a Immunoglobulin J chain apresentou um decréscimo quando relacionada à gravidade de MO observado nas coletas A e B (p=0,0113).
Quando os graus de MO são observados isoladamente de acordo com o tempo, observa-se que a intensidade da Immunoglobulin J chain decai de acordo com o aumento do grau de gravidade de MO. E quando os graus de MO dicotomizados segundo a gravidade da mucosite entre grupos com 0, I e II e grupo com gravidade III e IV , a quantidade de proteína permanece a mesma entre os dois períodos do estudo, como demonstrado no Quadro 4.
Quadro 2 Quadro 3
MO grau 0-II MO grau III-IV
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Quadro 4: Intensidade da proteína Immunoglobulin J chain, em unidades arbitrárias, de acordo com o
tempo de coleta (A e B) e o grau de Mucosite Oral (MO). O quadro à direita demonstra a intensidade da proteína entre os diferentes graus de MO de acordo com o tempo de coleta; enquanto à esquerda, a intensidade da proteína entre os graus de MO agrupados entre: MO grau 0-II e MO grau III-IV (ANOVA).
Quando relacionadas as 39 proteínas encontradas no PPS em relação à maior gravidade da MO encontrada até a enxertia da medula óssea, as proteínas Statherin e Immunoglobulin J chain apresentaram uma diferença significativa de acordo com o grau de MO (p= 0,0173 e p= 0,0065 respectivamente). A Sthaterin apresentou uma maior intensidade naqueles pacientes que apresentaram MO grau III e IV, enquanto pacientes com MO grau O-II não mostraram a presença da intensidade desta proteína (Quadro 5).
Entretanto a Immunoglobulin J chain apresentou diminuição de intensidade nos pacientes com grau de MO III-IV. Neste caso, essa proteína foi encontrada com maior presença e com maior intensidade em pacientes que apresentaram grau de MO (0-II), enquanto nos pacientes com grau (III-IV) esta apresentou uma menor intensidade (Quadro 5).
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Quadro 5: Correlação entre intensidade proteica, em unidades arbitrárias, com grau de Mucosite Oral
(MO).
MO grau 0-II MO grau III-IV
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6 DISCUSSÃO
Este estudo avaliou as alterações ocorridas no PPS na fase aguda do TCTH e as correlacionou com as alterações clínicas orais encontradas nesse mesmo período.
Do painel de proteínas totais avaliadas, 65 proteínas foram identificadas na coleta A e 57 na coleta B. Dessas 39/65 (32%) estavam presentes em comum entre os dois períodos de coleta. Entretanto, somente 7/39 (18%) apresentaram diferenças estatísticas quando comparadas entre os dois períodos do estudo.
A proteína Prolactin-Inducible Protein (PIP) apresentou uma queda de intensidade de 25,6% entre as duas coletas. De acordo com a classificação do Banco de Dados Gene Ontology® (GO®), a PIP é responsável pela ligação de membranas a partir da actina, principal componente do citoesqueleto celular. Esta proteína atua principalmente na ligação entre membranas bacterianas, o que facilita a formação do biofilme (63). A PIP também participa na ligação da glicoproteína IgG e de outras glicoproteínas. Esta também inibe apoptose pois regula negativamente células T apoptóticas (63). De acordo com Morzel et al (2014) (64), a PIP, está envolvida no processo de proteólise, na regulação do processo imune e na percepção sensorial do sabor apimentado através da detecção de estímulos químicos (64). Esta proteína foi identificada anteriormente em diversos estudos nos quais o PPS salivar foi abordado (65– 67).
A PIP foi encontrada em níveis de baixa intensidade em pacientes portadores de Síndrome de Sjögren (SS) (68,69). Gallo et al. (2012) (70) a fim de identificar possíveis biomarcadores para SS, estudou a STNE e biópsia de glândulas salivares menores de 123 pacientes portadores de SS. Para tanto, utilizou diferentes técnicas de análises proteômicas como a SELDI-TOF-MS, 2DE, MALDI-TOF-MS. Nas biópsias de glândulas salivares menores, foram realizados testes PCR e imunohistoquimica especifico para a PIP. Os autores mostraram haver um decréscimo real desta proteína nas glândulas salivares
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menores de pacientes com SS. Segundo eles, este achado estaria relacionado ao dano acinar e inflamação crônica presente nas glândulas salivares na SS.
