Anion superóxido

A quantificação da fluorescência dada pela interação do DHE com o superóxido (µm2_{) representada em porcentagem do grupo controle (WKYsd) no}

grupo SHRsd esta maior em relação aos outros grupos (Figura 21).

A abaixo estão representadas as imagens feitas com microscópio confocal dos quatros grupos WKYsd, WKY tr, SHRsd e SHRtr (Figura 20 a,b,c e d respectivamente)

(a) (b)

(c) (d)

FIGURA 20 - As figuras representam o superóxido vascular mensurado por fluorescência de DHE em aorta de ratos, por microscopia confocal (40x) dos grupos WKYsd (a), WKYtr (b), SHRsd (c) e SHRtr (d).

WKY SHR 0 100 200 300 sd tr

*

FIGURA 21 - Conteúdo de superóxido (µm2_{) em aorta dos grupos SHRsd (n=4),}

SHRtr (n=4), WKYsd (n=4) e WKYtr (n=4) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, porcentagem do controle. *p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr e SHRtr, #p<0,05 SHRsd.

8. DISCUSSÃO

Nossos resultados demonstram que, na oitava semana de vida (fase pré- treinamento), os ratos SHR apresentaram valores de PAS, PAD e PAM

significativamente maiores do que os ratos WKY. No entanto, a massa corporal, a FC de repouso e o VO2 pico foram semelhantes entre os grupos. Quanto à função

vasomotora aórtica, os ratos apresentaram menor resposta vasodilatadora à ACh, bem como resposta contrátil em concentrações elevadas de ACh. Além disso, os ratos SHR apresentaram um estado de estresse oxidativo vascular, evidenciado pelo índice de produção de superóxido aumentado, associado à maior expressão protéica da NOX4 e menor biodisponibilidade de NO, embora a expressão protéica da eNOS esteja aumentada. O programa de treinamento físico de natação foi eficiente em promover bradicardia de repouso, aumentar significativamente o VO2pico e diminuir as PAS, PAD e PAM no grupo SHRtr comparado ao grupo SHRsd. Além disso, o treinamento físico modificou sobremaneira a função vasomotora e a bioquímica da aorta torácica, destacando-se uma melhorar na resposta vasodilatadora à ACh, associada à diminuição do índice de produção de superóxido e expressão da NOX4, bem como aumento na biodisponibilidade de NO vascular.

Sabe-se que os modelos SHR apresentam aumento da pressão arterial, a partir aproximadamente 5-6 semanas de vida (HORTA, DE CARVALHO, MANDARIM-DE-LACERDA, 2005). De fato em nosso trabalho, onde foi realizado com ratos que apresentavam 8 semanas de idade no inicio do protocolo, o grupo SHR tinha esta mesma resposta de aumento em relação aos controles WKY. Já nas outras variáveis como freqüência cardíaca e as observadas no teste de esforço (Tabela 1) parecem não ter alterações em SHR com 8 semanas de idade, isto também já observado em outros trabalhos (AZEVEDO, BRUM, MATTOS, JUNQUEIRA, RONDON, BARRETTO, NEGRAO, 2003; GRAHAM, RUSH, 2004; REN, 2007). Estas observações demosntram, no presente estudo, que o aumento da pressão arterial, provavelmente, é a primeira alteração cardiovascular em SHR, visto que a freqüência cardíaca e VO2 pico não estão diferentes dos controles, onde esta última variável é a resposta da capacidade funcional destes ratos.

Em relação à massa corporal em nossos ratos não tem diferença entre os grupos, e esta resposta parece ser característico da faixa etária dos ratos hipertensos (GRAHAM, RUSH, 2004). Entrentanto, Jun Ren, 2007 demontrou que SHRs com 12 meses de idade apresentavam menor peso corporal em relação aos

seus controles , provavelmente devido à característica do desenvolvimento desta patologia (REN, 2007).

