Tabela 1 - Incidência de coliformes isolados de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN).
Coliformes Nº de coletas Nº de amostras
positivas Incidência (%) Citrobacter sp 50 17 27,5 Enterobacter sp 50 10 16,1 Escherichia coli 50 25 40,3 Klebsiella sp 50 10 16,1 8.2 APÊNDICE B
Tabela 2 - Perfil de resistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN) Grupo coliforme/Nº de amostras examinadas Percentual de Resistência Antimicrobianos testados
AMP NIT TCY CHL AMK CIP SXT GEN NAL
Citrobacter sp (17) 35,3 5,9 23,5 0 0 ND 11,8 0 5,9 Enterobacter sp (10) 90 0 10 0 0 ND 10 0 10 Escherichia coli (25) 4 4 8 0 0 ND 8 0 20 Klebsiella sp (10) 70 30 20 10 0 ND 10 0 40
O número dentro do parênteses significa o número de amostras testadas;
O número fora do parênteses significa o percentual de amostras resistentes aos antimicrobianos testados;
ND – Não determinado.
Antimicrobianos testados: AMP (ampicilina), NIT ( nitrofurantoína), TCY (tetraciclina), CHL (cloranfenicol), AMK (amicacina), CIP (ciprofloxacina), SXT (sulfametoxazol + trimetoprim), NAL (ácido nalidíxico), GEN (gentamicina).
64 Tabela 3 - Perfil de multirresistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal - RN
Grupo coliforme Amostras multirresistentes
Perfil de multirresistência Antimicrobianos
AMP NIT TCY CHL SXT NAL
Citrobacter sp 1 R R 1 R R R Enterobacter sp 1 R R R R Escherichia coli 1 R R 1 R R 1 R R R Klebsiella sp 1 R R R R R 1 R R 1 R R 1 R R R R 1 R R
Antimicrobianos aos quais as amostras foram multirresistentes:
AMP – ampicilina, NIT – nitrofurantoína, TCY – tetraciclina, CHL – cloranfenicol, SXT –
Sulfametoxazol + trimetoprim, NAL – ácido nalidíxico.
A Tabela 1 (Apêndice A) mostra a incidência de coliformes isolados a partir de camarões (Litopenaeus vannamei) frescos e refrigerados, comercializados na cidade de Natal-RN. Nas Tabelas 2 e 3 respectivamente, estão descritos os perfis de resistência e multirresistência dessas bactérias aos antimicrobianos utilizados na presente pesquisa (Apêndice B).
O coliforme isolado com maior frequência foi Escherichia coli, seguida de
Citrobacter spp, (Tabela 1).
De acordo com a Tabela 2 pode-se observar que o antimicrobiano menos eficaz com relação aos coliformes foi a ampicilina (AMP), fato esse que
65 foi também observado com as amostras de víbrio isoladas (Figura 1 – Artigo 2), consolidando a hipótese de transferência de genes de resistência, dos coliformes para os vibrios ou vice-versa, através da aquisição de plasmídios R (Molina-Aja et al., 2002).
Devido a exiguidade do tempo, não foi possível realizar a cura plasmidial com as amostras de coliformes isoladas, para comprovação de tal fato, mas posteriormente pretende-se fazer esses experimentos para confirmação dessa hipótese. Essa foi a razão da não inclusão desses dados nos artigos submetidos à publicação.
A conjugação bacteriana, descoberta por Lederberg e Tatum (1946), é o processo sexual de transferência de genes de uma bactéria doadora para uma receptora. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extracromossômico). O processo de conjugação foi descoberto em Escherichia coli K12 e o elemento responsável foi chamado de fator F (também chamado de plasmídio F). Este plasmídio pode estar, ou não, integrado no cromossomo da bactéria hospedeira. Quando integrado, a bactéria é chamada de HFr (alta frequência de recombinação) devido à mobilização de genes cromossômicos no processo de conjugação desencadeado por produtos gênicos do plasmídio. A célula F+, durante o contato com um célula F-, transfere para esta última uma cópia do plasmídio F, tornando-a F+. A linhagem HFr, onde o fator F encontra-se integrado no cromossomo, transfere essencialmente marcadores localizados no cromossomo, sendo que apenas muito raramente a totalidade do fator F é transferida (conjuntamente com todo o cromossomo da doadora). Portanto, nesse caso a célula receptora permanece F- após a conjugação. Após a
66 descoberta do fator F, outros plasmídios conjugativos foram descritos, como os plasmídios R. Esses plasmídios têm esse nome genérico por conterem marcadores de resistência a drogas antibacterianas e em geral não se integram no cromossomo bacteriano. A conjugação bacteriana é um processo de recombinação genética realizado entre bactérias de gêneros diferentes, que permite verificar a transferência de material genético de uma célula para outra através de um pilus sexual (Davis et al., 1979; Trabulsi; Alterthum, 2008).