No TCTH alogênico, alterações em glândulas salivares semelhantes às encontradas na SS foram descritas, principalmente em pacientes com a DECH crônica.
Entretanto, a presença de um infiltrado inflamatório em glândulas salivares maiores na fase precoce do TCTH foi demonstrado por Coracin et al (2006) (2). Os autores demonstraram por meio do uso de cintilografia com Pertecnetato de Sódio TC 99m e Gálio-67 a permanência do processo inflamatório naquelas glândulas salivares desde o dia +30 ate o dia +100 pós-TCTH. Esses achados confirmaram a possível ação citotóxica dos regimes de condicionamento prévio ao TCTH em glândulas salivares maiores.
Assim o decréscimo de PIP na coleta B, comparada à coleta A, sugere que este possa estar relacionado ao processo inflamatório glandular associado à toxicidade do regime de condicionamento do TCTH.
Quando comparado a intensidade da PIP com os critérios clínicos de hiposalivação, esta somente apresentou correlação com o critério “aderência de espátula de madeira na mucosa jugal”. Os pacientes que apresentaram esse critério, a PIP estava diminuída em ambas as coletas. Entretanto, na coleta A, essa diferença foi maior. Esse resultado sugere que a diminuição da PIP pode estar relacionada à diferença na lubrificação oral. Segundo Dinnella et al (2009)(71) a redução gradual do nível de proteínas ricas em prolinas, a qual inclui a PIP implica na ruptura da película lubrificante da mucosa, aumentando a sensação de adstringência, sem entretanto, alterar do fluxo salivar. Apesar da alteração da PIP não ter sido correlacionada com o critério “viscosidade salivar”, foi hipotetizado que a ruptura da película de lubrificação da mucosa possa interferir no aumento da aderência de espátula de madeira na mesma.
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A proteína Alpha amylase 1 (AMY1A), apresentou diminuição de sua intensidade entre as coletas A e B. Segundo GO®, esta é uma proteína ligadora de íons cálcio; ligada ao processo metabólico de carboidratos; ligadora de diversos metais e altamente estudada no campo psicologia. A AMY1A é uma proteína com potencial biomarcador de estresse psicológico. Nater et al (2005) (72) descreveram a presença do aumento da AMY1A salivar em diversos níveis alteração de humor. Essa proteína é também descrita como um importante componente da saliva humana. A AMY1A está envolvida na digestão inicial do amido e pode estar relacionada na colonização de bactérias responsáveis pela formação do biofilme dental (63,73).
Em um estudo do nosso grupo, onde os componentes inorgânicos da saliva foram avaliados nesse mesmo grupo de pacientes, não foi observado alteração no nível de íons cálcio na fase aguda do TCTH (Boer et al., 2015) (3). Portanto, o decréscimo da intensidade da AMY1A encontrada neste estudo não deve estar relacionado com as trocas iônicas encontrados em glândulas salivares no período precoce do TCTH. Outra hipótese a ser discutida é a influência da ingesta alimentar na presença da MO grave. Neste caso os pacientes deixam de receber alimentação sólida via oral, o que diminui a oferta de carboidratos e, consequentemente, poderia ocorrer a diminuição da presença da AMY1A na saliva.
