Dinâmica do perfil proteico salivar induzida pelo condicionamento pré transplante de células tronco hematopoéticas alogênico

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Raiza Meira Vieira

DINÂMICA DO PERFIL PROTEICO SALIVAR INDUZIDA PELO CONDICIONAMENTO PRÉ TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO

HEMATOPOÉTICAS ALOGÊNICO.

PIRACICABA 2015

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Universidade Estadual De Campinas

Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Raiza Meira Vieira

DINÂMICA DO PERFIL PROTEICO SALIVAR INDUZIDA PELO CONDICIONAMENTO PRÉ TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO

HEMATOPOÉTICAS ALOGÊNICO.

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Estomatopatologia, na Área de Estomatologia.

Orientadora: Profª Drª Maria Elvira Pizzigatti Corrêa Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendido pelo aluno, e orientada pela Profª. Drª. Maria Elvira Pizzigatti Corrêa.

_____________________________________ Assinatura do orientador

PIRACICABA 2015

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vii RESUMO

Complicações orais estão presentes em cerca de 80% dos pacientes durante o Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH), sendo a mucosite oral (MO) e as alterações salivares umas da que possuem maior impacto para a qualidade de vida do paciente. A utilização do perfil proteico salivar (PPS) na abordagem diagnóstica em diversas doenças tem sido frequente. A identificação de um PPS que auxilie o entendimento das manifestações agudas orais do TCTH poderia sobremaneira, influenciar nas decisões terapêuticas visando melhora no manejo do paciente. O objetivo deste trabalho foi identificar alterações do PPS do início do regime do condicionamento pré TCTH até a recuperação medula e correlacioná- las com dados clínicos orais. Para tanto, foi utilizado o banco de dados de proteomica salivar do grupo de Odontologia do Hemocentro, encontrada por Feio et AL (2013). Nesta avaliação foram incluídos 16 pacientes submetidos ao primeiro TCTH alogênico na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital de Clínicas da UNICAMP. As amostras de saliva total não estimulada (STNE) foram coletadas em dois momentos: previamente ao condicionamento (coleta A) e a segunda (coleta B), entre os dias D+8 e D+10 pós-TCTH. Dados sobre saúde oral, grau de MO foram coletados, além da avaliação de hiposalivação. O estudo do PPS foi realizado por espectometria de massas no LNBio. Os PPS das duas coletas, A e B foram tabelados no programa Excel® 2007 (Microsoft, WA, EUA), juntamente com os dados clínicos. O teste T pareado foi utilizado para a comparação entre os PPSs com os tempos das coletas. Os critérios clínicos de hiposalivação foram comparados com as divergências proteicas durante as duas coletas por ANOVA. A comparação entre os dados clínicos de cada coleta e seu respectivo PPS, foi feito pelo teste T pareado, sendo considerado significativo p<0,005. Sete proteínas apresentaram intensidades divergentes entre as coletas A e B: Prolactin-inducible protein,

Alpha-Amylase 1, Cystatin-SN, Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B,

Sthaterin, cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6

apresentaram-se em decréscimo na coleta B comparada a coleta A e a vitamin

D-binding protein isoform 1 precursor se apresentou aumentada na coleta B

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proteinas, Immunoglobulin J chain, Pulative uncharacterized protein DKFZp686N02209 que se demonstraram com intensidade diminuída naqueles

pacientes que apresentaram graus III e IV em comparação àqueles com grau 0–II de MO; a proteína Statherin esteve presente em maior intensidade naqueles pacientes que apresentaram MO com grau III e IV. Esses resultados podem estar relacionados principalmente à toxicidade do regime de condicionamento mieloablativo nas glândulas salivares e sugerem que as proteinas Statherin, Immunoglobulin J chain e Pulative uncharacterized protein

DKFZp686N02209 podem ser candidatas a um painel de PPS para a MO no

TCTH.

Palavras chave: Proteínas e Peptídios Salivares; Mucosite oral; Transplante de Células Tronco Hematopoéticas; Proteômica.

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ix ABSTRACT

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a potentially curative therapy for various hematological diseases. Oral Complications are present in about 80% of patients who undergo to HSCT. Oral mucositis (OM), oral infections and salivary changes, among others are the most common oral clinical founds in the acute phase of the HSCT. The use of salivary profile as a tool for diagnosis and management of treatment responses has been shown a promising future in different clinical settings. Thus the discovery of a salivary protein profile (SPP) of patients submitted to the allogeneic HSCT during the acute phase of the transplantation may be helpful on the management of the oral effects of the HSCT. The aim of this research was to identify the SPP changes during the acute phase of allogeneic HSCT and correlate them with the oral clinical manifestation of the acute phase of HSCT. This study enrrolled 16 patients with hematological diseases who, underwent to their first allogenic HSCT at the Bone Marrow Transplantation Unit – UNICAMP. Unstimulated salivary samples were collected in two periods: first (collection A), it was performed prior the initiation of the conditioning regimen for the HSCT and collection B; performed between day D+8-10 days after HSCT. Oral health indices were obtained in both moments of the saliva collection. The severity of oral mucositis was collected on the collection B. The PPS analysis was performed by mass spectrometry on a previous study performed by Feio et al (2013). Student T test paired was used in order to between the 39 identified proteins equally between the collections A and B. Clinical correlations were also compared to the different PPS using one-way ANOVA analysis. For both comparisons, considered significant p < 0.05. Among the collections A and B, 7 proteins were presented with differing intensities: Prolactin-inducible protein, Alpha-Amylase 1, Cystatin SN, Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B, Sthaterin, cDNA FLJ60163 Similar to highly Carbonic anhydrase 6 showed a decrease intensity in the collection B and the vitamin D-binding protein isoform 1 precursor quantity showed a increased in the collection B. Three proteins were shown altered intensity when correlated with the severity of OM: Immunoglobulin J chain, Pulative uncharacterized protein DKFZp686N02209v. These proteins

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showed a decreased of intensity in those patients grade III-IV OM when compared to patients with grade 0-II OM. The protein Statherin showed in increased intensity in patients with OM grade III-IV. These results indicate the influence of the toxicity of the conditioning regimens on the salivary protein profiles in the acute phase of the HSCT. The proteins: Immunoglobulin J chain, Pulative uncharacterized protein DKFZp686N02209v and Statherin might be a potential candidates for a panel of salivary biomarkers for OM.

Key words: Salivary Proteins and Peptides; Stomatits; Hematopoietic Stem Cell Transplant; Proteomic.

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xi SUMÁRIO

Dedicatória ... xiii

Agradecimentos ... xv

Lista de abreviaturas ... xvii

1 Introdução ... 1 2 Revisão de literatura... 5 3 Proposição ... 17 4 Material e Métodos ... 19 5 Resultados ... 25 6 Discussão ... 43 7 Conclusão ... 53 Referências ... 55 Anexos ... 65

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xiii DEDICATÓRIA

Aos pacientes do Hemocentro que renovaram minha vontade de viver em cada dia trabalhado.

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xv AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, representada pelo seu diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.

Ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

Ao Hemocentro, representada Prof Dra Sara Teresinha Olalla Saad.

À Prof. Dra. Maria Elvira, que, além de orientadora se tornou minha amiga e companheira de todos os dias.

À minha mãe, Célia, que nessa jornada, se mostrou além de mãe, minha melhor amiga.

À minha avó Cida, que sempre carinhosa, me ajudou.

Ao meu pai Israel e Rosangela, pelos conselhos e carinho.