8.3 APÊNDICE C
Tabela 4 – Perfil de resistência a antimicrobianos da Escherichia coli K12C600 após a conjugação bacteriana, adquirido de espécies de Vibrio isoladas de camarões frescos e refrigerados, comercializados em Natal - RN
Estirpes Perfil Perfil da E. coli K12C600
após Conjugação
Vibrio cholerae não O1/não O139 Grupo I
Heiberg
AMPi, TETi AMPr
Vibrio harveyii AMPr, AMKr,CIPi, NITi AMPi Vibrio cincinnatiensis AMPr, AMKr, TETr TETr Vibrio parahaemolyticus AMPr, AMKr, TETi, CIPi AMPi, TETr
Vibrio sp AMPr, TETr AMPi, TETr
Vibrio carcharie AMPr, AMKr AMPi
Vibrio cholerae não O1/O139 grupo II Heiberg
AMPi, AMKi AMPr
Vibrio carcharie AMPr AMPr
Vibrio sp AMPr, TETr AMPr, TETr Vibrio carcharie arab+ NITi, CIPi, TETi ---
Vibrio carcharie AMPr, AMKr --- Vibrio alginolyticus AMPr, AMKr, TETi, CIPi, NITi AMPr Vibrio alginolyticus AMPr, AMKi AMPr Vibrio cholerae não
O1/O139 grupo II Heiberg
AMPi, AMKi AMPr
i – intermediário r- resistente
AMP – AMPICILINA; AMK – AMICACINA; TET - TETRACICLINA; NIT –
67 A Tabela 4, mostra os resultados da conjugação feita com amostras de vibrios monoresistentes, multirresistentes e com resistência intermediária, escolhidas aleatoriamente e Escherichia coli K12C600, cepa sensível a todos antimicrobianos testados antes da conjugação. Analisando a Tabela 4, pode-se observar que 78,6% das culturas de Vibrio testadas, revelaram transferência para o gene que confere resistência à ampicilina e 28,6% para a tetraciclina.
Os plasmídios têm sido encontrados em vibrios, e em alguns casos estão envolvidos com a resistência a vários antibióticos (Zhao et al., 1992). Molina Aja et al. (2002), investigaram a presença de plasmídios e sua relação com resistência a antibióticos em cepas isoladas de camarões peneídeos cultivados no México, país onde a utilização de antimicrobianos nos viveiros com a finalidade terapêutica é muito difundida. De acordo com os resultados, os autores concluíram que, a resistência a antimicrobianos em vibrios é bastante difundida e que os plasmídios R exercem um papel fundamental nessa difusão.
Como o nosso estado faz parte do litoral brasileiro, onde o consumo de crustáceos, peixes e ostras é muito grande, principalmente, camarões de viveiro, espera-se que este trabalho científico, sirva de incentivo para futuras pesquisas sobre a multirresistência antimicrobiana nas bactérias encontradas nesses alimentos, com a finalidade de alertar os órgãos de saúde pública sobre a necessidade de um monitoramento mais eficaz e constante.
68 8.4 APÊNDICE D - Lista de Publicações em Eventos
Resumos Publicados em Anais de Congressos:
Eventos Nacionais:
Melo, L. M. R. de; Almeida, D.; Hofer, E.; Theophilo, G. N. D.; Godeiro, R. M. C. D. B.; Reis, C. M. F. dos,; Vieira, R. H. S. F. Ocorrência de Vibrio
parahaemolyticus, em camarão (Litopenaeus vannamei)fresco e refrigerado
comercializado na cidade de Natal - Rio Grande do Norte – Brasil. In: 25º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2009, Porto de Galinhas-PE.
Melo, L. M. R. de; Almeida, D.; Hofer, E.; Leal, N. C.; Araújo, C.; Vieira, R. H. S. F. Perfil plasmidial e resistência antimicrobiana de Vibrio e Aeromonas isolados de camarão (Litopenaeus vannamei) fresco e refrigerado comercializado na cidade de Natal- Rio Grande do Norte – Brasil. In: 25º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2009, Porto de Galinhas-PE.
Melo, L. M. R.; Almeida, D.; Hofer, E.; Sousa, O. V.; Godeiro, R. M. C. D. B.; Carvalho, E. M. R.; Vieira, R. H. S. F. Multirresistência em espécies dos gêneros Vibrio e Aeromonas, isolados de camarão (Litopenaeus vannamei) comercializados na cidade de Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. In: 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2011, Foz do Iguaçu. PR.