Apesar das alterações da AMY1A não apresentarem correlação direta com a variação dos índices de saúde bucal e a gravidade da MO, vale discutir a possível influencia desses fatores na diminuição da sua presença na coleta B. Pacientes durante o TCTH são orientados a realizar higiene oral associando o bochecho com digluconato de clorexedine 0,12%. O digluconato de clorexedine tem potencial antimicrobiano e bacteriostático (74). Portanto, a diminuição do biofilme oral promovido pelo uso da clorexedine pode ter influenciado na diminuição da AMY1A salivar. Os índices de saúde bucal apresentaram-se levemente alterados quando comparados os períodos de avaliação. Portanto, a higiene oral, o uso de bochecho com digluconato de
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clorexedine e a possível modificação da dieta decorrente da presença da mucosite oral podem ter influenciado na diminuição da presença da AMY1A na coleta B.
A família de proteínas Cystatin está relacionada com as funções de regulação e de proteção contra a proteólise em diversos processos fisiopatológicos, tais como na invasão de tecidos normais por tumores ou microrganismos, nas infecções virais e inflamações (65). Na cavidade oral, a família Cystatin foi encontrada no fluido crevicular de pacientes com doença periodontal (75). A Cystatin está fortemente associada a alterações gustativas, principalmente com o gosto amargo (64). Recentemente Cystatin
SN (CST1) foi identificada como biomarcador de câncer de pâncreas (76).
A proteína CST1 foi encontrada na saliva com ação inibitória à catepsinas B, H e L lisossômicas humanas enquanto que a Cystatin-AS foi relacionada com a inibição da catepsina G lisossômica humana (77). Estas proteases estão envolvidas na destruição do tecido periodontal (78). Além de sua função na destruição do tecido periodontal esta proteína participa do processo de mineralização dos dentes e na formação da película adquirida (79). Os dois subtipos, Cystatinas SA e SN foram encontradas na determinação do perfil proteico inicialmente identificado no estudo de FEIO et al (2013)(62) para pacientes com DECH crônica oral. Da mesma forma, DEVIC et al (2014) (5), em um estudo comparando o PPS de pacientes como e sem DECH crônica oral, encontraram um decréscimo de Cystatin B (CSTB) em pacientes que apresentaram DECH crônica em relação àquele que não apresentaram(5). Da mesma forma em nosso estudo, a proteína CST1, que pertence à mesma família da proteína CSTB encontrada por DEVIC et al (2014), apresentou um decréscimo de sua intensidade na coleta B comparada à coleta A. Esse resultado sugere que a diminuição da intensidade da família das Cysteina nos dois estudos aqui apresentados, possa estar relacionado ao dano glandular inflamatório causado pela DECH crônica e pelo regime de condicionamento pré-TCTH. Esses resultados sugerem que as proteínas da família das Cysteina aqui estudadas podem ser
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canditadas em potencial a biomarcadores das alterações inflamatórias orais precoces do TCTH e da DECH crônica oral.
A proteína Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B (SMR3B) é uma proteína secretada da glândula submaxilar e possui função pouco conhecida. A SMR3B pertence a uma família de genes (SMR3A, SMR3B e PROL1) capazes de produzir homólogos de opiorfina (80), a qual atua como analgésico e antidepressivo natural encontrado na saliva (81). Segundo Guo et al. (2006)(82) a SMR3B pode estar relacionada com a promoção da angiogênese o que estabiliza a micro vascularização. Baik et
al., (2013) (63) relacionou a SMR3R com adesão e formação de placa
bacteriana. Em nosso estudo, a diminuição da intensidade da SMR3R não apresentou correlação com o aumento do IP e do IG entre as duas coletas. Esse achado pode estar, novamente, relacionado ao uso do digluconato de clorexedine 0,12% como método auxiliar na higiene oral.
O envolvimento da toxicidade do regime de condicionamento na glândula submandibular foi demonstrado por Coracin et al (2006) (2). Naquele trabalho, os autores mostraram um aumento do processo inflamatório persistente até o do dia D+100 pós- TCTH nas glândulas salivares maiores. Entretanto, naquele estudo, o processo inflamatório encontrado na glândula submandibular foi maior e mais persistente quando comparado com as outras glândulas. Portanto, a diminuição da intensidade da SMR3B apresentada neste estudo vem de encontro aos achados descritos por Coracin et al (2006)(2) quanto aos danos causados na glândula
submandibular pelo regime de condicionamento pré-TCTH.