As minhas irmãs, Mariana e Samyra, que do jeito delas, estiveram ao meu lado.

À minha tia Sandra, por me apoiar e me ajudar, sempre que necessário.

Aos Drª Carine Lervolino, Drª Andrea Silva, Dr Marcos Alborguetti e Drª Camila Boer por me ajudarem em minha pesquisa, sempre que precisei.

À Drª Eliana e a Drª Neiva, por serem minhas guias.

Ao Vinícius, por ser meu companheiro desde o primeiro dia de pós graduação, me ajudar, me ouvir, aconselhar e me alegrar no meu dia a dia.

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Aos Amigos Carolina Carneiro, Maurício Dourado, foram meus companheiros em todos os momentos e me acolheram em Piracicaba.

Aos Colegas da pós graduação, José Laurentino, Nathália Lima, Elisabeth, Wagner, Débora, Renata, César, María Jesus, Valéria, Diego, por me aconselharem e me ajudarem no que fosse preciso.

Aos meus amigos, Nathani Zanovello, Isabel Massucci, Marília Martins, Nataly Medeiros, Gabriela Bravo, Joyce Menon, Mayra Mello, Laís Branco, Adriano Godinho, Fábio Costa, Breno Tamura, Rafael Longo, Danilo Salvego, Paulo Nied, Maurício Fávaro, Juliana Cunha, Tamiris, Michele de Sá, Débora Faria, Wanderson Faria, Heraldo Pietrobom, Regiane Pietrobom, Fernando Haas, Sergio Biscaldi e Leonardo Minelli por estarem ao meu lado.

À Equipe do Hemocentro, médicos, enfermagem, administração por me ensinarem tantas coisas.

À Equipe da Biblioteca Central César Lattes, por estarem presentes em mais um momento da minha jornada.

À Equipe da FOP – Laboratório pelo apoio técnico.

Ao Nivaldo Nardini e Reginaldo Camargo, por me darem oportunidades de ser mais do que eu imaginava.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Npivel Superior- CAPES pela concessão de bolsa de estudos.

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xvii LISTA DE ABREVIATURAS

AA: Anemia aplásica

AMY1A: Alpha amylase 1

AP-1: Activation protein

B4DUH8_HUMAN: cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6

COX-2: Cicloxigenase-2

CST1: Cystatin SN

CSTB: Cistatina B

CT: Células Tronco

DECH: Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

EGF: Epidermal growth factor

EM: Espectrometria de Massa

GO®: Gene Ontology ®

HSCT: hematopoietic stem cell transplantation

ICT: Irradiação Corpórea Total

IFN : Interferon

Ig: Imunoglobulina

IGJ: Immunoglobulin J chain

IL: Interleucina

ILD: infusão de leucócitos do doador

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xviii LLA: Leucemia linfoide aguda

LLC: Leucemia Linfoide crônica

LMA: Leucemia mieloide aguda

LMC: Leucemia mieloide crônica

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MEC: Matriz Extracelular

MMPs: Metaloproteinases

MO: Mucosite oral

OM: Oral mucositis

OMS: Organização Mundial de Saúde

PCR: Reação em cadeia da polimerase

PIP: Prolactin-Inducible Protein

PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonil

PPP: Perfil proteico plasmático

PPR: proteínas ricas em prolina

PPS: Perfil proteico salivar

ROS: Reactive Oxygen Species

SLIP: Secretory leukocyte protease inhibitor

SMR3B: Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B

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xix SS: Síndrome de Sjögren

STATH: Statherin

STNE: Saliva Total Não Estimulada

TCTH: Transplante de Células Tronco

Hematopoéticas TGF: Transforming growth factor

TNF: Fator de necrose tumoral

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1 INTRODUÇÃO

O Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH) é um procedimento com alto poder curativo para diversas doenças hematológicas malignas ou não. No entanto, apesar dos avanços relacionados a esse procedimento, o mesmo não está livre de complicações que podem estar relacionadas não somente ao curso da doença, mas também à toxicidade medicamentosa incluída nesse processo.

A boca é o órgão que pode tanto representar as manifestações clínicas da doença de base, como também das toxicidades dos regimes de tratamento empregados no controle das neoplasias. No TCTH, o envolvimento da boca se dá nas diversos momentos e pode ser dividido em 2 fases.

A primeira fase, denominada aguda, se caracteriza por manifestações orais que ocorrem desde o início do regime de condicionamento pré- transplante e se estende até a enxertia da medula óssea. Nesta fase a prevalência de alterações orais é estimada em 80% (6), sendo mucosite oral (MO) a complicação mais frequente, associada ou não a infecções locais ou sistêmicas (7). A MO é considerada uma das complicações do TCTH de maior impacto na qualidade de vida do paciente (7). Está relacionada com dor intensa, dificuldade de deglutição e fala e aumento do risco de desenvolvimento de infecções sistêmicas por microorganismos orais, por via hematogênica. A segunda fase do TCTH, definida neste trabalho como a fase tardia, tem como a complicação mais frequente a Doença do Enxerto contra o Hospedeiro (DECH) e, mais tardiamente, tumores orais, secundários ao TCTH.

A MO é definida como um processo inflamatório que envolve a mucosa oral e seus tecidos subjacentes, resultante da toxicidade da terapia antineoplásica. Clinicamente é caracterizada por apresentar diferentes níveis de inflamação tecidual que, nos casos mais graves, podem ulcerar e envolver a submucosa (10,11).

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fluidos biológicos. Ela apresenta diversas funções fisiológicas, desde a lubrificação dos tecidos bucais, limpeza e participação no processo de remineralização dos dentes, e ainda outros (36). Também possui importante papel na manutenção da homeostasia da cavidade bucal. Atualmente, vem sendo estudada como fonte de possíveis biomarcadores no diagnóstico e monitoramento de doenças sistêmicas, bucais, tais como: doenças autoimunes, infecções bacterianas, doenças cardiovasculares, entre outras (36).

Como matéria de estudo, a saliva apresenta vantagens pela facilidade de sua coleta não ser invasiva, indolor e de baixo custo quando comparada ao plasma sanguíneo ou mesmo a outros fluidos humanos. Além disso, as amostras salivares são de fácil preparo, pois exigem apenas centrifugação e adição de inibidores de proteases a fim de minimizar a degradação das proteínas e posterior congelamento (48).

O envolvimento salivar no TCTH foi demonstrado na literatura. O envolvimento das glândulas salivares pela DECH crônica foi estudado por vários autores, inclusive do nosso próprio grupo. Alborghetti et al (2005) (1) demonstraram a presença de alterações de parênquima glandular e perda acinar de amostras de glândulas salivares de pacientes em acompanhamento por DECH crônica oral. Coracin et al (2006) (2) demonstraram a presença de um infiltrado inflamatório na fase aguda do TCTH que persistiu até o dia D+100 em pacientes submetidos ao TCTH, mas que nunca tinham recebido tratamento quimioterápico prévio. Boer et al (2015) (3) estudou as alterações inorgânicas salivares em um grupo de pacientes submetidos ao TCTH. Todos os autores relacionam de alguma forma seus achados com as possíveis alterações das toxicidades glandulares induzidas pelos regimes de condicionamento pré-TCTH.

São poucos os estudos que avaliam o perfil proteômico salivar no TCTH. Imanguli et al (2007) (4) e DEVIC et al (2014) (5) mostraram alterações do PPS principalmente na DECH crônica. Entretanto, esses

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autores não correlacionaram a variação da PPS na fase aguda do TCTH com os aspectos clínicos orais encontrados nessa fase.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A cavidade oral e o TCTH

O manejo da saúde oral em pacientes portadores de doenças hematológicas traz consigo diferentes desafios, não só para o cirurgião dentista mas também para toda equipe multidisciplinar.

