Para a filtração das amostras foi utilizado o sistema Filta-MaxTM, da IDEXX. Nesse sistema, a amostra é forçada a passar, com o auxílio de uma bomba, por um filtro constituído de múltiplas camadas de espuma comprimidas, onde os oocistos devem ficar retidos (Figura E.1). A vazão de bombeamento adotada foi, em média, de 2 litros por minutos. Durante esse processo, a pressão operacional era controlada, permanecendo na faixa entre 0,5 kgf/cm2 e 1 kgf/cm2. Com o fim de lavar as tubulações eram passados em torno de 2 L de PBST antes da colocação do filtro na cápsula de lavagem.
Figura E.1 – Sistema de filtração Filta Max e bomba peristáltica
Após a filtração os filtros passavam pelo processo de eluição que consiste na expansão dos discos de esponja para retirada dos oocistos (ver Figura E.2). Os filtros eram acoplados na estação de lavagem Filta MaxTM onde eram submetidos a três lavagens com 600 mL de PBST e 30 movimentos de compressão e descompressão em cada uma das lavagens. A solução tampão salina de fosfato (PBST) era preparada conforme recomendação (USEPA, 2005) e com os produtos químicos indicados na Tabela E.1.
Tabela E.1 – Produtos químicos e quantidades utilizadas na preparação do PBST
Produto Químico Fabricante Quantidade /Litro
Fosfato de Sódio bibásico P.A (Na2HPO4.2H2O) Vetec 1,44 g/L
Cloreto de Sódio P.A (NaCl) Cromoline 8 g/L
Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4) J.T. Baker 0,2 g/L
Cloreto de Potássio (KCl) Reagen 0,2 g/L
(a) (b) (c) Figura E.2 – Estação de eluição Filta MaxTM: (a) fase de compressão; (b) fase de descompressão; (c) Filtro de espuma Filta Max antes e após a expansão
O eluato produzido (PBST, impurezas e oocistos de Cryptosporidium) era submetido a filtração á vácuo em membrana de 73 mm de diâmetro e retenção de 3 μm, deixando os oocistos concentrados na superfície da membrana. Após a filtração, a membrana era lavada com solução de PBST, e a solução de lavagem, contendo as impurezas incluindo os oocistos, era transferida para um tubo cônico de 50 mL, para então ser submetida a primeira centrifugação em 1500 g por 15 minutos. Após essa centrifugação o líquido sobrenadante era descartado, e o concentrado, com aproximadamente 10 mL de sobrenadante, era ressuspendido e transferido para um tubo de 15 mL e conduzido para a segunda centrifugação em condições semelhantes a primeira. As Figuras E.3 e E.4 mostram detalhes da etapa de concentração (filtração, lavagem e centrifugação).
(a) (b)
Figura E.3 – Etapas da concentração: (a) Filtração pela membrana; (b) Lavagem da membrana
(a) (b) Figura E.4 – Etapas da centrifugação: (a) Centrifuga; (b) Tubos cônicos de 50 mL para
primeira centrifugação e tubos cônicos de 25 mL para a segunda centrifugação
Ao final da segunda centrifugação, parte do líquido sobrenadante era descartado, o concentrado formado e aproximadamente 5 mL do restante do líquido sobrenadante era ressuspendido em vortex e transferido para o tubo especial com uma das de faces achatada (Dynal, Franca). Dando início a etapa de purificação por meio de separação imunomagnética, eram adicionados a esses tubos os tampões (10X SL Buffer A e 10X SL Buffer B) e 100 μL de micro-esferas imunomagnéticas anti-Cryptosporidium (Dynabeads, Dynal-Brotech, Franca) que são os grânulos magnéticos conjugados a anticorpos monoclonais que fazem à captura dos oocistos. Na seqüência os tubos eram colocados no homogeneizador por inversão (Phoenix, AP22, Brasil) na rotação de 15 a 20 rpm por um período de 1 hora. A Figura E.5 ilustra detalhes dessa etapa do método.
(a) (b)
Figura E.5 – Etapas da purificação: (a) Produtos que são adicionados para promoverem a separação imunomagnética; (b) Tubos achatados acoplados no homogeneizador
Após esse período de mistura os tubos eram colocados no concentrador magnético de partículas (MCP-1, Dynal, Franca), eram feitos movimentos de 90° durante 3 minutos, com o fim de permitir que todo o material aderido às esferas (beads) ficasse preso na face plana do tubo que estava em contato com o campo magnético (Figura E.6). Em seguida, com os tubos ainda no concentrador, todo o líquido presente era removido e preservado em outro recipiente para repetição desse procedimento. Os tubos com resíduos eram retirados do concentrador e lavados com uma diluição de 1X SL Buffer A para promover o total desprendimento das esferas magnéticas (beads) das paredes dos tubos.
(a) (b)
Figura E.6 - Etapas da purificação: (a) Tubo no concentrador de partículas; (b) Tubo com esferas magnéticas (beads) aderidas à face plana
O material obtido na lavagem era transferido para recipientes de 1,5 mL (tubo tipo Eppendorf) e os mesmos encaixados em um outro concentrador magnético de partículas (MPC-S, Dynal, Franca) onde eram realizados movimentos com giro de 180° durante o tempo de 3 minutos, para promover a adesão de todo o material (oocistos e esferas magnéticas) na parede do tubo tipo Eppendorf (Figura E.7).