A vitamin D-binding protein isoform 1 precursor (VDBP) de acordo com o GO® é uma proteína multifuncional encontrada no plasma, no fluido ascítico (peritoneal), no fluido cerebrospinal, na urina e na superfície celulares. No plasma, esta proteína transporta os esteróis de vitamina D e impede a polimerização de actina ligando seus monômeros (83). A vitamina D possui importantes funções endócrinas, tais como absorção e homeostase de cálcio, participa da remodelação óssea e é mediadora do cálcio e do
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fosfato na modulação celular e imune (83). Estudos demonstraram a diminuição da da vitamina D na presença qualquer dano e/ou disfunção hematológica (83–85). No TCTH a diminuição da presença da vitamina D nos pacientes foi relatada (83–85). A vitamina D é um hormônio esteróide que apresenta uma grande variação de efeitos biológicos, desde do papel de mediador do equilíbrio do cálcio e fosfato, até na diferenciação celular e na modulação imune. A vitamina D possui capacidade imunomodulatória afetam o ambiente imune de pacientes submetidos ao TCTH (83–85).
Neste estudo a intensidade da VDBP foi maior na coleta B comparada à coleta A. O aumento da intensidade da VDBP pode estar relacionado à diminuição da vitamina D livre disponível quer pela doença hematológica ou pelos efeitos secundários do TCHT (84,85) o que deixaria seu carreador, no caso a VDBP, livre na saliva.
A proteína cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6
(B4DUH8_HUMAN) apresentou um decréscimo de 26,7% entre a coleta A e
B. Esta proteína é classificada como carreadora de zinco (Uniprot ®). A presença desta proteína na saliva foi associada ao aumento da suscetibilidade a cáries e ao aumento do biofilme oral (86–88). Sua ausência é considerada como um possível biomarcador precoce para SS (89,90). O decréscimo da cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6 encontrado neste estudo sugere presença de alterações glandulares inflamatórias, similares às encontradas na SS, desenvolvidas aqui, pela toxicidade do regime de condicionamento prévio ao TCTH. Outros estudos envolvendo a presença precoce da B4DUH8_HUMAN na saliva e a DECH crônica oral devem ser realizados, pois a mesma pode ser um potencial marcador biológico para a DECH crônica.
A deficiência de zinco está relacionada à presença de lesões aftosas recorrentes e a outras ulcerações orais (91). O uso do zinco na forma de bochecho tem sido utilizado no manejo da MO (92). A diminuição da B4DUH8_HUMAN na coleta B do nosso estudo, pode estar relacionada ao
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aumento da gravidade de MO, apesar de não ter apresentado uma correlação estatisticamente significativa.
A proteína Statherin (STATH) é capaz de estabilizar saliva supersaturada com sais de cálcio devida a inibição da precipitação de sais de fosfato de cálcio (39). Esta proteína modula a formação de cristais de hidroxiapatita na superfície do esmalte do dente (93). Wang et al (2015) (93) citam a STATH como um biomarcador para cáries dentárias. A STATH é excretada principalmente pelas glândulas salivares maiores (Jensen et al., 1991). Contucci et al (2005) (94), demonstraram uma redução significativa nos níveis de STATH na saliva de pacientes com lesões pré-cancerosas e cancerosas da cavidade oral. No entanto, quando relacionadas às patologias glandulares malignas ou não, a STATH não apresentou alterações.
Neste estudo, a STATH foi encontrada em menor intensidade na coleta B, quando comparada a coleta A. Este decréscimo sugere influencia da toxicidade do condicionamento em glândulas salivares maiores, como demonstrado por Coracin et al (2006) (2), na excreção da STATH.