A boca pode refletir tanto os sinais clínicos da doença neoplásica, como as infiltrações leucêmicas quanto às manifestações clínicas das terapêuticas propostas às doenças.

No cenário do Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH), a boca representa um dos órgãos de alta prevalência das complicações dessa modalidade terapêutica.

O envolvimento bucal no TCTH pode ser dividido em duas grandes fases: a primeira fase (aguda), onde a prevalência global de complicações orais é estimada em cerca 80% dos pacientes submetidos ao TCTH alogênico, sendo a presença de mucosite oral (MO) (6) a principal responsável por esse alto percentual, principalmente quando associada à infecções orais. Na segunda fase (crônica), o maior percentual (80%) das complicações orais é relacionado à DECH crônica oral e as complicações a ela associadas, como segundos tumores primários orais (7–10).

O foco do estudo aqui apresentado será a fase aguda pós-TCTH e suas manifestações clínicas orais.

2.2 Mucosite Oral (MO)

A mucosite oral (MO) é definida como um processo inflamatório que envolve a mucosa oral e seus anexos, como resultado da toxicidade direta da terapia antineoplásica quer seja resultante do tratamento quimioterápico associado ou não à radioterapia na região de cabeça e pescoço. A MO é uma complicação grave do TCTH, que pode ocorrer em todos os pacientes submetidos ao TCTH e ao regime de condicionamento mieloablativo, variando seu comprometimento e gravidade. Clinicamente é caracterizada por

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apresentar diferentes níveis de inflamação. A MO pode se agravar, chegando a apresentar extensas ulcerações envolvendo a submucosa (11).

São várias as escalas utilizadas que visam a graduação da intensidade da MO. Entretanto, a recomendada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 1979 é a mais frequentemente utilizada, principalmente pela facilidade do uso que ela oferece à equipe multidisciplinar do TCTH (TABELA 1) (12).

Tabela 1: Escala de graduação da mucosite oral (fonte: WHO, 1979) Gravidade de Mucosite Oral Características Clínicas

0 Ausência de sintomatologia

1 Inflamação da mucosa oral e sensibilidade, sem úlceras.

2 Inflamação da mucosa oral e presença de úlceras, mas o

paciente é capaz de comer normalmente.

3 Paciente não é capaz de ingerir dieta sólida, somente dieta

líquida.

4 Paciente é incapaz de comer e beber. Tabela adaptada de “Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment” WHO(12).

Apesar do manejo do paciente com MO ser baseado na sintomatologia clínica, na prevenção e tratamento de co-infecções, o entendimento da fisiolopatologia da mesma é de fundamental importância para o planejamento dessas medidas (11).

Estudos demonstraram que tanto a quimioterapia quanto a radioterapia na região de cabeça e pescoço são capazes de desencadear liberação de radicais livres, de agentes oxidantes e de ativar fatores de transcrição capazes de desencadear agressão tecidual através da ativação de cascatas inflamatórias e de apoptose, o que poderá resultar na ruptura da barreira mucosa oral (13).

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7

Além das drogas e da radioterapia, fatores genéticos podem estar envolvidos no aumento do risco e da gravidade da MO. Os determinantes genéticos incluem genes reguladores da disponibilidade de metabólitos ativos dos quimioterápicos. Como exemplo, a avaliação do polimorfismo gênico da metabolização do ácido fólico que pode ajudar a identificar pacientes com maior risco de toxicidade ao metotrexato (14). Em contraste, as diferenças na expressão dos genes associados com vias biológicas que conduzem a MO são mais comuns. Por exemplo, polimorfismos genéticos associados com a expressão de mediadores inflamatórios, tais como fator de necrose tumoral (TNF-α), foram implicados no risco MO em pacientes submetidos ao TCTH alogênico (15). Outro exemplo do envolvimento do polimorfismo gênico no risco da MO foi a identificação de um nucleotídeo polimórfico único

(“single-nucleotide polymorphisms”, SNP base de dados Bayesiana®, desenvolvido

a partir de DNA salivar, no qual pôde prever o risco de desenvolvimento de MO grave após condicionamento prévio ao TCTH autólogo (16).

Um estudo realizado por Ringden et al (2013) (17) , em que a toxicidade dos regimes de condicionamento mieloablativo e não mieloablativo foram comparadas em 37 pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA), submetidos ao TCTH. Os autores demonstraram que a MO grau IV, (OMS) foi mais presente naqueles pacientes submetidos ao regime de condicionamento mieloablativo. Nesse mesmo estudo, foi demonstrado que os pacientes submetidos ao regime de condicionamento não mieloabliativo apresentaram MO grau I (OMS). Esses dados confirmam a correlação entre os diferentes regimes de condicionamento com as manifestações de toxicidade oral (12).

2.2.1 Fisiopatologia da MO

Historicamente, a MO era considerada como um evento mediado pelo epitélio como resultado dos efeitos tóxicos não específicos da radiação e/ou da quimioterapia, e que se proliferam rapidamente em células epiteliais basais, resultando em morte de células clonais (18).

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Entretanto, Sonis et al (2004) (13), desenvolveu um modelo da fisiopatologia da MO, dividindo-a didaticamente em 5 fases. Este modelo descreve uma cascata de eventos genéticos e histopatológicos inter-relacionados e sobrepostos. Estas fases incluem a iniciação, a regulação positiva/ativação, a amplificação de sinal, a ulceração e cura envolvendo epitélio e tecido conjuntivo da mucosa.

A fase de iniciação é caracterizada por alteração do DNA epitelial induzida pela quimioterapia o que resulta n a lesão de células basais epiteliais, lesão de células submucosas e lesão de células endoteliais(19). Em resposta a este dano, espécies reativas de oxigênio (“Reactive Oxygen

Species” ROS) são geradas e amplificam os danos ao DNA e, assim, resultam

em morte de células clonais, o que leva à fase subsequente, de ativação de fatores de transcrição, como o fator nuclear (NF-kβ) (13,20).

O NF-kβ é considerado como o "gatekeeper" para várias vias inflamatórias envolvidas na MO (21). A ativação de NF-kβ ocorre em praticamente todas as células epiteliais e na submucosa. Esta induz à expressão de moléculas de adesão e ativação de MMP, que são ativadas por mitogénio quinase (“mitogen-activated protein kinase” MAPK) e via da cicloxigenase-2 (COX-2) (18,20,22). Além disso, a descoberta de que a ativação de NF-kβ pode ter efeitos pró-apoptóticos e anti-apoptóticos (através do regulador de apoptose gene Bcl-2) torna-o um fator significativo na determinação do destino de tecidos normais após a terapia citotóxica (22).

A super regulação de NF-kβ gera a formação de interleucina (IL) 1, IL-6, TNF-α (23). Estes mediadores pró-inflamatórios estimulam a lesão através de loops de feedback positivo (fase de amplificação de sinal), em que TNF-α age sobre as vias para reforçar a ativação de NF-kβ (24).

Juntamente com NF-kβ, vias independentes alternativas, tais como a via da ceramida são ativadas, o que resulta em apoptose de células epiteliais da submucosa e da camada basal (25).

