do exame de sangue a fresco e da qPCR, todas as combinações induziram maiores percentuais de cura em relação às mesmas doses administradas isoladamente, sendo importante destacar novamente as combinações Bz/Itz 100/100, 100/50 e 75/75mpk com 80% de cura. Desse modo, os resultados apresentados, avaliados de forma conjunta indicam claramente a indução do efeito sinérgico pela combinação de Bz e Itz. Derivados azólicos utilizados em
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combinação com EBIs, que atuam em outros pontos da via de biossíntese do ergosterol, também conduziram a um efeito sinérgico anti-T. cruzi (Lazardi et al. 1990, Maldonato et al., 1993).
Neste trabalho foi avaliada, também, a influência da terapia de combinação nos níveis de anticorpos da classe IgG 30 dias após o fim do tratamento. Estudos da resposta imune humoral demonstram que os anticorpos exercem um importante papel no controle da parasitemia e na resistência à infecção pelo T. cruzi (Krettli e Brener, 1976). A infecção pelo parasito leva à ativação policlonal de células B, responsável pela hipergamaglobulinemia observada (Minoprio et al., 1986). Anticorpos da classe IgG são produzidos logo no início da fase aguda da doença e reagem principalmente com moléculas de superfície das formas tripomastigotas, sendo importantes no controle do parasitismo. Desse modo, juntamente à negativação dos testes parasitológicos, os baixos níveis de anticorpos anti-T. cruzi é indicativo de sucesso terapêutico (Cançado, 1963, 1997).
Para essa análise os animais foram classificados de acordo com os resultados dos testes parasitológicos e molecular utilizados no controle de cura. Os animais que apresentaram todos os testes negativos foram considerados curados. O índice de reatividade detectado nos soros dos animais curados tratados com as diferentes doses de Bz e Itz combinadas e com Bz 100mpk em monoterapia foram sempre menores quando comparados aos não curados, com exceção dos animais tratados com a associação de Bz/Itz 50/100mpk. Além disso, os índices de reatividade foram similares entre os animais curados que receberam o tratamento em combinação com as doses de Bz 100 e 75 mpk e os animais curados que receberam o tratamento em monoterapia com a dose padrão de Bz (100mpk). Nossos resultados indicam a marcante redução da carga parasitária já sugerida pelos testes parasitológicos, reforçando a eficácia da terapia combinada. Estes resultados estão de acordo com os dados de Garcia et al. (2005) que demonstraram uma redução dos níveis de anticorpos anti-T. cruzi nos animais tratados com Bz. Na infecção chagásica humana, também foi evidenciado a redução dos níveis de anticorpos específicos da classe IgG após realização do tratamento com Bz (Andrade et al., 2004; Sosa Estani et al., 1998; 1999).
A ativação inicial do sistema imune, na doença de Chagas, está aparentemente relacionada com a resistência do hospedeiro à infecção. A infecção aguda pelo parasito
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é acompanhada por uma intensa reação inflamatória em muitos tecidos, incluindo o coração, a qual é crítica para o controle da proliferação parasitária. O processo inflamatório pode progredir para fibrose e remodelagem cardíaca, resultando em uma cardiomiopatia dilatada acompanhada por disfunção miocardial, comum no estágio crônico da doença (Higuchi et al., 2003).