69
25º Congresso Brasileiro de Microbiologia ResumoID:215-1
Área: Microbiologia de Alimentos ( Divisão K )
OCORRÊNCIA DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, EM CAMARÃO (LITOPENAEUS
VANNAMEI)FRESCO E REFRIGERADO COMERCIALIZADO NA CIDADE DE NATAL -
RIO GRANDE DO NORTE - BRASIL
Ligia Maria Rodrigues de Melo(UnP); Dulce Almeida(UFRN); Ernesto Hofer(IOC); Grace Nazareth Diogo Theophilo(IOC); Raissa Maria Chaves Dantas Barretto Godeiro (UnP); Cristhiane Moura Falavina dos Reis(IOC); Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira
(LABOMAR)
Resumo
Como produto resultante do desenvolvimento da carcinicultura no Nordeste do Brasil, o camarão mais consumido na cidade de Natal/RN é da espécie Litopenaeus vannamei, cultivado em ambientes aquáticos artificiais de baixa salinidade. A água destes viveiros, por suas propriedades abióticas favorece a sobrevivência e multiplicação de uma variedade de microrganismos, dentre os quais, salienta-se os membros do gênero Vibrio. Algumas espécies são potencialmente patogênicas para o homem e podem ser veiculadas através do consumo destes crustáceos preparados de modo inadequado, exemplificando-se a ausência ou pouca cocção do produto, causando o quadro de gastroenterite. No elenco dos vibrios patogênicos, a espécie Vibrio parahaemolyticus, além de ser uma das causas de toxinfecção alimentar das mais importantes na atualidade, associa-se com muita freqüência, a doenças do camarão, principalmente nos criadouros localizados em áreas tropicais ou subtropicais, em que a temperatura da água oscila entre 20 a 30ºC, o que favorece a sua propagação. Foi pesquisada a presença de Vibrio parahaemolyticus em cinqüenta (50) amostras de camarões (Litopenaeus vannamei) frescos e refrigerados, comercializados na cidade de Natal - Rio Grande do Norte (RN). Do total de cento e seis (106) cepas de vibrios isoladas, dez (10), (9,4%) foram identificadas como V. parahaemolyticus. O teste de Kanagawa (KP) e a técnica de PCR - Multiplex foram usados para detecção das hemolisinas tdh, trh e genes TDH, TRH e TLH respectivamente. Todas as cepas foram Kanagawa negativas e apresentaram o gene TLH. Para os sete (7) antimicrobianos testados, cinco (5) cepas (50%) mostraram multiresistência para ampicilina (90%) e amicacina (60%) e duas (2) resistência intermediária para amicacina (20%). Todas as cepas foram sensíveis ao cloranfenicol e exibiram sensibilidade e/ou resistência intermediária aos demais antibióticos testados numa faixa de 90% a 10%, com destaque para a gradativa resistência intermediária revelada pela ciprofloxacina. A multiresistência detectada torna esses resultados altamente relevantes considerando que, a presença de cepas resistentes ou multiresistentes podem concorrer com a microbiota autóctone do ambiente do camarão e, representar um risco à saúde pública.
Palavras-chave: Enteropatogenicidade, Litopenaeus vannamei, Multiresistência, Vibrio parahaemolyticus
70
25º Congresso Brasileiro de Microbiologia ResumoID:215-2
Área: Microbiologia de Alimentos ( Divisão K )
PERFIL PLASMIDIAL E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE VIBRIO E AEROMONAS ISOLADOS DE CAMARÃO (LITOPENAEUS VANNAMEI) FRESCO E REFRIGERADO COMERCIALIZADO NA CIDADE DE NATAL - RIO GRANDE DO NORTE - BRASIL
Ligia Maria Rodrigues de Melo(UnP); Dulce Almeida(UFRN); Ernesto Hofer(IOC); Nilma Cintra Leal(FIOCRUZ); Claudio Eduardo Cavalcanti de Araújo(FIOCRUZ); Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira (LABOMAR)
Resumo
A freqüência de enfermidades infecciosas e não infecciosas que acometeu o cultivo de camarão, aumentou significativamente, com ampla repercussão econômica em vários países produtores. Os carcinicultores tentando minimizar os prejuízos fizeram uso de grande quantidade de antibióticos nos sistemas de cultivo, provocando assim alterações no meio ambiente, acúmulo de sedimentos e resistência bacteriana aos antimicrobianos. O aparecimento desta resistência pode ter sido causado por mutações espontâneas e recombinações de genes criando uma variabilidade genética sobre a qual atua a seleção natural. Para lidar com a pressão seletiva exercida pelos antimicrobianos, a aquisição de elementos extracromossômicos de resistência (plasmídeos R) tem sido a arma mais eficaz dos microrganismos. A possibilidade de transferência desses plasmídeos de resistência nas bactérias que colonizam o camarão de viveiro, ocorre principalmente entre espécies do gênero
Vibrio. Padrões de resistência a sete (7) diferentes antibióticos foram determinados em cepas
de Vibrio e Aeromonas, isoladas de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado em supermercados e revendedores ambulantes em Natal - RN - Brasil. Vinte e três (23) espécies de Vibrio e três (3) de Aeromonas isoladas e caracterizadas fenotipicamente, foram resistotipadas pelo método da difusão dos discos em agar. Os resultados mostraram que 47% das cepas foram multiresistentes à ampicilina e amicacina. Essas espécies foram analisadas pela técnica de Birnboim and Doly e 27% delas apresentaram plasmídeos, cujo peso molecular variou entre <6,9Kb e 23Kb. A maioria dos plasmídeos isolado apresentou peso molecular <6,9Kb, sugerindo uma identidade de interesse ecológico e/ou epidemiológico das bactérias portadoras desses plasmídeos e a resistência à ampicilina e amicacina.