Após o período de treinamento físico, os ratos SHRtr apresentaram menor pressão arterial (sistólica, diastólica e média) em relação aos SHRsd, mas ainda a PAS e a PAM permaneceram diferentes dos WKYsd e WKYtr. O mesmo foi observado em outro estudo (HORTA, DE CARVALHO, MANDARIM-DE-LACERDA, 2005) onde o grupo que realizou treinamento físico aeróbio (55% do VO2max.), neste caso em esteira rolante, apresentou menor pressão arterial sistólica em relação aos seus respectivos que permaneceram sedentários, e só se igualaram ao grupo dos WKY na décima terceira semana de treinamento físico aproximadamente. O presente estudo, foi realizado com 10 semanas de treinamento físico, onde restaurou parcialmente a PAM e PAS destes ratos, talvez seria necessário um período maior de treinamento para que as alterações se tornem mais expressivas.

Em relação á PAD, a qual foi normalizada, sabe-se que esta diretamente relacionada à resistência vascular periférica (RVP), desta forma, de acordo com a Lei de Poiseuille referente à dinamica dos fluidos, um fator de grande importância que determina a resistência vascular é o raio do tubo condutor, no caso, o raio do vaso, o qual é elevado à quarta potência (Gradiente de pressão x Raio do vaso4 / comprimento do vaso x viscosidade do líquido). Deste modo, pequenas alterações no raio do vaso, como aumento da resposta vasodilatadora à Ach, causam grandes mudanças na RVP (WILLIAN D. MCARDLE, 2008). Entretanto, os resultados obtidos na reatividade vascular serão discutidos posteriormente, e por se tratar de um experimento in vitro, os dados não podem ser extrapolados para os resultados in

vivo somente relacinados de forma sucinta.

Se as características de freqüência cardíaca e relacionadas ao teste máximo anteriores ao período de treinamento físico não apresentaram diferenças entres os grupos, por outro lado, no presente estudo o exercício teve influência significativa nestas variáveis.

Já foi bem demonstrado que o treinamento de natação tem predominância oxidativa, e que em ratos normotensos a partir da sexta semana de treino apresentam bradicardia de repouso com o treinamento de natação (MEDEIROS et al., 2004). Este fato em nosso trabalho foi observado, tanto na bradicardia de

repouso quanto na melhora no VO2pico, dos ratos que realizaram o treinamento (WKYtr e SHRtr). Além disso, os mesmos ratos melhoram a tolerãncia ao esforço, este fato demonstrado da distancia percorrida no teste de esforço máximo. Estas respostas demonstram a efetividade do treinamento físico de natação realizado, em melhorar a capacidade física funcional destes ratos.

Outro fato, o qual é plausível de ser mensionado é a queda do VO2 pico e nas variáveis de tolerância ao esforço após o período de sedentarismo dos WKYsd e SHRsd. Baseado nestas respostas pode-se relatar que o treinamento físico, além de previnir a queda também melhora a capacidade funcional destes ratos.

Os resultados discutidos até o momento estão relacionados á variáveis que caracterizam os grupos, quanto à hipertensão e ao treinamento físico. A seguir, os resultados que serão discutidos já se relacionam aos objetivos do estudo.

O objetivo do presente estudo foi de avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbico (natação) sobre a resposta vasomotora (dilatação) em aorta de ratos SHR, destacando-se o papel da biodisponibilidade de EROs e de NO nestas respostas. Entretanto para isto, primeiramente é necessário saber quais as alterações encontradas no rato SHR.

O relaxamento induzido pelo NPS, vasodilatador independente do endotélio, não alterou a magnetude do relaxamento nos anéis aorticos em ambos os grupos, demonstrando integridade e funcionalidade da musculatura lisa vascular (ULKER et al., 2003).

Neste estudo, ACh, vasodilatador dependente do endotélio, produziu relaxamento em aneis aorticos de ratos WKY, onde foi dose-dependente. Similarmente ACh produziu relaxamento em anéis aorticos de SHR em doses menores e vasoconstrição em altas doses de ACh.