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Além disso, as metaloproteinases (MMPs) são também envolvidas na fisiopatologia da mucosite (26). Além de um efeito direto da radiação ou da quimioterapia, o dano à submucosa é mediado pela ativação de proteína de ativação-1 (“Activation protein” AP-1). Esta ativação também estimula a secreção de MMP por fibroblastos (18,27).

O TNF é um importante regulador da atividade transcricional de AP-1, iniciando a via de sinalização MAPK devido ativação da c-Jun

amino-terminal quinase (26). Além disso, IL-1 e COX-2 podem induzir a ativação de

MMP (18). Com o aumento dos níveis de MMP-2, -3, -9, e -12, que estão associados com o infiltrado inflamatório, o dano tecidual se torna máximo. Em contraste, a expressão de MMP-1 correlaciona-se com a restauração tecidual (26).

A fase ulcerativa compreende a perda da integridade da mucosa e colonização microbiológica, com subsequente produção de citocina pró-inflamatória (11,18).

A cicatrização da mucosa está associada com a proliferação epitelial, e muitas vezes acontecem simultaneamente à recuperação hematopoética, ao restabelecimento da flora microbiana local e à ausência de fatores que interferem na cicatrização das úlceras, tais como infecção e irritação mecânica (28).

A Matriz Extracelular (MEC) desempenha um papel importante na sinalização entre os tecidos. Ela é constituída por uma rede estrutural complexa de proteínas fibrosas, proteoglicanos e glicoproteínas. Também estimula a migração celular epitelial, a proliferação e a diferenciação, que conduzem à renovação da mucosa (18).

O fator de crescimento epidérmico (“Epidermal growth factor” EGF), o fator de crescimento transformante- (“transforming growth factor” TGF-), IL-1 e o Interferon- (IFN-) são recrutados a fim de promover uma regulação positiva de TGF-, estimulando a expressão de fibronectina e colagénio tipo

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IV (29). Após a cura, embora a mucosa oral pareça hígida, o curso de angiogênese do tecido conjuntivo ainda está em maturação, o que aumenta o risco para futuras MO, caso haja alguma terapia adicional posterior (13).

Uma vez presentes, as ulcerações aumentam o risco de infecções sistêmicas, sejam elas bacterianas, fúngicas ou virais; qu e podem se dar por via bucal ou hematogênica (13,30,31). Entre outros, a bacteremia pode ser causada pela presença de estafilococos coagulase-negativos presentes na mucosa oral (32,33). As complicações infecciosas e inflamatórias associadas com a MO podem estar associadas ao aumento da morbidade e mortalidade precoce encontrada no TCTH (10,34,35),

2.3 Saliva

A saliva humana é um dos mais complexos, versáteis e importantes fluidos biológicos. É constituída por uma mistura de secreções das glândulas salivar maiores e menores, fluído crevicular gengival, secreções nasais e aquelas expectoradas pelos brônquios, células epiteliais descamadas, imunoglobulinas e restos alimentares, além de derivados séricos bacterianos, virais e fúngicos (36).

A saliva também apresenta várias funções fisiológicas, que envolvem desde a lubrificação dos tecidos bucais, limpeza, participação no processo de remineralização dos dentes, entre outros. Ela possui ainda importante papel na manutenção da homeostasia da cavidade bucal. É também considerada como um meio favorável a ser explorado na vigilância da saúde e doença (37,38).

A secreção desse fluido na cavidade bucal é dada partir de glândulas salivares, que consistem em células derivadas de epitélio altamente especializado, com dois segmentos morfológicos e funcionais bem definidos (acinar e ductal) (3).

A secreção salivar se dá por um processo de dois estágios; a secreção inicial de um fluído plasmático aquoso primário pelas células acinares

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e que é subsequentemente alterado durante a passagem através do sistema celular ductal. Esse evento é controlado pelo sistema nervoso autônomo através de sistemas de transdução de sinal, que estimulam os receptores iônicos acionando os mecanismos de transporte e secreção de proteínas. O volume de saliva produzida pode variar na dependência do tipo e da intensidade do estímulo nervoso, sendo que o maior volume ocorre com a estimulação colinérgica (39).

Vários estudos demonstraram a influência do TCTH na modificação salivar. Através de estudos com cintilografia, Coracin et al (2005) (2) demonstraram a presença de uma reação inflamatória persistente até o dia D+100 pós-TCTH em glândulas salivares maiores. Alborghetti et al (2005) (1) demonstrou alterações estruturais em glândulas salivares menores em pacientes submetidos ao TCTH alogênico. Recentemente, Boer et al. (2015) (3) demonstraram a presença de alterações iônicas salivares em pacientes submetidos ao TCTH. Torregrossa et al (2015) (40) mostraram em seus resultados as alterações agudas do fluxo salivar nesse mesmo grupo de pacientes. Esses autores salientaram que as alterações salivares encontradas poderiam estar associadas à toxicidade do regime de condicionamento utilizado no TCTH em glândulas salivares (41).

Recentemente, uma expressiva atenção foi conferida à utilização da saliva humana como possível fonte de biomarcadores no diagnóstico e monitoramento de doenças bucais, autoimunes, bacterianas, doenças cardiovasculares e endocrinometabólicas. São vários os estudos que comparam o valor da utilização da saliva com outros fluidos corporais (42– 44). Uma das principais vantagens do uso da saliva recai na facilidade de sua coleta não-invasiva, indolor e de baixo custo. Além disso, as amostras salivares são de fácil preparo, pois exigem apenas centrifugação e adição de inibidores de proteases para minimizar a degradação das proteínas e posterior congelamento (45–47).

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12 do plasma e da saliva para fins diagnósticos.

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Tabela 2: Comparação das características para diagnóstico entre plasma e saliva

Plasma Saliva

Bem aceito para diagnósticos clínicos Potencialmente atraente para diagnósticos clínicos

Associados a diversos marcadores de processos patológicos

Na maioria dos casos, biomarcadores ainda não estão totalmente validados para o diagnóstico e monitoramento de patologias

Fluido circulante, potencialmente capaz de coletar os subprodutos de processos patológicos;

Diferentes moléculas chegam à saliva através de vias intra e extracelulares, fornecendo informações sobre a atividade de vários órgãos do corpo

Coleta invasiva e estressante Coleta não invasiva e com baixos níveis de ansiedade e estresse.

Alto risco de periculosidade de pesquisadores devido manuseio de amostras

Baixo risco de periculosidade de pesquisadores devido manuseio de amostras

Método de coleta padrão Método de coleta aina não padronizado

Baixa variação na concentração de moléculas

Variação da concentração de moléculas pode ser afetada pelo ritmo cardíaco, diversos estímulos, idade, entre outras.

Alta concentração de moléculas biológicas Baixa concentração de moléculas biológicas Alta concentração e maior quantidade de

substâncias do complexo inibitório

Baixa concentração e menos quantidade de substâncias do complexo inibitório.

23% de proteínas encontradas no plasma estão presente na saliva.

27% das proteínas encontradas na saliva estão presentes no plasma.

77% das proteínas presentes no plasma estão ausentes na saliva (São exclusivas do plasma)

73% das proteínas presentes na saliva estão ausentes no plasma (exclusivas da saliva) 60% das proteínas consideradas potenciais

biomarcadores de doenças graves, são exclusivas do plasma.

40% das proteínas plasmáticas consideradas candidatas a biomarcadores são encontradas na saliva.