A cardiomiopatia é a patologia mais comum observada na doença de Chagas (Rossi e Bestetti, 1995; Tanowitz et al., 2009), sendo a maior causa de morte por falha cardíaca na América Latina (Hardison et al., 2006). Atualmente, há um crescente consenso de que a persistência do parasito, juntamente com o desequilíbrio da resposta imune em alguns indivíduos, leva a uma sustentada resposta inflamatória que fundamenta as lesões características da infecção. Higuchi et al (1993) e Palomino et al (2000) detectaram antígenos de T. cruzi em 100% dos corações de chagásicos crônicos que morreram devido à insuficiência cardíaca. Jones et al (1993) detectaram a presença do parasito no tecido cardíaco em 94,7% de pacientes chagásicos com cardiopatia grave. Na maioria dos casos, não é possível fazer uma correlação entre a intensidade da lesão e a quantidade de antígeno e/ou DNA do T. cruzi, sugerindo que o parasito pode ser responsável pelo desencadeamento e manutenção do processo de patogênese no miocárdio, e que este seria amplificado por mecanismos auto-imunes que dependeriam da predisposição genética do hospedeiro (Girones e Fresno., 2003; Anez et al.,1999; Bellotti et al.,1996; Higuchi, 1995; Jones et al.,1993).
Com o objetivo de avaliar o impacto do tratamento na evolução das lesões cardíacas, realizou-se a análise quantitativa do número de células inflamatórias e da área preenchida por colágeno no coração dos animais. Para essa análise os animais também foram classificados de acordo com os resultados dos testes parasitológicos e molecular utilizados no controle de cura. Foram avaliados três animais curados e três não curados de cada grupo. Aqueles casos em que o número de animais era inferior a três, não foram avaliados.
Nossos resultados mostraram que entre os animais curados, nenhum grupo avaliado (tratados com Bz 100mpk ou com as combinações Bz/Itz 100/100, 100/50, 75/75 e 75/50mpk) apresentou celularidade ou áreas de fibrose significativamente maior que as observadas nos animais não infectados e não tratados (NI).
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Em relação aos animais não curados, as três combinações avaliadas Bz/Itz 75/50, 50/100 e 50/50mpk apresentaram celularidade inferior aos animais tratados em monoterapia com 100mpk de Bz e Itz, sendo importante destacar as combinações Bz/Itz 75/50 e 50/100mpk, com diferenças significativas. Adicionalmente, a área ocupada por colágeno foi significativamente menor no grupo tratado com Bz 100mpk quando comparada ao grupo tratado com Itz100mpk. Os animais tratados com as três combinações apresentaram menor desenvolvimento de fibrose em relação aos tratados com Itz100mpk, apresentando os animais tratados com as combinações Bz/Itz 75/50 e 50/50mpk diferenças significativas em relação aos animais tratados em monoterapia com 100mpk de Bz ou Itz.
Juntos, os dados apresentados demonstram que os animais tratados com as diferentes combinações de Bz e Itz apresentaram áreas de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco similares ou menores quando comparado aos animais tratados em monoterapia com Bz 100mpk, mesmo quando a cura parasitológica não é observada. Os resultados obtidos são consistentes com a hipótese de que o parasitismo tecidual é um componente essencial da inflamação durante a fase crônica da doença de Chagas (Jones et al., 1993; Vago et al., 1996). Estes podem ser correlacionados com a diminuição da carga parasitária induzida pela terapia combinada e em monoterapia. A regressão de lesões inflamatórias e fibrose têm sido relatadas em experimentos realizados com camundongos cronicamente infectados recebendo tratamento quimioterápico (Andrade et al., 1991). Segundo estes autores, o grau de regressão das lesões correlacionou-se com o sucesso do tratamento, onde camundongos curados parasitologicamente apresentaram as mais marcantes reversões de sinais patológicos (Tarleton et al., 1994). Andrade et al. (1989); Segura et al (1994); Garcia et al. (2005) e Bustamante et al. (2007) demonstraram redução da fibrose, das lesões e disfunções fisiológicas em animais experimentalmente infectados com o T. cruzi e submetidos ao tratamento específico. Estudando pacientes, da Silva et al. (1994) e Viotti et al. (2006) demonstraram melhora clínica e eletrocardiográfica em pacientes tratados quando comparados aos pacientes não tratados após diferentes períodos de avaliação.
Nossos resultados demonstram níveis de cura semelhantes entre os animais infectados pela cepa Y do T. cruzi tratados em monoterapia com Bz (70%) e em