Deste modo, observamos que os ratos SHRsd apresentaram menor resposta vasodilatadora máxima á acetilcolina (ACh 10-7_{) em relação aos ratos WKYsd,}

apesar de apresentarem relaxamento nesta dose. Este fato, demostra claramente que os ratos SHR apresentam disfunção endotelial (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980; ULKER et al., 2003; GEROVA, KRISTEK, CACANYIOVA, CEBOVA, 2005).

Sabe-se que o grau de disfunção das células endoteliais é demonstrado, a partir de um menor relaxamento á estímulos vasodilatadores e também resposta de

vasocontrição em doses altas de acetilcolina (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980; ULKER et al., 2003), pois com provável disfunção ou perda das células endoteliais a acetilcolina começa a agir diretamente nos receptores muscarínicos no vaso, os quais promovem vasoconstrição (LUDMER, SELWYN, SHOOK, WAYNE, MUDGE, ALEXANDER, GANZ, 1986). Quando os mesmos vasos foram pré-incubados com o inibidor da síntese de NO, L-NAME, os anéis dos SHRsd e WKYsd apresentaram diminuição do relaxamento. Além disso, como os ratos SHRsd apresentaram respostas vasoconstritoras em doses altas de ACh, continuam diferentes dos WKY , quanto somente a sua resposta em doses altas de ACh, demonstrando que a produção de NO não é a somente a responsável por esta vasocontrição paradoxal encontrada neste modelo de SHR.

Sabe-se que á acetilcolina, pode estimular outras vias também responsáveis pela vasodilatação, com a das prostaciclinas agindo em sinergismo com o NO (FELETOU, VANHOUTTE, 2006). Entretanto, esta via não foi estudada para confirmar esta suposição.

Parece que o prejuizo na vasodilatação em SHRs e a atenuação do relaxamento pelo L-NAME em ratos hipertensos e seus controles não é devido a diminuição da expressão protéica da eNOS, pois esta encontra-se aumentada em relação ao grupo controle WKYsd. Evidências na literatura podem confirmar este resultado (ULKER et al., 2003; GRAHAM, RUSH, 2004). Mas ainda existem controversas em relação à este fato, onde alguns trabalhos observam a diminuição da expressão desta proteína em estágios mais avançados da hipertenção (CHOU et al., 1998), demonstrando que esta resposta depende da idade do animais estudados, que por outro lado nos estágios iniciais do desenvolvimento da patologia a eNOS encontra-se aumentada (VAZIRI, NI, OVEISI, 1998).

Apesar deste fato, a expressão protéica não pode confirmar atividade desta proteína e, além disso, espelha o conteúdo da eNOS em uma grande variedade de células aorticas, onde estas mudanças observadas não podem sobretudo refletir somente o conteúdo endotelial.

Embora a disfunção endotelial aparecer, não somente na hipertensão genética, mas também em diferentes tipos de etiologias, o estresse oxidativo pode ser identificado como um denominador comum observado através do aumento da

expressão das subunidades da NAD(P)H oxidase (FELETOU, VANHOUTTE, 2006). A expressão da NOX4 em nossos ratos hipertensos esta aumentada em relação aos controles WKYsd. Diferentemente da NOX1, que apesar de ter uma tendência não mostrou diferença significante entre os grupos SHRsd e WKYsd. Dentre os homólogos da gp91phox (NOX2) a NOX4 é a que apresenta o maior quantidade na células vasculares (MILLER, DRUMMOND, SCHMIDT, SOBEY, 2005). Porém ainda não se descartar a função da NOX1 nestas células (WIND, BEUERLEIN, ARMITAGE, TAYE, KUMAR, JANOWITZ, NEFF, SHAH, WINGLER, SCHMIDT)