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14 22 das proteínas mais abundantes no sangue representa 99% de sua quantidade , menor que a saliva

20 das proteínas mais abundantes na saliva, representam 40% da maioria das proteínas abundantes em toda a saliva (ou seja, uma maior diversidade que o plasma)

Algumas proteínas que são encontradas em abundância na saliva também são encontradas no plasma

Algumas das proteínas mais abundantes no plasma também são encontradas na saliva em elevadas concentrações

Tabela adaptada de: “Saliva: a fluid of study for OMICS.” (48)

Ao contrário do sangue, a saliva contém menor quantidade de inibidores de proteases e menor quantidade de substâncias complexas, o que constitui outra importante vantagem sobre o plasma (48,49). Ela é capaz de fornecer dados e informações clinicamente relevantes a nível celular e biológico devido à quantidade de compostos nos quais podem ser usados para avaliar e monitorar o processo saúde-doença (49,50).

Loo et al. (2010) relataram que 27% das proteínas encontradas na saliva também estão presentes no plasma, sugerindo que a saliva poderia ser utilizada como uma alternativa ao sangue para testes de diagnóstico. As proteínas remanescentes (73%), presentes na saliva, mas ausente no plasma, apresentam uma oportunidade para identificar novos marcadores moleculares.

Ambos os fluídos mostraram grande diversidade em termos de tipo de proteína e suas respectivas concentrações. No sangue, 99% do total de proteínas é representado por 22 proteínas; enquanto que, na saliva, 40% do total é representado por 20 proteínas. Algumas proteínas plasmáticas também são encontradas na saliva em moderada ou elevadas concentração. Em contraste, apenas algumas proteínas salivares são encontradas no plasma em concentrações semelhantes (51). Estes dados revelam uma oportunidade significativa para o estudo de potenciais biomarcadores salivares usando o perfil proteômico (48).

(35)

15

semelhanças entre o perfil proteico salivar e plasmático em relação à localização celular, processos biológicos, e função molecular (51). Comparado com o perfil proteico humano total, o perfil proteico salivar (PPS) e o perfil proteico plasmático (PPP) se sobressaem na expressão de proteínas que são capazes de indicar função catalítica, funções extracelulares, componentes citoplasmáticos e do citoesqueleto, resposta a estímulos externos, resposta ao estresse molecular, organização celular, biogênese e proteínas de ligação. Por outro lado, ambos os fluidos sub-representam proteínas responsáveis pela comunicação de componentes celulares e intracelulares, como proteínas do ácido nucleico, proteínas reguladoras de transcrição, proteínas transportadoras, proteínas envolvidas na atividade de transdução de sinais, e outros processos metabólicos primários (47). Outro achado importante foi a identificação de imunoglobulinas entre as proteínas com uma alta coincidência em ambos os fluidos. Esta observação levanta a possibilidade de que outros anticorpos detectados no plasma possam ser detectados na saliva, o que poderia contribuir para o diagnóstico e acompanhamento de diversas doenças (47,51).

O PPP e PPS também podem conter um grande número de proteínas associadas com doenças genéticas, o que pode aumentar ainda, o potencial de uso das proteínas salivares na determinação de potenciais candidatos a biomarcadores diagnósticos (48,51).

São vários os estudos que utilizaram fluidos corpóreos na área do TCTH. Na sua maioria, esses estudos buscaram identificar painéis de biomarcadores para a DECH (4,5,45,52–55).

Entretanto, poucos estudos consideraram estudar as alterações na dinâmica do PPS durante a fase aguda do TCTH alogênico.

(36)

(37)

17

3 PROPOSIÇÃO

Estudar variações do perfil proteico salivar desde o início do condicionamento pré TCTH até a enxertia da medula óssea.

Correlacionar a variação do perfil proteico salivar com as manifestações orais da fase aguda, com a mucosite oral e os critérios clínicos de hipossalivação.

(38)

(39)

19

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Desenho do Estudo

Este foi um estudo realizado a partir de um banco de dados de proteômica salivar desenvolvido por Feio et al (2013) (62), pertencente ao nosso grupo de estudo. A obtenção desse banco de dados foi feita a partir de um protocolo de estudo observacional, longitudinal, prospectivo que incluiu pacientes portadores de doenças hematológicas malignas ou não malignas, submetidos a um TCTH alogênico, mieloablativo ou não mieloablativo na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital de Clínicas da Universidade de Campinas, Brasil. O estudo foi realizado durante o período de setembro de 2010 a novembro de 2014. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM), UNICAMP, parecer N.º 1297/2010 (Anexo I).

4.2 Critério de Inclusão de Pacientes

Foram incluídos pacientes adultos (idade superior a 18 anos), de ambos os sexos, que receberam o primeiro transplante, HLA idêntico, provenientes tanto da aspiração da medula óssea ou pela coleta de células progenitoras periférica (CPP), de doador aparentado ou não. Foram somente incluídos no estudo aqueles participantes que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice I).

4.3 Coleta de dados médicos

Informações clínicas adicionais relativas ao TCTH, como tipo de condicionamento pré TCTH, assim como o pior grau de MO acontecida durante o período de hospitalização, foram coletados do prontuário médico do paciente.

4.4 Coleta de dados clínicos odontológicos

A avaliação clínicas oral dos pacientes foi coletada a partir de uma ficha clínica padrão (Apêndice II). Tanto as avaliações clínicas orais como

(40)

20

a coleta de saliva total não estimulada (STNE) foram realizadas nos dois períodos do estudo. O primeiro período, definido como Coleta A, foi realizado antes do início do regime de condicionamento prévio ao TCTH. O segundo período, definido como Coleta B, foi realizado entre os dias D+8-10 pós TCTH.

Todos os pacientes receberam orientação de higiene oral durante o período de internação, que incluiu a manutenção da escovação dentária e o uso de bochecho como digluconato de clorexedine a 0,12% durante todo o período de hospitalização.

4.4.1 Avaliação Clínica oral

Todos os pacientes foram submetidos ao exame clínico oral previamente ao TCTH, sendo este complementado pela realização de radiografia panorâmica para avaliação das estruturas ósseas dos maxilares. O objetivo dessa avaliação foi identificar e remover focos de infecções de origem odontológica e/ou periodontal previamente ao TCTH.

Foram também coletados índices de saúde oral, como o índice de número de dentes Cariados, Perdidos e Obturados (CPOD – OMS) (56); como o Índice Gengival (IG) (57), e o Índice de Placa (IP) (58). Dados sobre o IG e IP foram coletados a partir de 6 dentes índices. O IG avalia a presença de doença periodontal através de uma classificação que varia entre 0 a 3 (onde 0 representa gengiva saudável e 3 representa a presença de inflamação gengival grave). O IP avalia a espessura de placa visível na área cervical dos dentes índices em uma escala de 0 a 3 (onde 0 é mostra a ausência de placa e 3 indica abundância de placa visível).

4.5 Avaliação clínica da mucosite oral (MO)

A mucosite oral (MO) foi avaliada durante a coleta B, utilizando-se os critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS-1979) como demonstrado na Tabela 1.

(41)

21

4.6 Coleta da amostra de saliva total não estimulada (STNE)

As coletas de saliva total não estimulada (STNE) foram realizadas de acordo com a metodologia preconizada, adaptada e publicada por Davies et. al (59). Esta coleta foi realizada pelos pesquisadores associados ao grupo de pesquisa.

As amostras de STNE foram coletadas no período da manhã com intervalo de uma hora após a refeição e/ou com mesmo intervalo da última higiene bucal. Foi solicitado ao paciente que, antes da coleta, deglutisse toda saliva presente na cavidade bucal. Depois disso, foi solicitado que o paciente cuspisse em recipiente estéril, previamente pesado, durante 5 minutos a cada 30 segundos.