71
26º Congresso Brasileiro de Microbiologia - 2011 Resumo:605-1
Poster (Painel) 605-1
Multirresistência em espécies dos gêneros Vibrio e Aeromonas, isolados de camarão (Litopenaeus vannamei) comercializados na cidade de Natal, Rio Grande do Norte, Brasil.
Autores: Ligia Maria Rodrigues de Melo (UNP - Universidade Potiguar Natal) ; Dulce Almeida (UFRN - Universidade Federal do Rio Grande do Norte) ; Ernesto Hofer (FIOCRUZ - Fundação Instituto Oswaldo Cruz) ; Oscarina Viana Sousa (LABOMAR - Universidade Federal do Ceará – Instituto de Ciências do Mar) ; Raissa Maria Chaves Dantas Barretto Godeiro (UNP - Universidade Potiguar Natal) ; Edirsana M. Ribeiro Carvalho (LABOMAR - Universidade Federal do Ceará – Instituto de Ciências do Mar) ; Regine Helena Silva Fernandes Vieira (LABOMAR - Universidade Federal do Ceará – Instituto de Ciências do Mar)
Resumo
A carcinicultura no Brasil se desenvolveu extraordinariamente nas duas ou três últimas décadas, posicionando o país como um dos maiores produtores e exportadores mundiais. Tal incremento decorreu, principalmente, pelas condições ecológicas favoráveis para os criadouros na faixa litorânea da região nordeste.Por outro lado, a rápida expansão do setor gerou a preocupação constante da penetração e propagação de doenças exógenas de origens viral, bacteriana e/ou fúngica. Diante dessa situação cosmopolita os produtores utilizam nos sistemas de cultivo a quimioprofilaxia através do uso de antimicrobianos de variados espectros. O objetivo da presente pesquisa foi avaliar a susceptibilidade antimicrobiana de vibrios e aeromonas isolados de camarão
Litopenaeus vannamei comercializado em Natal-RN. A susceptibilidade antimicrobiana foi testada
com 91 cepas de Vibrio e 11 de Aeromonas isoladas de camarão Litopenaeus vannamei comercializado em Natal-RN. Para os testes de difusão foram utilizados 9 antibióticos: 57,8% dos isolados foram resistentes a ampicilina, 29,4% a amicacina e 21,6% a tetracilina. A multirresistência foi observada em 38,2% dos isolados. O índice MAR variou de 0,28 a 0,42 sugerindo que essas cepas são de risco na transferência e difusão da resistência na cadeia alimentar.Treze (˃50%) de 24 cepas multirresistentes e com resistência intermediária escolhidas aleatoriamente, perderam totalmente a resistência e 7 perderam parcialmente, após a cura plasmidial com Acridina Orange. A transferência de bactérias resistentes a antibióticos usados na terapia humana, através da cadeia alimentar, é uma grande preocupação de saúde pública. Este estudo mostra o risco de transferência de marcos de resistência bacteriana aos seres humanos pelo consumo de produtos da aquicultura. Conclui-se que os camarões marinhos comercializados em Natal-RN estão contaminados com vibrios e aeromonas multirresistentes a antimicrobianos comumente utilizados na terapia humana.
72 8.5 APÊNDICE E - Artigo e convites – A cólera no Estado do Rio Grande do Norte – Brasil – perfil sorológico e de sensibilidade do Vibrio cholerae a diferentes antibióticos.
78 9 REFERÊNCIAS
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