Observa-se em trabalhos que estudam SHR com mais idade que a expressão de NOX4 não está aumentada ao contrario da expressão da NOX1 (WIND et al.). Desta forma, as mudanças na expressão destas isoformas são depententes também do estágio da patologia, onde a NOX1 é mais expressa em estágios mais avançados, pois parece ser responsiva à estímulos como AngII (angiotensina II), a qual encontra-se aumentada na hipertensão avançada (LASSEGUE, SORESCU, SZOCS, YIN, AKERS, ZHANG, GRANT, LAMBETH, GRIENDLING, 2001; WINGLER, WUNSCH, KREUTZ, ROTHERMUND, PAUL, SCHMIDT, 2001), causando cronicamente aumento na expressão deste homólogo. A NOX4, por ser mais expressa em células vasculares, suponha-se que ela tem um papel maior na homeostase, a qual tem responsividade no inicio do desenvolvimento da hipertensão com intuito de manter este equilíbrio orgânico, que esta sendo perdido pelo desenvolvimento da hiperensão (WINGLER et al., 2001; LYLE, GRIENDLING, 2006). Porém, mesmo diante destas especulações ainda não é claro na literatura qual o papel de cada um destes homólogos.

Existe uma dificuldade no estudo das adaptações da NAD(P)H oxidase, pelo fato de ela ser um complexo composto por multisubunidades enzimáticas. Desta forma é possível uma resposta diferente de outros componentes que não foram estudados. Entretanto, na ausência destes dados investigamos, a quantidade de superóxido vascular em aorta de SHR, o qual é o componente produzido pela interação das multisubunidades (citosólicas e ligadas à membrana) seguida do estímulo a esta enzima. E, ao analisarmos por imunofluorescência o conteúdo aórtico de superóxido encontramos aumentado no SHR em relação aos WKY demonstrando

um estado de estresse oxidativo na aorta destes ratos.

Quanto aos produtos do metabolismo do NO, onde demonstraram a sua biodisponibilidade aortica, observamos nos SHRsd que o nitrato tem uma forte tendência, mas não é confirmada estatísticamente seu menor conteúdo em relação aos WKY e somente o nitrito esta diminuído.

Os vários tipos de metodologias utilizadas para esta análise prejudicam a comparação desta resposta com a literatura, além de o NO ser uma molécula altamente reagível, mas de fato, no presente estudo esta diminuição não tem relação alguma com a produção de NO pela eNOS (CHOU et al., 1998; VAZIRI, NI, OVEISI, 1998).

Sabe-se que a biodisponibilidade de NO depende também da sua remoção, a qual é feita pela sua interação com o superóxido, onde elimina sua função vasodilatadora produzindo outra espécie reativa de oxigênio como o peróxido de nitrito, altamente lesiva às funções celulares e que não tem função vasodilatadora (SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004; FELETOU, VANHOUTTE, 2006).

Desta forma, o modelo estudado apresenta disfunção endotelial, demosntrada pela diminuição do relaxamento, a qual provavelmente é decorrente da diminuição da biodisponibilidade de NO pela sua interação com o O-2, devido ao

aumento da sua produção provavelmente pela NOX4 em aorta de ratos SHR.

Com o avanço do conhecimento esforços têm sido feitos a fim de encontrar o tratamento ideal para patologia estudada. Sabe-se que o treinamento físico é capaz de melhorar a capacidade funcional e restaurar parcialmente a pressão arterial destes ratos, como também demonstrado em nossos resultados, mas se este fato esta relacionado á melhora da função endotelial ou à alguma alteração intrínsceca do vaso, ainda não se sabe definitivamente.

Em nosso trabalho demonstramos que a disfunção endotelial foi parcialmente revertida pelo treinamento físico aeróbio, ao observarmos o relaxamento máximo, o qual nos ratos SHRsd esta diferente dos SHRtr. Além disso, o grupo SHRtr não apresenta diferença dos WKYsd e tr em doses altas de acetilcolina, desta forma a vasoconstrição em doses altas de ACh é revertida com o treinamento físico.

É de extrema importância enfatizar que se a resposta máxima e a vasoconstrição em doses altas de ACh nos ratos hipertensos caracterizam a

disfunção endotelial e neste estudo podemos demostrar que o treinamnto físico aeróbio de natação pode reverte-la. Quando os mesmos vasos foram incubados com L-NAME não observamos diferença entre os grupos SHRsd e SHRtr demonstrando que a biodisponibilidade de NO tem relação com a melhora do relaxamento causada pelo pelo treinamento físico realizado no presente estudo.