Com objetivo de inibir a ação das proteases foi adicionado à saliva coletada o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e o fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) (Sigma-Aldrich®, St. Louis, EUA) (60). Posteriormente, as amostras foram acondicionadas em gelo a 4°C e em seguida, centrifugadas na velocidade máxima de 14000 rotações por minuto por 5 minutos para remoção de materiais insolúveis, células descamadas e restos alimentares. O sobrenadante foi então estocado em tubos de 1,5 ml do tipo Eppendorf® e armazenado em freezer a -80°C (61) até sua análise por espectrometria de massas (EM).

4.7 Análise do Perfil Proteico Salivar (PPS)

A determinação do perfil proteico salivar (PPS) deste grupo foi estudado por meio da espectrometria de massa (EM), com o objetivo de determinar um painel de proteínas salivares com potencial para biomarcadores para Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro (DECH) crônica. Essa análise foi realizada por Feio et al (2013) (62) seguindo os tempos de coleta descritos anteriormente (62).

(42)

22

Para tanto fora primeiramente determinadas as concentrações proteicas total das amostras de saliva, de acordo com Bradford (1976). Posteriormente, essas amostras foram submetidas à digestão para a redução das proteínas em peptídeos.

Para a análise da EM, as amostras foram lidas pelo espectrofotômetro de massas Q-TOF Ultima (Waters®, Miford, MA, EUA) no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio - Centro Nacional de Pesquisas de Energia e Materiais - CNPEM, Campinas, SP, Brasil). Os espectros foram obtidos e, utilizando o software MassLynx v4.1 (Waters®, MA, EUA), os dados brutos foram tratados e padronizados. Os arquivos resultantes foram carregados no softwareScaffold (Scaffold 3_00_3 Proteome ® Software Inc. Portland, OR, EUA) e o valor quantitativo dos espectros foi obtido para cada proteína identificada nas amostras em unidades arbitrárias.

4.7.1 Análise Estatística do PPS na fase aguda do TCTH

As intensidades de todas as proteínas identificadas no estudo de Feio (2013) foram utilizadas no estudo aqui apresentado. Os PPS das coletas A e B foram tabelados no programa Excel® 2007 (Microsoft, WA, EUA), juntamente com os dados clínicos obtidos (critérios de hipossalivação e gravidade de MO). As análises estatísticas e gráficos foram realizados no programa GraphPad® Prism v6.05 (CA, EUA). A fim de comparar a variação da intensidade das proteínas em comum nas coletas A e B, as concentrações proteicas foram definidas como variável dependente e os tempos de coleta com variável independente e utilizando teste T pareado.

O grau de MO do dia da coleta B (D+8 a D+10) como também o pior grau de MO apresentado de até enxertia da medula foram comparados com as divergências proteicas das coletas A e B, assim como os critérios clínicos de hipossalivação utilizando a análise de variância (ANOVA). Estes critérios foram: 1- viscosidade de saliva; 2- aderência da espátula de madeira na mucosa jugal; 3- ausência de lago sublingual; 4- ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida. Neste caso, os dados clínicos

(43)

23

foram tratados como variáveis independentes e as proteínas selecionadas na análise anterior como variáveis dependentes.

Os dados clínicos foram relacionados com o PPS total encontrado entre as coletas A e B, aplicando o teste ANOVA. Outra análise foi realizada visando comparar os dados clínicos obtidos em cada coleta e seu respectivo PPS, usando o teste T pareado. Para todos os testes, o valor de p considerado significativo foi inferior a 0,05.

(44)

(45)

25

5 RESULTADOS

5.1 Características Gerais dos Pacientes

Dezesseis pacientes submetidos ao TCTH alogênico foram incluídos nesta avaliação. 13/16 (81,25%) pacientes receberam enxerto de células progenitoras periféricas (CPP) e 3/16 (18,75%) da medula óssea (MO). Do total de pacientes, 10 (62,5%) eram do gênero feminino e 6/16 (37,5%) do gênero masculino, com mediana de idade 41,96 (20,7-68,4) anos de idade.

Do total de dezesseis pacientes, 15 (93,7%) apresentavam neoplasias hematológicas, sendo 4/15 (25%) leucemia mieloide aguda (LMA), 3/15 (18,7%) leucemia mieloide crônica (LMC), 2/15 (12,5%) linfoma não-Hodgkin (LNH), 1/15 (6,3%) linfoma de não-Hodgkin, 2/15 (12,5%) leucemia linfoide aguda (LLA), 2/15 mielofibrose (12,5%) e 1 (6,25%) síndrome mielodisplásica (SMD). Somente um 1/16 (6,25%) apresentava anemia aplásica grave (AAG).

Os condicionamentos prévios ao TCTH e as características gerais dos pacientes estão representados na Tabela 3.

(46)

26

Tabela 3: Características Gerais dos Pacientes

Número de Pacientes n= 16

Idade (mediana), anos 41,96 (20,7- 68,4)

Gênero, no.(%)

Feminino 10 (62,5)

Masculino 6 (37,5)

Diagnóstico

Leucemias agudas / Síndrome mielodisplásica, no.(%) 7 (43,8) Leucemias crônicas / Mielofibrose, no.(%) 5 (31,2)

Linfomas, no.(%) 3 (18,8)

Anemia Aplásica, no.(%) 1 (6,2)

Fonte de células progenitoras

Medula óssea, no.(%) 3 (18,7)

Sangue periférico, no.(%) 13 (81,6)

Regime de Condicionamento

Mieloablativo, no.(%) 10 (62,5)

Regime de intensidade reduzida, no.(%) 3 (18,7)

Mini-Alogênico, no.(%) 3 (18,7)

Condicionamento

Bulsulfan 4mg/kg e Ciclofosfamida 200mg/kg, no.(%) 1 (6,25) Bulsulfan 16mg/kg e Ciclofosfamida 120mg/kg, no.(%) 6 (37,5) Fludarabina e Irradiação corpórea total, no.(%) 4 (25)

Bulsulfan e Fludarabina, no.(%) 1 (6,25)

Bulsufan, Ciclofosfamida e Etoposide, no.(%) 1 (6,25)

Fludarabina e Melfalan, no.(%) 1 (6,25)

(47)

27

5.2 Avaliação Clínica Bucal

A avaliação dos índices de saúde oral mostrou que o COPD não foi alterado entre as duas avaliações realizadas permanecendo com os valores mínimos e máximos de 4 e 32 dentes, respectivamente. Entretanto, o Índice Placa mostrou um aumento da média entre as duas coletas A e B. Esse aumento foi de 0,43 (0–1,66) para 0,47 (0-1,66),o que resultou em um aumento global do IP de 9,3%. O mesmo aconteceu em relação à média do IG que variou de 0,28 (0-1,33) para 0,39 (0-1,33), o que resultou num aumento global do IG de 39% (Figura 1).

Figura 1: Índices de saúde oral – Índice Periodontal e Índice Gengival entre os períodos de avaliação do

estudo.

5.3 Avaliação da Mucosite Oral (MO)

Em relação à gravidade da mucosite oral (MO) realizada somente na coleta B, 5/16 (31,5%) pacientes apresentaram MO Grau IV, 3/16(18,75%) pacientes apresentaram MO Grau III, 2/16(12,5%) MO Grau II, 1/16(6,25%) paciente apresentou MO Grau I. 5/16 (31,5%) pacientes apresentaram grau zero de MO (Tabela 4).