No entanto, quando avaliada a correlação entre a STATH e a MO, foi observada uma maior intensidade da STATH em pacientes com MO grau III-IV, quando comparado àqueles pacientes com MO grau 0-II. Nos pacientes com MO grave, o aumento da Statherin pode estar relacionada com a diminuição do nível de cálcio livre na saliva. Como o cálcio tem papel importante na regulação epitelial, uma baixa concentração desse íon pode causar uma alteração da ligação desmossomica epitelial. Nesse contexto, a associação entre o aumento da intensidade da STATH e a diminuição do cálcio em mucosa podem desempenhar papel importante na intensificação da gravidade da MO. Entretanto, este resultado vem em oposição aos achados em umestudo feito pelo nosso grupo, onde não foram comprovadas alterações significativas da presença de íons de cálcio na saliva nesse grupo de pacientes (3).
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Quando avaliados os critérios de hiposalivaçao, a STATH apresentou correlação com o critério clínico:“ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida”. A intensidade da STATH estava diminuída naqueles pacientes com ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida. Esse achado vem de encontro aos de Coracin et al (2005)(2) que demonstrou a presença de processo inflamatórios em glândulas salivares maiores na fase precoce do TCTH, como consequência da toxicidade relativa ao regime de condicionamento.
A Immunoglobulin J chain (IGJ), de acordo com o banco de dados UniProt® tem como função ligar duas unidades de monômero de tipo IgM, regulador positivo do sistema complemento, e IgA, encontrada em mucosas. Segundo o GO®, esta proteína está associada à ligação das imunoglobulinas ao antígeno na resposta imune, na atividade homodimerização proteica, na resposta imune adaptativa, na resposta humoral antibacteriana, entre outras. No presente estudo a IGJ esteve inversamente relacionada com o maior grau de MO encontrado até a enxertia da medula óssea e também com aquela encontrada no dia da coleta B. A IGJ é considerada como biomarcadora de processos inflamatórios agudos, por ativar o sistema complemento. O decréscimo da presença da IGJ em nosso trabalho na coleta B pode ser justificado pela desrupçao epitelial provocada pela mucosite oral, o que pode levar à diminuição da expressão de IgA livre em saliva ou mesmo pela diminuição fisiológica promovida pela doença hematológica (95).
Pouco é encontrado sobre a proteína Pulative uncharacterized
protein DKFZp686N02209. De acordo com UniProt® esta proteína está
relacionada com a regulação das imunoglobulinas. Apesar do envolvimento das imunoglobulinas nas doenças neoplásicas hematológicas, a DKFZp686N02209 não mostrou diferença significativa entre as duas coletas. Entretanto, quando avaliada com a MO, esta mostrou uma correlação inversa com a mesma. Esse achado pode ser considerado pelo dano tecidual encontrado na MO que pode, diminuir a IgM livre em saliva.
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Apesar das limitações deste estudo, como o número de pacientes envolvidos, foi possível demonstrar a variação do PPS na fase aguda do TCHT. Da mesma forma, foi possível selecionar possíveis candidatos a biomarcadores salivares de fase aguda, relacionados com as manifestações de mucosite oral.
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7 CONCLUSÃO
Foram identificadas 39 proteínas no PPS de pacientes submetidos ao TCTH alogenico. Dentre essas, 7 proteínas apresentaram intensidades alteradas entre esses dois períodos: a Prolactin-inducible
protein, a Alpha-Amylase 1, a Cystatin-SN, Submaxillary gland androgen- regulated protein 3B, a Sthaterin , a vitamin D-binding protein isoform 1 precursor e a cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase.
Essas alterações de intensidade sugerem que o regime de condicionamento pré-TCTH pode influenciar na secreção proteica salivar
Entre as 7 proteínas, duas delas, a Prolactin-inducible protein e a
Sthaterin mostraram correlação com o critério clínico de hiposalivação:
“aderência de espátula de madeira na mucosa jugal” e “ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida” relativamente.
Três proteínas demonstraram-se alteradas na presença da mucosite oral grave: Immunoglobulin J chain, Pulative uncharacterized protein
DKFZp686N02209 e Statherin. Essas proteínas podem formar um painel de
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