Figura E.7 - Tubos tipo Eppendorf no concentrador de partículas, com as esferas magnéticas aderidas á parede
O líquido remanescente era retirado por meio de micropipeta e o tubo Eppendorf lavado com 100 μL de ácido clorídrico (HCl, 0,1 N) em duas séries de lavagem. Primeiramente era adicionado 50 μL de ácido ao tubo Eppendorf e estes eram agitados em vortex (Marconi, MA-162) na máxima velocidade por aproximadamente 1 minuto (Figura E.8). Em seguida os tubos eram deixados em repouso por 10 minutos, tempo este necessário para que ocorresse o desprendimento dos microrganismos das esferas magnéticas (dissociação ácida). Após os 10 minutos eram novamente agitados por mais 30 segundos. e acoplados ao concentrador magnético para que ocorra agora somente a aderência das esferas magnéticas O líquido isento das esferas (ácido e oocistos de Cryptosporidium) era transferido para outro Eppendorf que continha 10 μL de Hidróxido de Sódio (NaOH, 1,0 N) para ajustar e neutralizar o pH.
Figura E.8 – Tubos no agitador vortex na etapa de dissociação dos oocistos de Cryptosporidium das esferas magnéticas (beads)
Para concluir a lavagem e separação era adicionado ao eppendorf que continha as esferas magnéticas mais 50 μL de ácido para recuperar possíveis oocistos que ainda teriam ficado ligados às esferas e repetido o procedimento. O volume resultante das duas lavagens (aproximadamente 110 μL) representava a amostra concentrada que era utilizada na preparação das lâminas para a identificação e enumeração dos oocistos de Cryptosporidium.
Os padrões utilizados para o ajuste de pH são do fabricante Merck (ácido clorídrico - HCl, 0,1 N e hidróxido de sódio - NaOH, 1,0 N) e foram comprados já nas referidas normalidades, ou seja não foram ajustadas no laboratório, seguindo orientação da USEPA (2005).
Para cada experimento eram preparadas lâminas das amostras concentradas de AB*, AF1 e AF2, utilizando-se o DAPI-4’6-diamidino-2-fenilindol (SIGMA) na concentração de 2 mg/mL e o kit Merifluor Cryptosporidium/Giardia (Meridian Bioscience, Inc.) que emprega o método da imunofluorescência direta.
As lâminas foram preparadas em duplicatas, ou seja, dois poços para cada amostra. Em cada poço era adicionado 20 μL de amostra que permaneciam em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos para secagem. Em seguida, acrescentava-se à amostra o reagente de detecção que contém a mistura de anticorpos monoclonais anti- Cryptospsoridium marcados com FITC e o corante de contraste (solução negro de eriocromo). As lâminas eram então incubadas em câmara úmida por 30 minutos e protegidas da luz, e após esse período eram lavadas com solução tampão 1X com o fim de remover os anticorpos que não foram ligados aos oocistos. Aplicava-se então 50 μL de solução corante de 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) na concentração de 0,8 μg/mL e deixava reagir por 1 minuto,e em seguida, lavava-se o poço e retirava-se o excesso de DAPI. Por fim, era acrescentada a solução de meio de montagem (glicerol tamponado contendo formalina), aplicava-se a lamínula e selava-se suas bordas com esmalte de unhas. A Figura E.9 mostra o kit Merifluor e o DAPI utilizados na preparação da lâmina.
Figura E.9 – Kit Merifluor, DAPI e lâmina preparada
As lâminas preparadas eram examinadas em um microscópio de epifluorescência (DMLB- 2, Leica) mostrado na Figura E.10, equipado com dispositivo de contraste de interferência diferencial (DIC), filtros para imunofluorescência e filtros para DAPI. A identificação e enumeração dos oocistos eram realizadas, percorrendo todos os campos de cada poço das
Marcador - FITC Corante de contraste Meio de Montagem DAPI
lâminas e utilizando o FITC, DAPI, DIC e a ocular micrométrica, com aumento de 1000X, ou seja, verificando a imunofluorescência, a coloração dos núcleos, morfologia interna e externa e o tamanho das possíveis partículas positivas.
Figura E.10 – Microscópio de epifluorescência - (DMLB-2, Leica)
Ao final da contagem dos dois poços por amostra concentrada, obtinha-se o número de oocistos relativos a 40 μL de um total de 110 μL. Aplicando a Equação E.1 determinava-se o número de oocistos de Cryptosporidium da amostra submetida à concentração.
(
)
Vam Val Vc N L oocistos no ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ × = / ………...………(Equação E.1) Onde:N = número de oocistos encontrados em cada poço;
Vc = volume final do concentrado, aproximadamente 110 μL;
Val = volume do concentrado, em μL, adicionado a cada poço da lâmina; Vam = Volume da amostra, em L, submetido ao processo de concentração.