Em relação ao grau máximo de MO observado até o período da enxertia da medula óssea, 10/16 (62,5%) apresentaram Grau IV, 1/16 (6,25%) apresentou Grau III, 1/16 (6,25%) paciente apresentou Grau II e 1/16 (6,25%) paciente apresentou Grau I. Naquele período, 3/16 (18,75%)

0,41 0,42 0,43 0,44 0,45 0,46 0,47 0,48 A B M ÉD IA IP COLETA 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 A B MÉ DIA IG COLETA

(48)

28

pacientes apresentaram grau zero de MO (Tabela 4).

Tabela 4: Grau de mucosite oral

Grau Coleta B no.(%) Durante Hospitalização no.(%)

IV 5 (31,5) 10 (62,5)

III 3 (18,75) 1 (6,25)

II 2 (12,5) 1 (6,25)

I 1 (6,25) 1 (6,25)

0 5 (31,5) 3 (18,75)

5.4 Correlação entre a variação do perfil proteico salivar e as manifestações clínicas.

As proteínas identificadas neste estudo foram nomeadas em língua inglesa, por serem assim reconhecidas em publicações internacionais. As proteínas foram denominadas de acordo com a base de dados UniProt ® (

European Bioinformatics Institute, RU; Swiss Institute of Bioinformatics, SIW; Protein Information Resource, EUA).

5.4.1 Variação do Perfil Proteico Salivar entre as coletas A e B

Todas as proteínas que apresentaram intensidade nas coletas A e B foram identificadas e tabeladas; 65 proteínas foram identificadas na coleta A (Tabela 5) e 57 proteínas na coleta B (Tabela 6).

(49)

29

Tabela 5: Perfil Proteico Salivar da coleta A

Proteína UniPro ID

64 kDa protein P33240

Actin, alpha skeletal muscle P68133

Actin, cytoplasmic 1 P63261 Alpha-1-acid glycoprotein 1 P02763 Alpha-amylase 1 P04745 Annexin A1 P04083 Antileukoproteinase P03973 Bactericidal/permeability-increasing protein-like 1 Q8N4F0 Beta-2-microglobulin P61769

cDNA FLJ14473 fis, clone MAMMA1001080, highly similar to Homo sapiens SNC73

protein (SNC73) mRNA Q96K68

cDNA FLJ54957, highly similar to Transketolase P51854

cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6 B4DUH8

Ceruloplasmin P00450

Cystatin-D P28325

Cystatin-S P01036

Cystatin-SA P09228

Cystatin-SN P01037

Glucose-6-phosphate isomerase Q9N1E2

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase O14556

GUCA1B protein (Fragment) A4FUA1

haptoglobin isoform 2 preproprotein F7GTV0

Hemoglobin alpha-2 Q96T46

Hemoglobin subunit beta P68871

Ig alpha-2 chain C region P01877

Ig kappa chain V-III region GOL P04206

Ig mu heavy chain disease protein P04220

IGL@ protein Q8N355

Immunoglobulin J chain P01591

IPI00888430-R (Dynein heavy chain 17, axonemal) Q9UFH2 IPI00979515-R (Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 23) O75077

Isoform 1 of Alpha-1-antitrypsin P01009

(50)

30 Continuação

Proteína UniPro ID

Isoform 1 of Deleted in malignant brain tumors 1 protein Q9UGM3

Isoform 1 of Kallikrein-1 P06870

Isoform 1 of Keratin, type I cytoskeletal 13 P13646

Isoform 1 of Long palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 1 Q8TDL5

Isoform Sap-mu-0 of Proactivator polypeptide P07602

Isoform Short of Gastric inhibitory polypeptide receptor P48546

Keratin, type II cytoskeletal 6B P04259

Lactoperoxidase P22079

Lipocalin-1 P31025

Lysozyme C P61626

Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region (Fragment) Q9UL72

Neutrophil defensin 1 P59665

Polymeric immunoglobulin receptor Q8IYS5

Prolactin-inducible protein P12273

Protein S100-A7 P31151

Putative uncharacterized protein DKFZp686N02209 Q7Z351

Putative uncharacterized protein DKFZp686O16217 (Fragment) Q6N041

Serotransferrin P02787

Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2 Q96DR5

Similar to Hepatitis B virus receptor binding protein Q6PYX1

Statherin P02808

Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B P02814

suprabasin isoform 1 precursor Q6UWP8

Thioredoxin Q9BRA2

UPF0762 protein C6orf58 Q6P5S2

vitamin D-binding protein isoform 1 precursor P02774

Zinc-alpha-2-glycoprotein P25311

Zymogen granule protein 16 homolog B Q96DA0

Uncharacterized protein -

(51)

31

Tabela 6: Perfil Proteico Salivar da coleta B.

Proteína UniProt ID Actin, cytoplasmic 1 P63261 Alpha-2-macroglobulin P01023 Alpha-amylase 1 P04745 Annexin A1 P04083 Antileukoproteinase P03973 Apolipoprotein A-I P02647 Bactericidal/permeability-increasing protein-like 1 Q8N4F0 Beta-2-glycoprotein 1 P02749 Beta-2-microglobulin P61769 Carbonic anhydrase 1 P23280

protein (SNC73) mRNA Q96K68

Cornifin-A P35321

Cystatin-S P01036

Fibrinogen beta chain P02675

Hemoglobin subunit alpha P69905

Hemoglobin subunit delta P02042

Hemopexin P02790

Histatin-1 P15515

IPI00853396-R (Patched domain-containing protein 2) Q9P2K9

Isoform 1 of 14-3-3 protein sigma P31947

Isoform 1 of Fibrinogen alpha chain P02671

(52)

32 Continuação

Proteína UniProt ID

Isoform Gamma-B of Fibrinogen gamma chain P02679

Lysozyme C P61626

Mucin-7 Q8TAX7

Putative uncharacterized protein DKFZp686O16217 (Fragment) Q6N041

Serum amyloid A protein P0DJI8

Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2 Q96DR5

Small proline-rich protein 2B P35325

Small proline-rich protein 3 Q9UBC9

Statherin P02808

Putative uncharacterized protein -

Foram encontradas 39 proteínas presentes em comum entre as duas coletas A e B (tabela 7).

(53)

33

Tabela 7: Perfil Proteico Salivar em comum das coleta A e B

Proteína UniProt ID Alpha-amylase 1 P04745 Annexin A1 P04083 Antileukoproteinase P03973 Bactericidal/permeability-increasing protein-like 1 Q8N4F0 Beta-2-microglobulin P61769

protein (SNC73) mRNA Q96K68

Cystatin-S P01036

Lysozyme C P61626

Putative uncharacterized protein DKFZp686O16217 (Fragment) Q6N041

Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2 Q96DR5

Statherin P02808

(54)

34 Continuação

Proteína UniProt ID

Putative uncharacterized protein -

Dentre essas, 7 (18%) proteínas se apresentaram com diferenças estatisticamente significativas. Essas proteínas foram a Prolactin-inducible

protein, a Alpha-Amylase 1, a Cystatin-SN, Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B, a Statherin , a vitamin D-binding protein isoform 1 precursor e a cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6

(Tabela 8).

