Aplicação da espectrometria de massa à análise de compostos fenólicos

As técnicas de espectrometria de massa modernas ligadas às técnicas de separação por LC são actualmente muito utilizadas para a separação e identificação de polifenóis em extractos vegetais. Os detectores de massa são detectores universais com grande sensibilidade que podem fornecer informação da massa molecular e características estruturais de moléculas complexas. Além disso, as técnicas de LC e MS hifenadas permitem a análise directa dos extractos, obtendo-se bastante informação estrutural a partir de pequenas quantidades de amostra (47, 131).

Muitas vezes os espectros de MS não fornecem toda a informação necessária para estabelecer, sem ambiguidade, a estrutura de um composto desconhecido, sendo necessário recorrer a espectros de massa em série (Tandem MS/MS ou MSn) para obter informação mais detalhada (47, 72). A espectrometria de massa em série compreende a selecção e isolamento de iões num intervalo apertado de massa/carga (ião precursor), a dissociação por colisão dos iões seleccionados ou isolados, e a análise de massa dos iões produto obtidos (138).

Os sistemas cromatografia líquida com detectores de massa são constituídos por 4 partes fundamentais, como se indica na Figura 18: o cromatógrafo, uma fonte de ionização dos compostos previamente separados, um detector de massa e um sistema de recolha de dados. LC •Colunas •Eluentes •ESI •APCI •APPI Ionização Detector/ Recolha de Dados •Ion-Traps •Quadrupolos Triplos •Híbridos Analisador de Massa LC •Colunas •Eluentes •ESI •APCI •APPI Ionização Detector/ Recolha de Dados •Ion-Traps •Quadrupolos Triplos •Híbridos Analisador de Massa

Figura 18. Esquema de um equipamento de LC-MS

Como a cromatografia líquida e os espectrometros de massa têm diferentes condições de operação é necessário utilizar interfaces na ligação destes equipamentos. A LC funciona com caudais de eluente elevados, pressões elevadas e

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53 temperaturas da fase líquida próximas da temperatura ambiente; pelo contrário, a MS usa caudais baixos, vácuo elevado e fases gasosas com temperaturas elevadas (136).

A base da espectrometria de massa é a produção de iões que são separados ou filtrados de acordo com a sua razão massa (m) / carga (z) e depois detectados (136). A interface LC-MS deve permitir a ionização do analito e vaporização do eluato, remoção do excesso de vapor e extracção dos iões para o detector de massa.

Um dos traços característicos da MS reside na utilização de diferentes princípios físicos, quer para a ionização da amostra quer para a separação dos iões gerados (72). Os flavonóides são compostos polares, não voláteis e termicamente lábeis, o que dificultou a aplicação directa das primeiras técnicas de ionização usadas em MS, como o impacto electrónico (EI) ou a ionização química (CI). Estes métodos requerem que o analito esteja na fase gasosa para ser ionizado, o que obriga à derivatização dos grupos hidroxilo (metilação, trimetilsililação, e acetilação), sendo a informação estrutural obtida para os heterósidos derivatizados muito limitada (72). Mais recentemente surgiram os métodos de ionização à pressão atmosférica (API) particularmente adequados para os sistemas combinados de LC e MS. Nas técnicas de ionização à pressão atmosférica inclui-se a ionização por electrospray (ESI), a ionização química à pressão atmosférica (APCI), a foto-ionização à pressão atmosférica (APPI) e ainda combinações de dois tipos de fontes (ESI/APCI, APCI/APPI). A ionização por ESI é mais adequada para a análise de compostos térmicamente instáveis com maiores polaridades e pesos moleculares. Pelo contrário, a ionização por APCI ou por APPI é mais adequada para a análise de compostos de menor peso molecular e menor polaridade. Particularmente a ionização por ESI apresenta boa sensibilidade para a análise estrutural dos heterósidos flavonóidicos presentes nos extractos de plantas, sendo por isso uma das técnicas mais utilizadas (72, 132, 136).

A ionização por ESI consegue-se aplicando um potencial elevado a um capilar muito estreito por onde flui o eluente o que origina um nevoeiro de gotículas carregadas. Os iões são pré-formados na solução, ocorrendo depois a dessolvatação e fissão das gotículas, essencial para a formação de iões na fase gasosa. Os iões são depois filtrados para o analisador de massa (72, 136).

A ESI é considerada uma técnica de ionização suave, não produzindo muitos fragmentos, o que nem sempre permite uma boa elucidação da estrutura do composto (136). Esta técnica pode ser usada em modo ião negativo (NI) ou ião positivo (PI). O modo NI é bastante usado porque os iões fenolato formados são bastante estáveis, obtendo-se boas sensibilidades. No modo positivo, o ruído é relativamente alto, o que impede a detecção de alguns compostos. Comparativamente, o modo negativo é

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menos afectado por sinais de impurezas interferentes ou ruído de fundo (47, 132). Além disso, os flavonóides originam um sinal baixo em modo positivo, provavelmente por não terem átomos de azoto, apresentam uma baixa basicidade na fase líquida, não se formando facilmente catiões.

A ionização por electrospray requer a utilização de caudais de eluente baixos (até 100 µl/min) para obter a formação de gotículas de tamanho reduzido. Isto obriga à partição (splitting) do caudal, permitindo a utilização simultânea de outros detectores como o UV-vis (72). A junção de espectros de UV-vis com os espectros de massa de primeira ordem obtidos com ESI fornece muita informação estrutural e permite a caracterização rápida de flavonóides, mesmo quando não existem compostos de referência ou estes são difíceis de obter (45).

Os iões formados na interface da LC podem ser analisados com espectrómetros de massa diferentes. Actualmente, os analisadores de massa mais utilizados em LC-ESI-MS são o “Ion trap”, o triplo quadrupolo e sistemas híbridos. Num instrumento com armadilha de iões (ion trap) seleccionam-se os iões gerados na fonte que são posteriormente dissociados por colisão induzida (collision induced decomposition, CID MS/MS) separados e detectados. Estes passos ocorrem sequencialmente no tempo, mas no mesmo espaço, sendo possível determinar as relações ião precursor-ião produto, o que não acontece com o triplo quadrupolo (132). A combinação da LC com ESI e Ion trap apresenta boa sensibilidade e especificidade e permite obter uma boa resolução de massas num amplo intervalo de massa (138).