Para investigar este resultado a expressão da eNOS foi quantificado nos ratos treinados e observamos que, ao passo que ela está aumentada em SHR, a fim de restaurar a biodisponibilidade de NO, o treinamento físico pode diminui-la, pois apesar de o grupo SHRtr não estar diferente do SHRsd , também não está diferente dos WKYsd e tr.

Alguns trabalhos realizados com o objetivo de verificar o efeito do treinamento físico aeróbio também observaram estas respostas. (GRAHAM, RUSH, 2004; JASPERSE, LAUGHLIN, 2006). Porém, ainda é difícil relacionar os trabalhos encontrados na literatura, onde as intesidades e os tipos de exercícios estudos são diferentes e, além disso, em relação ao treinamento de natação não encontramos respaudo literário suficiente.

Existem várias evidências na literatura onde sugerem que o estresse oxidativo em ratos SHR está elevado, e que isto poderia levar prejuízo da função vasomotora dependente do endotélio, como já observado anteriormente (WIND et al.; SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004; MIYAGAWA, OHASHI, YAMASHITA, KOJIMA, SATO, UEDA, DOHI, 2007). O presente estudo mostrou que o aumento da expressão dos homólogos da gp91phox (NOX4) causa desequilibriono estado redox, pois leva ao aumento do superóxido, onde prejudica a biodosponibilifdade de NO. Desta forma, o treinamento físico parece ser capaz de reverter parcialmente esta alteração no estado redox, diminuindo a expressão da NOX4, porém ainda continuou diferente dos grupos WKY.

Em relação á NOX1, como nesta fase da hipertensão ela parece não estar alterada, no presente estudo, o treinamento físico não teve interferência neste homólogo.

Para confirmar os resultados obtidos com expressão protéica o metabolitos do NO e o conteúdo de superóxido vascular foram estudados também com o treinamento físico aeróbio de natação, onde foi capaz de normaliza-los, igualando-se

aos WKYsd e tr .

Se o aumento da expressão da eNOS em SHR é necessário a fim de restaurar o conteúdo de NO disponível no vaso, a influência do TF de natação em diminuir a expressão da eNOS se deve ao fato deste conteúdo estar normalizado após este período.

Em relação ao superóxido, sabe-se que a expressão protéica não reflete a atividade enzimática, e sabe-se também, que existem outras fontes de superóxido que podem ser responsáveis pela sua produção, as quais não foram investigadas. Entretanto, pode-se supor que existe um grande relação entre, as respostas de expressão proteica e o conteúdo final encontrado pela fosforilação e/ou ativação destas enzimas.

9. CONCLUSÃO

O objetivo do presente estudo foi de investigar o efeito do treinamento físico aeróbio de natação sobre a resposta vasomotora em aorta de ratos SHR, destacando-se o papel da biodisponibilidade de EROs e de NO nestas respostas. Baseado nas evidências encontradas no presente estudo pode-se concluir que o ratos SHR tem função vasodilatadora dependente do endotélio prejudicada pela diminuição da biodisponibilidade de NO, causada pelo aumento interação com superóxido.

O aumento do nível de atividade físíca tem sido identificado como redutor de morbidade e mortalidade (RODRIGUEZ, CURB, BURCHFIEL, ABBOTT, PETROVITCH, MASAKI, CHIU, 1994) mais especificamente como redutor de marcadores fisiológicos de doença cardiovascular como hirpertensão arterial, disfunção endotelial e rigidez arterial. Em nosso estudo pode-se concluir que os potenciais mecanismos, pelos quais o treinamento físico aeróbio de natação reduz os marcadores de difunção endotelial parecem estar envolvidos com o aumento da biodisponibiladade de óxido nítrico pela diminuição da sua degradação via superóxido reestabelecendo o equilíbrio entre a produção e a remoção do NO.