Tabela 8: Proteínas salivares que mostraram diferentes intensidades entre as Coletas A e B (Teste T pareado)

Proteína

UniProt

Entry name UniProt

ID Coleta A (Unidades arbitrárias) Coleta B (Unidades arbitrárias) P

Prolactin-inducible protein _PIP _P12273 _20,695 _5,293 _0,0005

Alpha-Amylase 1 _AMY1 _P04745 _230,084 _137,250 _<0,0001

Cystatin-SN CST1 P01037 _29,350 _11,216 0,031

Submaxillary gland

androgen-regulated protein 3B SMR3B_HUMAN P02814 12,282 6,336 0,008

Statherin STATH P02808 _1,986 _0,208 0,009

vitamin D-binding protein

isoform 1 precursor VTDB_HUMAN P02774 0,297 1,917 0,009

cDNA FLJ60163, highly similar

(55)

35

Prolactin-inducible protein demonstrou uma diminuição de

intensidade de 20,695 para 5,293 (25,57%) entre os dois tempos de coleta (p= 0,0005). A Alpha-Amylase 1 também apresentou uma diminuição de intensidade entre as coletas A e B de 230,084 para 137,250 (59,65%) (p< 0,0001). A

Cystatin-SN também apresentou em decréscimo de intensidade entre as

coletas A e B, de 29,350 para 11,216 (38,21%) (p= 0,031).

A Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B

(SMR3B_HUMAN) diminui sua intensidade de 12,282 para 6,336 (51,58%) (p=

0,008). A proteína Sthaterin (STATH), apresentou uma diminuição de intensidade de 1,986 para 0,208 (10,47%) (p= 0,009) entre as coletas A e B. A proteína cDNA FLJ60163, highly similar to Carbonic anhydrase 6

(B4DUH8_HUMAN )também apresentou um decréscimo de intensidade entre as coletas, de 5,301 para 1,416 (26,71%) (p= 0,024).

A proteína vitamin D-binding protein isoform 1(B4DUH8_HUMAN)

precursor foi a única que mostrou um aumento de intensidade entre as

coletas A e B, de 0,297 para 1,917 (645%) (p= 0,0099).

A variação do perfil proteico salivar (PPS) entre as coletas A e B está demonstrada no Quadro 1.

(56)

36

Quadro 1: Variação da intensidade das proteínas, em unidades arbitrárias, de acordo com a Coleta A e

(57)

37

5.4.2 Correlação entre o Perfil Proteico Salivar (PPS) e dados clínicos

Foram correlacionados os critérios de hiposalivação encontrados na avaliação clínica na coleta B com as alterações de intensidades das 7 proteínas encontradas entre as duas coletas, A e B.

O resultado dessa correlação mostrou que o critério clínico de hiposalivação “aderência da espátula de madeira na mucosa jugal” foi correlacionado com a PIP (p=0,024). A proteína Sthaterin foi correlacionada também com o critério clínico de “ausência de excreção salivar sob pressão manual” (p=0.0281) (Tabela 9).

Tabela 9: Valores de P na correlação do PPS e critérios de hipossalivação realizados na coleta B

PIP AMY1 CST1 SMR3B_HUMAN STHAT VTDB_HUMAN B4DUH8_HUMAN

Viscosidade da saliva 0,6943 0,5673 0,4414 0,8673 0,7774 0,8696 0,8246 Aderência da espátula de madeira na mucosa jugal 0,0245 0,7774 0,9826 0,7725 0,2031 0,4776 0,7490 Ausência do lago sublingual 0,7709 0,0974 0,2919 0,1837 0,6143 0,1585 0,6190 Ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida 0,0687 0,5486 0,3011 0,5662 0,0281 0,9393 0,2102

A Prolactin-inducible protein apresentou uma correlação negativa com aqueles pacientes que apresentaram o critério de hiposalivação “aderência da espátula de madeira na mucosa jugal”. Entretanto essa correlação foi maior na coleta A quando comparada com a coleta B (p=0,0245) (Figura 1).

(58)

38

Figura 1: Intensidade da proteína Prolactin-inducible protein nas coletas A e B entre os grupos que

apresentaram ou não “Aderência da espátula de madeira na mucosa jugal” (ANOVA)

A proteína Statherin apresentou-se em maior intensidade naqueles pacientes que não apresentaram o critério clínico de hiposalivação “ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida”. Essa correlação também mostrou-se maior na coleta A quando comparada com a coleta B (p=0,281) (Figura 2).

Figura 2: Intensidade da proteína Statherin nas coletas A e B entre os grupos que apresentaram ou não

“Ausência de secreção sob pressão manual do ducto da parótida” (ANOVA)

5.4.3 Correlação entre o PPS e a gravidade da mucosite oral

Quando correlacionada a PPS com a gravidade de MO no dia da coleta B, 2/39 proteínas demonstram um decréscimo de acordo com o aumento do grau de MO. Essas foram a Immunoglobulin J chain (p=0,01) e

Pulative uncharacterized protein DKFZp686N02209 (UniProt ID: Q7Z351),

(p=0,047). Neste caso, as duas proteínas mostraram maior quantidade Prolactin-inducible protein

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39

naqueles pacientes que apresentaram grau de MO 0-II e menor quantidade em pacientes que apresentaram MO com gravidade III-IV como apresentado nos Quadros 2 e 3.

Quadro 2 e 3: Intensidade da proteína Immunoglobulin J chain e da Intensidade da proteína Pulative

uncharacterized protein DKFZp686N02209, em unidades arbitrárias nos grupos de pacientes com

Mucosite Oral (MO) grau 0-II e III-IV. (Teste T pareado)

. Ao correlacionar essas duas proteínas com o tempo da coleta A e B, a Immunoglobulin J chain apresentou um decréscimo quando relacionada à gravidade de MO observado nas coletas A e B (p=0,0113).

Quando os graus de MO são observados isoladamente de acordo com o tempo, observa-se que a intensidade da Immunoglobulin J chain decai de acordo com o aumento do grau de gravidade de MO. E quando os graus de MO dicotomizados segundo a gravidade da mucosite entre grupos com 0, I e II e grupo com gravidade III e IV , a quantidade de proteína permanece a mesma entre os dois períodos do estudo, como demonstrado no Quadro 4.

Quadro 2 Quadro 3

MO grau 0-II MO grau III-IV

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Quadro 4: Intensidade da proteína Immunoglobulin J chain, em unidades arbitrárias, de acordo com o

tempo de coleta (A e B) e o grau de Mucosite Oral (MO). O quadro à direita demonstra a intensidade da proteína entre os diferentes graus de MO de acordo com o tempo de coleta; enquanto à esquerda, a intensidade da proteína entre os graus de MO agrupados entre: MO grau 0-II e MO grau III-IV (ANOVA).

Quando relacionadas as 39 proteínas encontradas no PPS em relação à maior gravidade da MO encontrada até a enxertia da medula óssea, as proteínas Statherin e Immunoglobulin J chain apresentaram uma diferença significativa de acordo com o grau de MO (p= 0,0173 e p= 0,0065 respectivamente). A Sthaterin apresentou uma maior intensidade naqueles pacientes que apresentaram MO grau III e IV, enquanto pacientes com MO grau O-II não mostraram a presença da intensidade desta proteína (Quadro 5).

Entretanto a Immunoglobulin J chain apresentou diminuição de intensidade nos pacientes com grau de MO III-IV. Neste caso, essa proteína foi encontrada com maior presença e com maior intensidade em pacientes que apresentaram grau de MO (0-II), enquanto nos pacientes com grau (III-IV) esta apresentou uma menor intensidade (Quadro 5).

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Quadro 5: Correlação entre intensidade proteica, em unidades arbitrárias, com grau de Mucosite Oral

(MO).

MO grau 0-II MO grau III-IV

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